靈芝孢子多糖作為流感疫苗佐劑的免疫作用研究

陳秀紅，趙丹萍，李欣昱，何 晶，呂瑞琳，張建軍，趙忠鵬，王林元*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，合肥 230032；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

流感是一種危害人類健康的常見傳染性疾病，目前接種疫苗是預(yù)防流感的最有效方式，但目前已批準(zhǔn)的人用流感疫苗，如裂解疫苗等，保護(hù)效果并不是十分理想[1]。佐劑的應(yīng)用將有助于增強(qiáng)流感疫苗的免疫效果。已批準(zhǔn)上市流感疫苗佐劑主要有鋁鹽佐劑、MF59、AS03 及類病毒顆粒等[2]，但存在免疫效果不理想、不良反應(yīng)大、種類少、產(chǎn)率低、造價(jià)高等問題[3]，因此開發(fā)出安全、有效、經(jīng)濟(jì)易得的佐劑是流感疫苗的重要研究方向。

中藥多糖可通過增強(qiáng)體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫促進(jìn)作用，且在動(dòng)物疫苗佐劑中已有應(yīng)用，具有免疫調(diào)節(jié)、生物相容性、可生物降解、低毒、安全等特點(diǎn)[4-6]。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)靈芝孢子作為流感疫苗的口服免疫佐劑可顯著提高小鼠的抗體水平，增強(qiáng)了機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫水平。靈芝孢子多糖（ganoderma lucidum spore polysaccharide，GLSP）是靈芝孢子中的主要活性成分，具有較強(qiáng)的免疫作用[7]。因此，靈芝孢子多糖開發(fā)人用流感免疫佐劑具有較大潛力。本研究以靈芝孢子多糖聯(lián)合流感疫苗共同免疫小鼠，并以氫氧化鋁佐劑作為陽性對(duì)照，通過檢測(cè)血清特異性抗體水平、脾臟T、B 淋巴細(xì)胞增殖分化、骨髓樹突細(xì)胞共刺激分子表達(dá)、血清細(xì)胞因子含量等指標(biāo)，研究靈芝孢子多糖對(duì)流感疫苗免疫小鼠的免疫效果及作用機(jī)制，為靈芝孢子多糖作為疫苗佐劑的研究和應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB/c 小鼠，雌性，6 ～8 周齡，體質(zhì)量16 ～18 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：BUCM-4-2021072302-3034），飼養(yǎng)條件：溫度22 ～26℃，相對(duì)濕度60%～70%。

1.1.2 免疫原及藥物 甲型H1N1 流感病毒裂解疫苗原液（HA：291 μg/mL；Pr：421 μg/mL）由長(zhǎng)春?；鶃喩锛夹g(shù)股份有限公司提供。靈芝孢子多糖由本課題組制備，其提取原料去壁的靈芝孢子粉由浙江壽仙谷公司提供，提取工藝采用水提醇沉法，按照2020 版中國(guó)藥典“靈芝”項(xiàng)下多糖含量測(cè)定方法檢測(cè)的靈芝孢子多糖含量為91%。

1.1.3 試劑 H1N1（A/PR/8/1934）流感病毒毒株由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，凝血滴度均為1:256。注射用氫氧化鋁/明礬佐劑（40 mg/mL），購自Bioss 生物技術(shù)有限公司。RDE（受體破壞酶）購自Denka Seiken（日本）。1%雞紅細(xì)胞（廣州宏泉生物科技有限公司）

PBS（sigma）；RPMI 1640（Invitrogen）；FBS（Beijing Aoqing Biotechnology Co.，LTD）；MTT（Solarbio）；ConA （Apexbio）；LPS（sigma）；DPBS（sigma）。小鼠TNF-α、IL-4 ELISA 試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司；流式抗體：Brilliant Violet 605? Anti-Mouse CD45（BioLegend）、BV421 Rat anti-mouse CD25（BD）、BV510 Hamster anti-mouse CD3e（BD）、mCD8-R208-APC（sinobiological）、mCD4-R711-FITC（sinobiological）、FITC Anti-Mouse MHC-Ⅱ（I-A/I -E）（eBioscience）、BV421 Hamster Anti-Mouse CD80 （BD）、PE Rat Anti-Mouse CD86（BD）、BV786 Hamster Antimouse CD11c（BD）。

1.1.4 儀器 流式細(xì)胞儀（Nonocyte、 ACEA）、離心機(jī)（5810R、Eppendorf）、漩渦混合儀（88880018、Thermo）、酶標(biāo)儀（Epoch 2、BioTeK）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及免疫 BALB/c 雌性小鼠隨機(jī)分為4組，每組6 只，分別為空白對(duì)照組（Control）、疫苗組（VA）、疫苗+鋁佐劑組[Al（OH）3]、疫苗+靈芝孢子多糖組（GLSP）。各組小鼠分別于實(shí)驗(yàn)第0 天、第14 天進(jìn)行初次免疫和加強(qiáng)免疫，空白組小鼠肌肉注射PBS 溶液，VA 組、Al（OH）3組和GLSP 組小鼠分別肌肉注射流感疫苗原液（15 μg 血凝素/只小鼠）、流感疫苗原液與氫氧化鋁（100 μg/只小鼠）[8]、流感疫苗原液與靈芝孢子多糖（800 μg/只小鼠）的混合溶液，免疫體積為0.2 mL/只小鼠[9]。免疫后不同時(shí)間點(diǎn)稱量小鼠體質(zhì)量并觀察小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)，并于加強(qiáng)免疫后第14天、第30天眼眶取血，檢測(cè)特異性抗體水平，加強(qiáng)免疫后第49 天取血清，分離胸腺、脾臟、骨髓細(xì)胞等，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 一般狀況及體質(zhì)量 每次免疫后觀察小鼠是否有過敏反應(yīng)，蜷縮、豎毛、噴嚏、抽搐及休克等；進(jìn)一步觀察小鼠的精神狀態(tài)，進(jìn)食、活動(dòng)、注射部位有無硬結(jié)、出血或者潰爛情況，并記錄實(shí)驗(yàn)第0、14、28、42 及63 天等不同時(shí)間各組小鼠體質(zhì)量。

1.2.3 血凝抑制（HI）法檢測(cè)小鼠血清中特異性抗體滴度 各組小鼠于加強(qiáng)免疫后14 d、28 d 眼眶采血，分離血清，采用血凝抑制法測(cè)定小鼠血清中H1N1 特異性抗體滴度[10]?？贵w滴度表示為最高抗體滴度稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。

1.2.4 小鼠胸腺、脾臟指數(shù) 小鼠取血后，分離胸腺、脾臟，濾紙吸干殘血后，稱重，按下列方法計(jì)算胸腺指數(shù)：胸腺指數(shù)=（胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量）×10，脾臟指數(shù)：脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量×10。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子水平 各組小鼠加強(qiáng)免疫后49 d 取血并分離血清，采用ELISA 法檢測(cè)小鼠血清中IL-4、TNF-α 含量，檢測(cè)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，于450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度（OD）值并計(jì)算細(xì)胞因子濃度。

1.2.6 MTT 法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞增殖 各組小鼠加強(qiáng)免疫后49 d，無菌條件下取脾，制備脾細(xì)胞懸液，按照每毫升1×106個(gè)脾細(xì)胞懸液加入96 孔板，分別加入5 μg/mL 的ConA 和5 μg/mL 的LPS，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h，采用MTT 法檢測(cè)T、B 淋巴細(xì)胞的增殖活性。細(xì)胞增殖率用刺激指數(shù)SI 表示：SI =（實(shí)驗(yàn)組OD -空白組OD）／（陰性對(duì)照OD -空白組OD）。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟CD4+、CD8+、CD25+T 細(xì)胞亞型 各組小鼠脾細(xì)胞懸液分裝至96 孔板中，每孔50 μL，37℃培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入Brilliant Violet605? Anti-Mouse CD45（BioLegend）、BV421 Rat antimouse CD25（BD）、BV510 Hamster anti-mouse CD3e（BD）、mCD8-R208-APC（sinobiological）、mCD4-R711-FITC（sinobiological）抗體混合液，4℃避光孵育30 min，離心洗細(xì)胞2 次，重懸，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠骨髓樹突細(xì)胞（DC）中MHC II+、CD80+、CD86+水平 各組小鼠無菌條件下取小鼠股骨和脛骨，并進(jìn)行無菌處理制備骨髓細(xì)胞懸液，骨髓細(xì)胞分裝至U 底96 孔板中，每管75 μL，加入FITC Anti-Mouse MHC-Ⅱ（I-A/I -E）（eBioscience）、BV421 Hamster Anti-Mouse CD80 （BD）、PE Rat Anti-Mouse CD86（BD）、BV786 Hamster Anti-mouse CD11c（BD）抗體混合液，4℃避光孵育20 min，洗液為含BSA 的PBS 溶液，重懸，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況比較 分別于實(shí)驗(yàn)第0、14、28、42 及63 天不同時(shí)間點(diǎn)稱量小鼠體質(zhì)量并觀察小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果見表1。免疫期間小鼠無過敏反應(yīng)，進(jìn)食活動(dòng)正常，狀態(tài)良好，各組小鼠體質(zhì)量隨時(shí)間推移呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，各組間無差異，符合小鼠正常生長(zhǎng)特性，表明靈芝孢子多糖對(duì)小鼠無不良反應(yīng)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況比較（± s，n = 6） g

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況比較（± s，n = 6） g

組別 第0 天 第14 天 第28 天 第42 天 第63 天空白對(duì)照組 17.46±1.63 20.11±1.99 20.99±2.13 21.66±2.78 22.60±2.76疫苗組 17.44±1.45 20.49±1.40 21.32±1.49 23.01±1.47 24.21±2.13疫苗+鋁佐劑組 17.44±1.45 20.18±0.99 20.28±1.73 22.66±1.09 23.23±1.03疫苗+靈芝孢子多糖組 17.44±1.45 20.18±0.99 21.36±1.48 22.87±1.60 23.68±1.69

2.2 各組小鼠血清中HI 抗體滴度比較 見表2。

表2 各組小鼠血清中HI 抗體滴度比較（± s，n = 5） log2

表2 各組小鼠血清中HI 抗體滴度比較（± s，n = 5） log2

注：與疫苗組比較，# P ＜0.05

組別 二免后14 d 二免后30 d疫苗組 6.67±0.82 6.50±0.55疫苗+鋁佐劑組 8.6±2.30 6.8±1.10疫苗+靈芝孢子多糖組 10.17±1.17# 7.67±1.75

2.3 各組小鼠臟器指數(shù)變化比較 見表3。

表3 各組小鼠臟器指數(shù)變化比較（± s，n = 6）

表3 各組小鼠臟器指數(shù)變化比較（± s，n = 6）

組別 脾臟指數(shù) 胸腺指數(shù)空白對(duì)照組 45.75±3.33 16.93±3.43疫苗組 45.63±3.30 15.22±3.20疫苗+鋁佐劑組 42.65±4.48 16.57±1.95疫苗+靈芝孢子多糖組 41.72±2.66 16.07±1.78

2.4 各組小鼠血清中細(xì)胞因子的水平比較 見表4。

表4 各組小鼠血清中細(xì)胞因子的水平比較（± s，n = 6）pg/mL

表4 各組小鼠血清中細(xì)胞因子的水平比較（± s，n = 6）pg/mL

注：與空白對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與疫苗+鋁佐劑組比較，△P ＜0.05

組別 IL-4 TNF空白對(duì)照組 62.56±12.97 352.01±17.36疫苗組 63.99±8.19 517.61±70.43#疫苗+鋁佐劑組 71.45±9.41 416.24±49.36疫苗+靈芝孢子多糖組 84.54±14.81##△ 493.70±48.30##

2.5 ConA 和LPS 刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖變化比較 見表5。

表5 ConA 和LPS 刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖變化比較（± s，n = 3）

表5 ConA 和LPS 刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖變化比較（± s，n = 3）

注：與空白對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01，### P ＜0.001；與疫苗組比較，△△P ＜0.01；與疫苗+鋁佐劑組比較，▲P ＜0.05

組別 ConA LPS空白對(duì)照組 0.81±0.53 2.28±0.85疫苗組 1.43±0.87 2.72±2.01疫苗+鋁佐劑組 2.68±0.42## 2.47±0.90疫苗+靈芝孢子多糖組 3.36±1.51###△△ 5.17±1.53#▲

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組脾T 淋巴細(xì)胞免疫表型的表達(dá)比較 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟T 淋巴細(xì)胞亞群中CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+和CD3+CD4+CD25+的表達(dá)水平，結(jié)果見表6，如圖1。靈芝孢子多糖組中CD4+細(xì)胞含量升高，CD8+細(xì)胞含量下降，但無差異，CD25+含量顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果表明在免疫過程中，靈芝孢子多糖可能誘導(dǎo)產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，為維持機(jī)體自身穩(wěn)定，誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞增殖活化，從而抑制了CTL 細(xì)胞的活化和增殖，提示GLSP 具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組脾T 淋巴細(xì)胞免疫表型表達(dá)的變化

表6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組脾T 淋巴細(xì)胞免疫表型的表達(dá)比較（± s，n = 3）

表6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組脾T 淋巴細(xì)胞免疫表型的表達(dá)比較（± s，n = 3）

注：與空白對(duì)照組比較，## P ＜0.01

組別 CD3+/% CD3+CD4+/% CD3+CD8+/% CD4+/CD8+ CD25+/%空白對(duì)照組 41.00±1.82 77.92±3.59 15.85±2.40 5.02±1.05 7.55±1.13疫苗組 38.40±2.82 75.51±1.28 16.61±1.00 4.56±0.34 8.45±1.01疫苗+鋁佐劑組 40.24±5.26 75.85±1.70 16.72±1.83 4.58±0.64 8.73±0.10疫苗+靈芝孢子多糖組 38.99±3.54 78.39±0.25 14.36±0.48 5.46±0.19 9.79±0.58##

2.7 各組小鼠骨髓樹突細(xì)胞表面刺激分子含量比較 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠骨髓樹突細(xì)胞中MHC II類分子以及共刺激分子CD80、CD86，結(jié)果見表7，如圖2。與空白對(duì)照組比較，靈芝孢子多糖能顯著增強(qiáng)MHC II分子表達(dá)（P＜0.001），且顯著優(yōu)于疫苗組（P＜0.001）及鋁佐劑組（P＜0.05）；靈芝孢子多糖組共刺激分子CD86+表達(dá)顯著增強(qiáng)，優(yōu)于疫苗組及鋁佐劑組（P＜0.05）；CD80+分子水平有升高，但無顯著差異，表明靈芝孢子多糖可促進(jìn)DC 細(xì)胞成熟并提高了DC的抗原提呈能力，進(jìn)而加強(qiáng)了激活初始T 細(xì)胞的能力，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用。

圖2 各組小鼠骨髓樹突細(xì)胞表面刺激分子含量變化

表7 各組小鼠骨髓樹突細(xì)胞表面刺激分子含量比較（± s，n = 3）

表7 各組小鼠骨髓樹突細(xì)胞表面刺激分子含量比較（± s，n = 3）

注：與空白對(duì)照組比較，### P ＜0.001；與疫苗組比較，△P ＜0.05，△△△P ＜0.001；與疫苗+鋁佐劑組比較，▲P ＜0.05

組別 CD11C+MHCII+/% MHCII+CD86+/% MHCII+CD80+/% CD80+/CD86+空白對(duì)照組 0.59±0.13 19.06±1.51 44.51±1.23 2.34±0.16疫苗組 0.53±0.02 15.98±2.30 44.80±7.58 2.80±0.13疫苗+鋁佐劑組 0.76±0.14△ 11.54±1.23### 36.33±1.07## 3.16±0.24疫苗+靈芝孢子多糖組 1.04±0.12###△△△▲ 21.88±1.35△▲ 50.16±6.56 2.29±0.18

3 討論

中藥多糖類成分是當(dāng)前作為流感疫苗佐劑研究的重點(diǎn)，其種類繁多，且每種多糖均具有獨(dú)特的免疫作用，可以通過激活T、B 淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，激活補(bǔ)體，促進(jìn)干擾素生成，誘生細(xì)胞因子等方式產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，影響機(jī)體的免疫功能，很有希望開發(fā)成為新型疫苗佐劑[8,11-12]。靈芝孢子多糖是靈芝孢子中的重要活性成分，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用[7]。本實(shí)驗(yàn)將靈芝孢子多糖和流感疫苗共同免疫小鼠，通過檢測(cè)特異性抗體滴度、細(xì)胞因子水平、脾臟T、B 淋巴細(xì)胞增殖、脾臟T 淋巴細(xì)胞亞群及骨髓樹突細(xì)胞共刺激分子等指標(biāo)評(píng)價(jià)靈芝孢子多糖對(duì)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫的應(yīng)答能力，并深入探討其作為疫苗佐劑的免疫效果及作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子多糖可明顯提高小鼠的抗體效價(jià)，一般來說免疫原性HI 抗體效價(jià)≥1: 40被認(rèn)為是流感疫苗注冊(cè)時(shí)評(píng)價(jià)有效性的重要指標(biāo)[13]，本研究結(jié)果靈芝孢子多糖組二免后抗體14 d 效價(jià)大于1 024，二免后30 d 效價(jià)大于128，且強(qiáng)于鋁佐劑組，具有較好的體液免疫應(yīng)答，表明靈芝孢子多糖可增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)和促進(jìn)抗體的產(chǎn)生。

細(xì)胞因子對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答具有重要調(diào)節(jié)作用[14]。按功能劃分為Th1 型細(xì)胞因子、Th2 型細(xì)胞因子[15]，Th1 細(xì)胞主要促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，而Th2 細(xì)胞以促進(jìn)抗體產(chǎn)生為主[16]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果表明靈芝孢子多糖佐劑可刺激Th2 型細(xì)胞因子IL-4、Th1 型細(xì)胞因子TNF-α 分泌，而常用的鋁佐劑只能誘導(dǎo)Th2 型免疫應(yīng)答[17]，因此，靈芝孢子可平衡Th1/Th2 型免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫。

T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞分別執(zhí)行不同的免疫功能，T 淋巴細(xì)胞主要參與人體的細(xì)胞免疫功能，病原微生物侵入人體后，可以直接發(fā)揮免疫作用；B 淋巴細(xì)胞會(huì)增殖變成漿細(xì)胞，然后產(chǎn)生抗體，通過抗體結(jié)合抗原而發(fā)揮免疫作用[18]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明靈芝孢子多糖可顯著提高LPS 誘導(dǎo)的B 細(xì)胞及ConA 誘導(dǎo)的T 細(xì)胞的增殖活性。因此，靈芝孢子多糖可在機(jī)體接觸抗原后刺激T 淋巴細(xì)胞直接發(fā)揮細(xì)胞免疫作用，刺激B 淋巴細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)產(chǎn)生抗體。

T 淋巴細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫性能的穩(wěn)定具有重要的調(diào)節(jié)作用，CD4+T 細(xì)胞具有輔助細(xì)胞免疫和體液免疫的功能；CD8+T 細(xì)胞主要是殺死感染了病原體的宿主細(xì)胞和破壞腫瘤細(xì)胞；在細(xì)胞免疫中，T 淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞數(shù)量及比值的變化直接反映機(jī)體的免疫應(yīng)答水平。當(dāng)CD4+和CD8+比值增大時(shí)，表明機(jī)體具有較強(qiáng)的免疫功能[19]。Treg 細(xì)胞具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)能力，CD25+是其標(biāo)志性表面分子[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子多糖作為流感疫苗佐劑免疫小鼠，增加了CD4+細(xì)胞表達(dá)，降低了CD8+細(xì)胞的表達(dá)，CD4+/CD8+比值升高，在免疫過程中靈芝孢子多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。同時(shí)為維持機(jī)體自身穩(wěn)定，靈芝孢子多糖組小鼠調(diào)節(jié)T 細(xì)胞標(biāo)志性表面分子CD25+表達(dá)水平顯著升高，誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞增殖活化，從而抑制了CTL 細(xì)胞的活化和增殖，因此CD8+細(xì)胞水平降低，抑制性細(xì)胞因子IL-4 含量升高，提示靈芝孢子多糖不僅有免疫增強(qiáng)作用，同時(shí)也可表現(xiàn)出免疫抑制，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。

樹突狀細(xì)胞是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞的成熟和分化是獲得性免疫應(yīng)答重要的一步[21]。MHC Ⅱ作為其表面的抗原提呈分子，與外源性抗原結(jié)合成復(fù)合物形式提呈給CD4+T 細(xì)胞，是T 細(xì)胞活化的第一啟動(dòng)信號(hào)[22]，進(jìn)而可激活細(xì)胞免疫應(yīng)答。DC 在成熟過程中細(xì)胞表面表達(dá)的共刺激分子CD80 和CD86 與T 細(xì)胞表面表達(dá)的CD28 分子相互作用，共同促進(jìn)T 細(xì)胞向Th2 分化[23]，從而誘導(dǎo)體液免疫。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靈芝孢子多糖能顯著增強(qiáng)小鼠骨髓樹突細(xì)胞表面MHC II 分子水平、共刺激分子CD86 和CD80 分子水平，表明GLSP 可促進(jìn)DC 細(xì)胞成熟并提高了DC 的抗原提呈能力，進(jìn)而加強(qiáng)了激活初始T 細(xì)胞的能力，且促進(jìn)T 細(xì)胞向Th2 分化，從而誘導(dǎo)體液免疫。

綜上所述，靈芝孢子多糖作為流感疫苗新型佐劑，可提升機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)Th1/Th2型免疫應(yīng)答，促進(jìn)T、B 淋巴細(xì)胞增殖分化誘導(dǎo)機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫；調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞亞群水平產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)；通過促進(jìn)DC 細(xì)胞成熟并提高DC 的抗原提呈能力提高機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果提示靈芝孢子多糖可作為一種新型免疫佐劑值得進(jìn)行深入研究。