高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法快速篩查動(dòng)物源性藥食同源產(chǎn)品中32 種抗生素獸藥殘留

周雪莼，胡婷婷，王佳慧，白 靜，楊 穎，侯 宇，張 哲*，張 勛*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春海關(guān)技術(shù)中心，長(zhǎng)春 130062；3.吉林省吉測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司，長(zhǎng)春 130117）

“藥食同源”產(chǎn)品是以國(guó)家頒布的藥食同源目錄生產(chǎn)的保健食品[1-2]，介于保健品與藥品之間，既有藥品的治療又有食品的安全穩(wěn)定性[3-5]。吉林省動(dòng)物源性藥食同源特色產(chǎn)品包括：鹿胎膏、蜂蜜、鹿茸等產(chǎn)品。近年，“藥食同源”產(chǎn)品的需求日益增多，但這些產(chǎn)品很多在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸過(guò)程中抗生素類(lèi)獸藥殘留嚴(yán)重[6-7]，這對(duì)食用這些產(chǎn)品的人們健康造成巨大危害[8-11]，并且缺乏可靠的快速檢測(cè)技術(shù)手段。建立一種獸藥抗生素藥物殘留的分析方法是非常必要的。

目前，動(dòng)物源性藥食同源產(chǎn)品中殘留抗生素類(lèi)獸藥常用的檢測(cè)技術(shù)主要有微生物抑制檢測(cè)法[12]、免疫分析法[13-14]、高效液相色譜法[15]、傳感器檢測(cè)法[16]、薄層色譜法[17]、近紅外光譜法[18]、液相色譜-質(zhì)譜法等[19-22]。但是上述方法依然存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、假陽(yáng)性率高等問(wèn)題，限制了其在快速檢測(cè)中的發(fā)展和應(yīng)用[23-26]，高分辨質(zhì)譜具備靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)速度快及假陽(yáng)性率低等特點(diǎn)[27-29]，彌補(bǔ)了上述方法的劣勢(shì)，填補(bǔ)了動(dòng)物源性藥食同源產(chǎn)品中抗生素類(lèi)獸藥快速篩查數(shù)據(jù)庫(kù)的空白，尤其在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下能同時(shí)對(duì)大量樣品中的多種或多類(lèi)別待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行高通量非靶向篩查確證，為動(dòng)物源性藥食同源產(chǎn)品中抗生素類(lèi)獸藥的快速篩查提供了新方法。本研究選取了吉林省生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)過(guò)程中使用頻率較高的β-內(nèi)酰胺類(lèi)、林可酰胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)、硝基咪唑類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)、氯霉素類(lèi)7 類(lèi)共32 種抗生素獸藥進(jìn)行研究，并建立了對(duì)具有吉林省特色的鹿胎膏、蜂蜜和鹿茸樣品基質(zhì)為代表的動(dòng)物源性藥食同源特色產(chǎn)品32 種抗生素類(lèi)獸藥殘留的快速前處理技術(shù)、基于高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法高效篩查庫(kù)，在缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的條件下，快速準(zhǔn)確篩查抗生素類(lèi)獸藥殘留，為動(dòng)物源性藥食同源產(chǎn)品的質(zhì)量控制和監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑 Dionex Ultimate 3 000 RSLC-Q-Exactive型靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）、Hypersile Gold C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）、Trace Finder 2.5 軟件系統(tǒng)；Syncore 型天平（0.01 g，瑞士Precisa 公司）；TurboVap II 型氮?dú)鉂饪s儀（美國(guó)Organomation公司）；AS10200-10L型超聲波清洗器（天津，奧特賽恩斯儀器有限公司）；Allegra X-22R 型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter 公司）。

鹿茸、鹿胎膏和蜂蜜均來(lái)自于長(zhǎng)春海關(guān)技術(shù)中心的待檢測(cè)樣品。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨（質(zhì)譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；PRiME HLB 固相萃取柱（美國(guó)Waters 公司）； 氨芐青霉素、頭孢噻肟、頭孢噻呋、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢匹林、林可霉素、克林霉素、紅霉素、交沙霉素、螺旋霉素、甲硝唑、氟甲喹、萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、洛美沙星、麻保沙星、丹諾沙星、雙氟沙星、依諾沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、苯甲?；前?、磺胺醋酰、磺胺氯噠嗪、磺胺嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、氟苯尼考32 種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥95%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司）。實(shí)驗(yàn)用水為Millipore 系統(tǒng)制造的高純水（≥18 MΩ·cm）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置 用甲醇對(duì)32 種抗生素獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)渲脻舛葹?0 ug/mL、20 ug/mL、100 ug/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光保存。作為建立標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)及方法學(xué)考察的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品的制備與保存 鹿茸：將樣品（不少于200 g）置于高速粉碎機(jī)中研磨粉碎后過(guò)80 目篩，混合均勻后標(biāo)記，置于常溫下密封保存。蜂蜜和鹿胎膏：置于常溫下密封保存。

1.4 樣品的前處理

1.4.1 樣品的提取 選用不同比例的乙腈-水和甲醇-水混合溶液對(duì)樣品進(jìn)行提取，每組設(shè)定3個(gè)平行試驗(yàn)，其提取步驟如下：用天平分別準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)樣品2.00 g，加入1 mL 純水浸潤(rùn)樣品（蜂蜜、鹿胎膏用溫水?dāng)嚢柚镣耆_(kāi)），分別加入10 mL 乙腈、75%乙腈-水、60%乙腈-水、45%乙腈-水、30%乙腈-水溶液、甲醇、75%甲醇-水、45%甲醇-水溶液后，旋渦震蕩1 min，超聲波清洗器萃取20 min，10 000 r/min 離心5 min 后，待凈化。

1.4.2 樣品的萃取 設(shè)定不同超聲萃取時(shí)間對(duì)樣品進(jìn)行萃取，每組設(shè)定3 個(gè)平行試驗(yàn)，步驟如下：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g 鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜樣品，分別向其中添加0.01 mg/kg 的32 種獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4 方法處理，并分別超聲提取5、10、20、30、40 min。

1.4.3 樣品的凈化 取超聲后上清液直接加載到PRiME HLB 固相萃取柱（60 mg，3 mL 或相當(dāng)者）上，無(wú)需活化和平衡，保持每秒1 滴的流速，收集全部流出液。取5.00 mL 流出液氮吹至體積小于0.5 mL，氮吹期間溫度為40℃，將得到的液體用10%甲醇水溶液定容至1.00 mL，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜（尼龍）后用于分析測(cè)定。

1.5 HPLC-MS 條件

1.5.1 色譜條件 采用Hypersile Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）； 流動(dòng)相：水相（A）為含5 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸水溶液；有機(jī)相（B）為甲醇，其中進(jìn)樣體積為10 μL，流速為0.3 mL/min，柱溫為30℃。色譜流動(dòng)相的洗脫梯度表，見(jiàn)表1。

表1 色譜流動(dòng)相的洗脫梯度表

1.5.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜的離子源參數(shù)： 噴霧電壓（+）為3 200 V，離子傳輸管溫度為325℃，鞘氣為40 arb，輔助氣為10 arb，探針加熱器溫度為350℃，S-透鏡射頻水平為60 V。質(zhì)譜掃描參數(shù)： 掃描模式為Full MS-ddMS2，全掃描范圍為80 ～1 000 m/z，分辨率為70 000，F(xiàn)ull MS，17 500，MS/MS，自動(dòng)增益控制為1e6，F(xiàn)ull MS，2e5，MS/MS，循環(huán)次數(shù)： 6，MSX 計(jì)數(shù)：1，隔離寬度為2.0 m/z，碰撞能量分別為20、40、60 V，壓縮比率為1%，頂點(diǎn)觸發(fā)為2 ～6 s，動(dòng)態(tài)排除為8 s。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)分析數(shù)據(jù)庫(kù)篩查設(shè)置 采用高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道肼高分辨質(zhì)譜對(duì)配制的32 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液（1 mg/L）在Full MS-ddMS2Scan 模式下對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，通過(guò)高分辨質(zhì)譜獲得32 種化合物的分子量、保留時(shí)間、碎片離子等信息建立一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)。采用Trace Finder 2.5數(shù)據(jù)庫(kù)篩查方法，設(shè)置方法：1）加載數(shù)據(jù)庫(kù)（含32 個(gè)化合物，包含化合物名稱(chēng)、分子式、分子量、保留時(shí)間、碎片離子等信息）。Method Development →Compound Database →打開(kāi)“pesticides database”；2）加載篩查方法：Method Development →Method View →打開(kāi)“pesticides screening”；3）在篩查方法pesticides screening 中勾選數(shù)據(jù)庫(kù)pesticides database，保存，建立batch，分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)其母離子強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值（1×106）時(shí)，自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜掃描，同時(shí)得到母離子的精確質(zhì)量數(shù)以及二級(jí)質(zhì)譜的全掃描信息。采用20 eV、40 eV、60 eV 三個(gè)碰撞能量對(duì)化合物進(jìn)行碎裂，得到一張碎片離子信息豐富的加和圖。由于化合物峰形較窄，為避免出現(xiàn)二級(jí)離子打不到的情況，根據(jù)峰寬肩動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為3 s。獲得二級(jí)譜圖后利用軟件計(jì)算碎片離子的分子量，與相應(yīng)抗生素類(lèi)獸藥的相關(guān)信息關(guān)聯(lián)，最終完成32 種抗生素類(lèi)獸藥的色譜庫(kù)和質(zhì)譜圖的譜庫(kù)構(gòu)建。

1.7 實(shí)際樣品的篩查測(cè)定 參考?xì)W盟評(píng)分制方法指南篩查樣品中目標(biāo)物質(zhì)是否存在，同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證。準(zhǔn)確稱(chēng)量鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜3 種樣品，分別作為空白陰性樣品（不含有待測(cè)目標(biāo)化合物）10 份、陽(yáng)性添加樣品各20 份（對(duì)鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜樣品添加上述32種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，添加濃度為0.01 mg/kg），按照實(shí)驗(yàn)方法篩查待測(cè)的32 種抗生素獸藥。假陽(yáng)性率（%）、假陰性率（%）按照下面公式。1）假陽(yáng)性率=（獲得篩查陽(yáng)性結(jié)果的陰性樣品數(shù)/陰性樣品總數(shù)）×100%；2）假陰性率=（獲得篩查陰性結(jié)果的陽(yáng)性樣品數(shù)/陽(yáng)性樣品總數(shù)）×100%。

依據(jù)歐盟SANTE 11813/2017 法規(guī)要求，對(duì)目標(biāo)物樣品進(jìn)行一級(jí)全掃描，根據(jù)所建立的譜庫(kù)數(shù)據(jù)定性分析依據(jù)保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)和一個(gè)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)（或兩個(gè)母離子精確質(zhì)量數(shù)）。在相同條件下，樣液中待測(cè)化合物保留時(shí)間與譜庫(kù)中保留時(shí)間的相對(duì)偏差≤±2.5%（且不超過(guò)0.5 min）或≤0.2 min，所監(jiān)測(cè)定性離子的信噪比S/N ≥3，母離子精確質(zhì)量數(shù)與理論質(zhì)量數(shù)的相對(duì)偏差≤5 ppm（1×10-6），一個(gè)二級(jí)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)的相對(duì)偏差≤10 ppm，則可以初步判斷實(shí)驗(yàn)中含有該種化合物。在空白樣品中添加篩查濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為質(zhì)控樣品。樣品中目標(biāo)化合物檢測(cè)濃度大于等于方法篩查限時(shí)判定為陽(yáng)性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇 本研究分別對(duì)不同比例的乙腈-水和甲醇-水混合溶液進(jìn)行了考察，使用甲醇為提取溶劑時(shí)，提取率不高僅為46%～58%，且提取液中含有較多雜質(zhì)，用乙腈及乙腈-水混合溶液作為提取溶劑時(shí)，一方面能保證較高的待測(cè)物提取率，另一方面，乙腈極性大、穿透力強(qiáng)，可有效沉淀樣品中的大量蛋白質(zhì)及其他非極性磷脂類(lèi)干擾物，盡可能地減少在測(cè)定過(guò)程中的基質(zhì)干擾，故最終選用乙腈作為提取溶劑。隨即對(duì)比100%乙腈、75%乙腈-水、60%乙腈-水、45%乙腈-水、30%乙腈-水溶液的提取效果，結(jié)果表明，使用75%乙腈-水、60%乙腈-水、45%乙腈-水、30%乙腈-水為提取溶劑時(shí)，提取率范圍約為54%～66%、46%～52%、35%～43%、26%～32.5%。并且隨著體系中水的占比不斷升高時(shí)，溶液在濃縮步驟處于比較難于懸至近干的狀態(tài)。當(dāng)用100%乙腈進(jìn)行提取時(shí)，待測(cè)物的提取率范圍為77%～84%，提取液較澄清且得到的色譜圖中未知物的雜峰數(shù)量有所減小，基本不影響32種待測(cè)物的檢測(cè)，故最終選用100%乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 超聲時(shí)間的選擇 超聲波具有極端的物理特性，其機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)等能夠?qū)ξ镔|(zhì)能產(chǎn)生很強(qiáng)的破壞作用，能促使細(xì)胞組織破壁變形[30]，可有效提高提取效率。因此，本研究比較了超聲處理5、10、20、30、40 min 的提取效率。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜，分別向其中添加0.01 mg/kg水平的32 種獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4 方法處理，并分別超聲提取5、10、20、30 和40 min。結(jié)果顯示，當(dāng)超聲提取5 min、10 min 時(shí)，提取率范圍約為28%～39%和48%～62.5%，當(dāng)超聲提取20 min 時(shí)，32 種獸藥的提取率均能夠達(dá)到最高，提取率范圍約為76%～85%，20 min 后，提取時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)32 種獸藥的提取率的影響已不顯著，當(dāng)超聲提取30 min、40 min時(shí)，提取率范圍約為77%～85%和78%～86.5%，故最終確定超聲提取時(shí)間為20 min。

2.2 HPLC-HRMS 條件的優(yōu)化 本研究比較了2 組不同流動(dòng)相的分離效果：流動(dòng)相A 為純水和含5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為甲醇、乙睛及含5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸的水溶液。結(jié)果表明，在流動(dòng)相中加入5 mmol/L 乙酸銨溶液可以流動(dòng)相能夠保持一定的離子強(qiáng)度，以改善峰形，減少峰拖尾。使用甲醇為流動(dòng)相B 時(shí)，待測(cè)物的響應(yīng)強(qiáng)度更高，峰型更好，而且鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜中基質(zhì)復(fù)雜，甲醇能更好地洗脫，減少污染，延長(zhǎng)了儀器和色譜柱的使用壽命。雖然采用甲醇時(shí)柱壓較乙腈高，但對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)值更高。

2.3 篩查數(shù)據(jù)庫(kù)的建立 配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依據(jù)建立好的色譜條件（1.5.1）和質(zhì)譜條件（1.5.2）進(jìn)樣，準(zhǔn)確輸入32 種抗生素獸藥的英文、CAS 號(hào)、中文名稱(chēng)及化學(xué)式，由高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建軟件Trace Finder 2.5 計(jì)算得到每種化合物的理論質(zhì)量數(shù)。而后在采用數(shù)據(jù)依賴(lài)性二級(jí)質(zhì)譜掃描（ddms2）的同時(shí)使用動(dòng)態(tài)排除模式，當(dāng)列表中的母離子響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值，自動(dòng)采集二級(jí)數(shù)據(jù)；在三個(gè)碰撞能量下（20/40/60eV）對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行碰撞，加和獲得二級(jí)譜圖，利用軟件計(jì)算主要二級(jí)碎片精確分子量，與相應(yīng)化合物的保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)測(cè)定值、中英文名稱(chēng)、CAS 號(hào)、分子式等信息相關(guān)聯(lián)，最終完成32種抗生素類(lèi)獸藥的譜庫(kù)構(gòu)建，見(jiàn)表2。

表2 32 種抗生素類(lèi)獸藥的分子式、保留時(shí)間、母離子和特征碎片離子質(zhì)量

2.4 定性方法 按照歐盟SANTE 11813/2017 法規(guī)，定性分析依據(jù)化合物的保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)和一個(gè)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)（或2個(gè)母離子精確質(zhì)量數(shù)）。在相同條件下，樣液中待測(cè)化合物保留時(shí)間與譜庫(kù)中保留時(shí)間的相對(duì)偏差≤±2.5%（且不超過(guò)0.5 min）或≤0.2 min，所監(jiān)測(cè)定性離子的信噪比S/N ≥3，母離子精確質(zhì)量數(shù)與理論質(zhì)量數(shù)的相對(duì)偏差≤5 ppm（1×10-6），一個(gè)二級(jí)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)的相對(duì)偏差≤10 ppm，則可以初步判斷實(shí)驗(yàn)中含有該種化合物。在空白樣品中添加篩查濃度（0.01 mg/kg）混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液作為質(zhì)控樣品。樣品中目標(biāo)化合物檢測(cè)濃度大于等于方法篩查限時(shí)判定為陽(yáng)性結(jié)果。利用Tract Finder 2.5 軟件對(duì)化合物定性篩查，符合設(shè)定范圍的樣品即為陽(yáng)性樣品。實(shí)驗(yàn)條件相同時(shí)，如果色譜峰的保留時(shí)間與數(shù)據(jù)庫(kù)相對(duì)應(yīng)，扣除背景后的質(zhì)譜圖所選擇的離子及其相對(duì)豐度與數(shù)據(jù)庫(kù)相對(duì)應(yīng)，則可證明樣品中存在這種抗生素類(lèi)獸藥或與之相關(guān)的其他化學(xué)物質(zhì)。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定驗(yàn)證 鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜所有陰性樣品的假陽(yáng)性率均為0，在檢測(cè)鹿胎膏中殘留的喹諾酮類(lèi)藥物環(huán)丙沙星時(shí)，假陰性率為5%。經(jīng)5 家單位技術(shù)人員進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即對(duì)鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜樣品添加上述32 種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液，添加濃度為0.01 mg/kg，經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果表明，上述32 種抗生素獸藥在樣品中均被定性檢出，準(zhǔn)確率為100%。說(shuō)明本方法準(zhǔn)確率高、靈敏度較好，適用于7 類(lèi)共計(jì)32 種抗生素獸藥的同時(shí)快速篩查。

3 小結(jié)

本研究通過(guò)優(yōu)化樣品的前處理方法及色譜和質(zhì)譜條件，建立了同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物源性藥食同源產(chǎn)品（鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜）中32 種抗生素類(lèi)獸藥殘留的快速篩查方法。通過(guò)簡(jiǎn)便的樣品前處理方法，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品即可實(shí)現(xiàn)7 類(lèi)共32 種獸藥殘留的同時(shí)篩查，而且能夠滿(mǎn)足法規(guī)限量要求的靈敏度。假陽(yáng)性率和假陰性率滿(mǎn)足《食用農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)物質(zhì)殘留高通量篩查方法確認(rèn)與檢測(cè)質(zhì)量控制指南》中對(duì)于篩查方法的性能要求，實(shí)際樣品經(jīng)5 家單位的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，準(zhǔn)確率為100%，檢出限為0.01 mg/kg。這使得動(dòng)物源性藥食同源產(chǎn)品的多殘留分析檢測(cè)效率邁向了新的臺(tái)階，對(duì)動(dòng)物源性藥食同源產(chǎn)品的安全質(zhì)量監(jiān)管提供了重要的成熟篩查技術(shù)手段。若想更進(jìn)一步研究動(dòng)物源性藥食同源產(chǎn)品中的獸藥殘留，還需不斷補(bǔ)充獸藥種類(lèi)，進(jìn)而為動(dòng)物源性藥食同源產(chǎn)品的安全保證提供有力支撐。