藤黃健骨丸調(diào)控BMP-2/Smad 信號通路治療絕經(jīng)后骨質疏松癥

張文靜，王雨辰，段 瑤，顧晶業(yè)，律廣富，皮子鳳，林 喆

（長春中醫(yī)藥大學，長春 130117）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）屬于一種全身性骨代謝疾病，發(fā)病過程中，骨穩(wěn)態(tài)平衡遭到破壞，引致骨骼承重能力減弱，加大脆性骨折的風險[1]。絕經(jīng)后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種重要的亞型，尤其發(fā)生于絕經(jīng)后婦女。其主要病因是由于卵巢功能下降和雌激素分泌減少而導致的骨組織結構改變，增加了骨折的風險[2-3]。由于發(fā)病隱秘，未能得到充分的重視，嚴重降低了絕經(jīng)后女性的身體水平。據(jù)預測，由于骨質疏松癥引發(fā)的骨折問題，醫(yī)療費用在2050 年可能將高達1 630 億元[4]。

藤黃健骨丸[5]來源于國醫(yī)大師劉柏齡多年臨床經(jīng)驗所制成的中藥復方制劑。全方配伍由7 味中藥材組成，熟地黃為君藥，臣藥用肉蓯蓉、淫羊藿、骨碎補、鹿銜草，具有補腎陽、增強精血、滋養(yǎng)腎臟、祛除風濕、增強筋骨等功能。加以雞血藤，能補血、活血，調(diào)通人體經(jīng)絡，增強筋骨。萊菔子，可以幫助調(diào)理氣血，使得所有的藥材能更好的發(fā)揮效用，這款中藥復方被廣泛用于治療各種骨科疾病。

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是骨組織中重要的生長因子。研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2 在骨形成中發(fā)揮著重要作用[6-7]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2）BMP-2/Smad 通路是能夠維持骨穩(wěn)態(tài)的重要信號通路，當Smad 信號被激活時，骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，減少破骨細胞活性，從而減少骨質疏松癥的發(fā)生[8-10]。但藤黃健骨丸通過BMP-2/Smad 信號通路治療骨質疏松癥缺乏深入研究。

因此，本實驗研究采用摘除大鼠雙側卵巢模型模擬臨床絕經(jīng)后骨質疏松癥，考察藤黃健骨丸對絕經(jīng)后骨質疏松的影響，并基于BMP-2/Smad 信號通路探究其分子機制，為該藥的深入研究提供新依據(jù)，為臨床應用提供新思路。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 藤黃健骨丸（批號：2022100522039，長春人民藥業(yè)集團有限公司）；仙靈骨葆膠囊[批號：國藥準字Z20025337，國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司]；戊巴比妥鈉（批號：86-01-22，上海化學試劑采購供應站分裝廠）；青霉素（批號：210202，獸藥字，華北制藥集團動物保健品有限責任公司）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）、二甲苯（國藥集團化學試劑有限公司）、Von-Kossa 染液套裝（B1013，百仟度）、鹽酸（國藥集團化學試劑有限公司）、氨水（國藥集團化學試劑有限公司）、中性樹膠（10004160，武漢百仟度生物科技有限公司）、分化液（B1005-3，百仟度）、返藍液（B1005-4，百仟度）。RIPA 裂解緩沖液（P0013B，碧云天生物技術有限公司）；Smad1 抗體，BMP-2 抗體、Runx2 抗體、抗鼠抗體、抗兔抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）。

1.2 實驗動物 1.5 月齡雌性SD 大鼠72 只，體質量（200±10）g。所有大鼠均購于遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2020-0001。動物飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 屏障級動物室內(nèi)。

1.3 實驗儀器 小動物骨骼強度測定儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司），脫水機（JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司），包埋機（JB-P5，武漢俊杰電子有限公司），病理切片機（RM2016，上海徠卡儀器有限公司），正置光學顯微鏡（NIKON ECLIPSE C，尼康，日本），成像系統(tǒng)（NIKON DS-U3，尼康，日本），多功能化學發(fā)光成像系統(tǒng)（uvitec，17200497，法國）。

2 實驗方法

2.1 實驗造模方法 除了假手術組，其余各組大鼠以0.5% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠被安置在手術臺上，使其四肢固定，接著進行皮膚的預處理，對手術區(qū)的皮膚進行消毒。在大鼠背部中線位置，作一1.5 ～2 cm 的縱形切口，可見到奶白色的組織以及粉紅色的“菜花狀”卵巢，隨后采用分離鉗進行夾緊，進行卵巢的結扎以及切除，然后逐層對皮膚進行縫合并消毒。假手術組大鼠切除等同于卵巢重量的周圍脂肪。大鼠術后給予口服青霉素混懸液，術后注意保溫[11-12]。

2.2 動物分組及給藥 將大鼠隨機分為6 組，每組12只。分別為假手術組（SHAM）、模型組（OVX）、仙靈骨葆膠囊組（XLGB）、藤黃健骨丸低劑量組（THJGW-L）、藤黃健骨丸中劑量組（THJGW-M）及藤黃健骨丸高劑量組（THJGW-H）。

從造模手術后第3 天開始，按照人與大鼠表面積換算藥物等效劑量，藤黃健骨丸粉末進行用水溶解制成混懸液灌胃，低、中、高劑量組給藥劑量分別為0.15 g/kg/d、0.3 g /kg/d、0.6 g /kg/d；假手術組和模型組大鼠以等體積生理鹽水灌胃；仙靈骨葆膠囊和藤黃健骨丸均為復方中藥，因其在臨床上已經(jīng)被廣泛用于治療骨質疏松癥，且治療有效、安全[13-15]。陽性組采用其水溶液灌胃給藥，給藥劑量為0.10 g/kg/d。每日灌胃1 次，連續(xù)8 周。每周稱量記錄1 次大鼠體質量。

2.3 取材 8 周后，麻醉安樂死處理，在無菌的環(huán)境中提取大鼠的子宮和腎臟，并量取其重量。切割大鼠雙側的股骨并剝離肌肉，之后測量大鼠右側股骨的骨骼強度。對大鼠左側股骨，用4%多聚甲醛固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋切片，進行病理染色分析。

2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot） 取大約80 mg的大鼠骨髓組織，經(jīng)液氮冷凍后進行研磨處理。按照骨組織蛋白提取試劑盒的使用指南，提取蛋白，并運用BCA 方法測量蛋白質的含量。蛋白上樣量為20 μg，進行10% SDS-PAGE 電泳分離，并轉移到PVDF 膜上。轉膜1 h 后，用奶粉封閉2 h。封閉結束后使用TBST緩沖液進行3 次洗膜。加入GAPDH（1:5 000），BMP-2（1:2 000），Smad1（1:2 000），Runx2（1:1 000）一抗，4℃孵育過夜，加入二抗（1:3 000）室溫孵育3 h，再用TBST 緩沖液清洗3 次。顯色，以GAPDH 作為內(nèi)參，使用Image-J 軟件對所有電泳條帶的灰度值進行分析。

2.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行評估，并將所有的結果用均數(shù)±標準差（±s）表示。利用單因素方差分析組內(nèi)數(shù)據(jù)差異。確定統(tǒng)計顯著性的標準設為P＜0.05。

3 實驗結果

3.1 絕經(jīng)后骨質疏松大鼠模型體質量變化 大鼠術后的體質量變化，如圖1。對大鼠進行去卵巢手術后，大鼠體質量明顯降低，藤黃健骨丸給藥后，體質量恢復至正常。

圖1 各組大鼠8 周體質量變化

3.2 絕經(jīng)后骨質疏松大鼠子宮及腎臟指標 測定大鼠的子宮和左右腎重量，結果見表1。在對比假手術組的情況下，模型組的大鼠子宮和腎臟重量顯然減少（P＜0.05），具有顯著性差異；相較于模型組，藤黃健骨丸高劑量組和仙靈骨葆膠囊組都能有效的增強大鼠的腎臟重量，同時對子宮重量也展現(xiàn)出提升的趨勢，然而它們和模型組之間的差別并不顯著（P＞0.05）。

表1 藤黃健骨丸對模型大鼠子宮和腎臟重量的影響（± s，n = 12） g

表1 藤黃健骨丸對模型大鼠子宮和腎臟重量的影響（± s，n = 12） g

注：與假手術組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 子宮 右腎SHAM 1.15±0.06△ 1.00±0.08△OVX 0.74±0.06## 0.89±0.07##THJGW-L 0.76±0.04 0.96±0.11 THJGW-M 0.87±0.03△ 0.96±0.09 THJGW-H 0.92±0.05△ 0.97±0.12##XLGB 1.04±0.03△ 0.97±0.10##

3.3 絕經(jīng)后骨質疏松大鼠骨強度值 將大鼠右側股骨放入小動物骨骼強度測定儀，依據(jù)骨頭被壓斷的最高負荷壓力來測試骨骼的強度，具體的測量結果如圖2所示。

圖2 各組大鼠右側股骨骨強度值

3.4 VonKossa 染色 VonKossa 鈣鹽染色染色結果可以看出（如圖3），假手術組可見鈣離子大量沉積，骨組織結構完整，骨小梁排列規(guī)律，結構緊密；模型組，可見大量脂肪細胞，鈣離子沉淀減少，骨髓細胞數(shù)量大量減少；藤黃健骨丸治療后骨結構有所改善，骨細胞增多，鈣離子沉積增多，骨細胞增多，脂肪細胞減少。

圖3 各組大鼠左側股骨組織形態(tài)結構（VonKossa 染色，×200，黑色箭頭-鈣離子沉積；紅色箭頭-脂肪細胞；黃色箭頭-骨細胞）

3.5 Western Blot 實驗結果 與假手術組比較，模型組Runx2、BMP-2 及Smad1 蛋白表達顯著降（△P＜0.05，△△P＜0.01），表明去卵巢手術可以顯著降低骨組織中Runx2、BMP-2 及Smad1 的蛋白含量；與模型組比較，藤黃健骨丸高劑量組和仙靈骨葆膠囊組均明顯上調(diào)Runx2、BMP-2 及Smad1 蛋白的表達（#P＜0.01，##P＜0.01），藤黃健骨丸可以改善骨丟失，促進成骨形成。見表2，如圖4。4 討論

表2 藤黃健骨丸對模型大鼠骨組織Runx2、Smad1、BMP-2蛋白表達的影響（± s，n = 3）

表2 藤黃健骨丸對模型大鼠骨組織Runx2、Smad1、BMP-2蛋白表達的影響（± s，n = 3）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 Runx2/GAPDH Smad1/GAPDH BMP-2/GAPDH SHAM 0.64±0.11 0.58±0.05 0.76±0.10 OVX 0.31±0.12## 0.32±0.04## 0.32±0.11#THJGW-L 0.36±0.05 0.32±0.10## 0.54±0.03△△THJGW-M 0.56±0.09△△ 0.42±0.01 0.63±0.03 THJGW-H 0.67±0.08△ 0.50±0.06△ 0.72±0.06△XLGB 0.68±0.06△ 0.54±0.03△ 0.78±0.11△

圖4 各組大鼠骨組織中Runx2、Smad1、BMP-2 蛋白表達電泳

中醫(yī)學將骨質疏松癥歸于“骨痿”“骨極”“骨枯”等范疇[16]?！端貑枴ゐ粽撈方庾x“由腎系主導的骨質和髓液，如果腎氣過度增熱，會引發(fā)腰背部無法保持挺直，使骨質干燥，髓液減少，這便構成了骨痿的病象”。與此同時，《金匱要略·中風歷節(jié)病》中的描述是：“過量攝入咸味食物會對骨質構成破壞，骨質的損害之后會產(chǎn)生肌無力，這個病狀被稱作枯病?！薄端貑枴の宀厣伞氛撌觯骸澳I具有調(diào)節(jié)骨髓生成的能力，腎中的精力充沛時，骨髓就能正常生化，骨骼也會變得強壯。但是，若腎氣消耗過大，骨髓就會失去補充?！币虼耍^經(jīng)后骨質疏松與骨痿等骨疾病的病因和病理有許多相似之處。中醫(yī)認為，該病病變在骨，其本在腎。腎是維護骨髓生長和骨質健康的關鍵器官，只有髓液充盈，骨骼才能保持健康。同樣的，腎也是身體的精力儲備，只有充足的精力，才能使髓液滋潤骨骼，幫助骨骼得到營養(yǎng)。

目前臨床上治療絕經(jīng)后骨質疏松癥的藥物[17-19]主要有幾大類，分別是雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)整劑、雷洛昔芬、雙膦酸鹽以及地諾單抗等。雌激素主要包括雌二醇和雌酮，在女性進入更年期以后，雌激素的產(chǎn)生能力會開始下降，這時候患者的骨密度也會明顯降低。根據(jù)臨床實驗結果，雌激素治療顯著減少骨折的發(fā)生率[20]，因此它展現(xiàn)了治療骨質疏松的效果。經(jīng)過隨機實驗，已經(jīng)驗證口服或者靜脈注射雙膦酸鹽可以降低骨折的概率[21-23]。但是會出現(xiàn)惡心、嘔吐，甚至腎功能損害等不良反應[24]。地諾單抗是第一種獲得許可，專門用于治療骨質疏松癥的生物藥。它和雙膦酸鹽不同，其對腎機功能降低的女性更為合適。另一方面，特立帕肽是通過人工合成的重組人甲狀旁腺激素氨基酸末端1-34 活性片段，其主力作用是促進骨質生成，然而可能導致出現(xiàn)肌骨系統(tǒng)損傷、代謝和營養(yǎng)問題以及皮膚和皮膚附件損壞等副作用[25]?；钚跃S他命D 目前在臨床上是治療骨質疏松癥的基礎藥物。它不僅能減少更年期和老年骨質疏松癥的骨折風險，也對類固醇性骨質疏松病有療效[26]。

西醫(yī)治療骨質疏松癥多數(shù)會引發(fā)其他疾病，中藥資源豐富，藥效安全。在治療骨質疏松的過程中，中醫(yī)學常針對其病源和病理進行調(diào)整和改善，主要是通過益肝和補腎，以及配合活血藥用于治療由血液瘀積引發(fā)的疼痛。藤黃健骨丸是一種中成藥，其主要成分包括熟地黃、鹿銜草、骨碎補（燙）、肉蓯蓉、淫羊藿、雞血藤等。肉蓯蓉可以溫補腎陽，通經(jīng)絡，強筋骨；而熟地黃有助于益精填髓，活化血液，消除瘀血；萊菔子可以調(diào)節(jié)氣血和健骨，同時也防止滋膩過度；雞血藤有如活血行氣、滋陰養(yǎng)腎的效果；淫羊藿能去除風濕，補肝和腎；骨碎補有益于腎陽，健骨，緩解疼痛。復方涵蓋7 種藥材，其中6 種都是歸類于腎經(jīng)。根據(jù)中醫(yī)學的觀念，“腎主骨生髓”，這些藥材可以共同發(fā)揮效力，從根本上幫助治療骨質疏松等骨科疾病。除了能夠以腎虛血瘀為原理來緩解四肢疼痛和抑制骨頭的吸收，還可以增進成骨細胞的生長，促進骨頭的重塑，減少破骨細胞的活性，提高血中鈣的含量。此外，它還可以降低血液的黏稠度，阻止血小板的集結，提升骨質密度[27]。

據(jù)研究顯示，張林等[28]所研究的對于藤黃健骨膠囊治療骨質疏松癥（腎虛血瘀型）的療效評價，指出此藥物能有效緩解病患的病癥，推動骨密度和骨質的新陳代謝，因此，病患的生活品質大幅提升，具有較高的臨床應用價值。另外，單梅花等[29]亦在以藤黃健骨膠囊對64 位高齡、患有腎虛血瘀型骨質疏松癥的病患進行實驗時，發(fā)現(xiàn)該藥品的顯著治療效果，能大幅減緩病患的病癥。

本實驗采用的去除卵巢方法來建立的骨質疏松模型是目前最廣泛被用來模擬女性絕經(jīng)后骨質疏松的動物模型[30]。通過這個模型，進行大鼠雙側卵巢切除手術，使其體內(nèi)雌激素含量降低，骨質代謝速度加快，骨密度大幅度減少，有效地呈現(xiàn)出女性絕經(jīng)后由于雌激素水平下滑，骨密度降低，骨骼生長與吸收不平衡所產(chǎn)生的骨質疏松病癥[31]。本研究結果表明，去卵巢手術可顯著降低大鼠體質量、子宮重量及腎臟質量。藤黃健骨丸干預后，能明顯增加大鼠的子宮和腎臟重量。提示藤黃健骨丸從腎源出發(fā)，強腎生髓，改善骨質疏松癥。骨強度表明藤黃健骨丸能夠顯著提升去卵巢大鼠的股骨強度，提高荷載能力，對骨質疏松有較好的治療作用。VonKossa 染色提示藤黃健骨丸可以明顯改善去卵巢大鼠的病理形態(tài)，增加骨中鈣離子的沉積，減少脂肪細胞的生成，改善骨小梁結構。

BMP-2/Smad 信號通路影響成骨分化，對骨穩(wěn)態(tài)的平衡起到關鍵作用的信號通路[32]。BMP-2 可以與細胞膜受體結合，上調(diào)轉錄因子Runx2 的蛋白表達，促進成骨的分化[33]。Runx2能夠影響骨髓細胞的分化過程，對骨的生成扮演重大角色。本次研究表明，相較于假手術組，模型組大鼠的Runx2 、BMP-2 和Smad1 等蛋白水平降低；當藤黃健骨丸以不同劑量治療后，與模型組對比，這些對骨生成有影響的蛋白水平在不同程度上升高，這揭示了藤黃健骨丸可通過調(diào)控和骨生成相關的蛋白來影響絕經(jīng)后骨質疏松癥，其作用機制可能通過BMP-2/Smad 信號通路來促進骨生成。

5 結論

藤黃健骨丸具有補充腎精、活化骨髓的功效，對疾病的治療從根本上出發(fā)，使其在臨床應用中更加安全、健康。其研究成果也為藤黃健骨丸在臨床上治療骨質疏松提供了新的理論支持和實驗依據(jù)。