雞傳染性鼻炎三價滅活疫苗生產(chǎn)用菌株的篩選

金云云 , 劉怡寧 , 吳營霞 , 翟路峰 , 高盛果 , 高曉靜 , 田克恭

(1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心 , 河南 洛陽 471000 ; 2. 普萊柯生物工程股份有限公司 , 河南 洛陽 471000)

雞傳染性鼻炎(Infectious coryza,IC)是由副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)引起的一種雞急性呼吸道疾病[1],臨床癥狀主要表現(xiàn)為面部腫脹、流鼻涕和結(jié)膜炎,肉垂可出現(xiàn)明顯腫脹,雞是Apg的自然宿主,各種日齡的雞對Apg均易感,但幼雞一般不太嚴(yán)重[2]。該病造成較大經(jīng)濟損失,可導(dǎo)致育成雞生長不良和產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋明顯下降(10%～40%),當(dāng)Apg與其他病原體混合感染時,情況會變得復(fù)雜,這些損失將增加到85%并且死亡率相當(dāng)高[2-5]。通常臨床癥狀和產(chǎn)蛋率下降會在Apg感染20 d內(nèi)消失,但復(fù)雜的病例可能持續(xù)長達(dá)2個月。Page等[6]使用平板凝集試驗將Apg分為A、B、C 三個血清型;Kume等[7]通過使用硫氰酸鉀處理并經(jīng)超聲裂解的菌體細(xì)胞、戊二醛固定的雞紅細(xì)胞和家兔高免血清進(jìn)行血凝抑制試驗(Hemagglutination inhibitio,HI),將Apg分為A、B、C 三個血清群,與Page血清型A、B、C相對應(yīng)[8]。目前認(rèn)為,9種Kume血清型分別為A-1、A-2、A-3、A-4、B-1、C-1、C-2、C-3 和 C-4[8]。很多按照Page方法無法分型的菌株使用Kume方法很容易進(jìn)行分型[9]。Apg A、B、C型菌株引起的IC在我國不同地區(qū)均有流行[10],使用良好的滅活疫苗免疫接種是預(yù)防和控制該病的有效措施。Apg A、B、C三個血清型之間缺乏交叉保護(hù)[11,12],但同一血清型的不同亞型之間存在部分交叉保護(hù)[13],故良好的雞傳染性鼻炎滅活疫苗應(yīng)包含A、B、C三個血清型菌株,且菌株需要具備良好的免疫原性,才能對該病起到全面的預(yù)防和保護(hù)作用。

本試驗為了篩選免疫原性良好的雞傳染性鼻炎滅活疫苗生產(chǎn)用菌株,通過對實驗室前期分離的A、B、C型Apg不同菌株的致病性和免疫原性進(jìn)行比較分析,選擇毒力較強、免疫原性較好的菌株用于后續(xù)疫苗研發(fā),為開發(fā)良好的雞傳染性鼻炎三價滅活疫苗提供支持。

1 材料與方法

1.1 菌種 11株Apg分離株,由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心分離、鑒定并保存[10],其中A型菌5株(HN2株、HN3株、SD2株、HB1株、HB2株),B型菌3株(HN4株、HN5株、SD4株),C型菌3株(HN1株、SD1株、SD3株)。

1.2 陽性血清 標(biāo)準(zhǔn)Apg血清A型菌株CCM6032株(CVCC 269)、血清B型菌株CCM6075株(CVCC 257)、血清C型菌株Modesto株(CVCC 258)陽性血清,由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心制備和保存。

1.3 主要試劑 雞肉湯瓊脂平板、雞肉湯培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline,PBS,0.01 mol/L,pH 7.2),由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心制備并檢驗合格后備用。

1.4 主要儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(Hera cell 240I),購自德國Thermo公司;臺式恒溫?fù)u床(EXCELLA E24R),購自美國NBS公司;生物安全柜(Nu-425-400E),購自美國NuAire公司;旋渦混勻器(MS3DS25),購自德國IKA公司。

1.5 實驗動物 SPF種蛋和SPF白羽肉雞,均購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2014—0002],本試驗經(jīng)普萊柯生物工程股份有限公司動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)后開展(批準(zhǔn)號:201402001)。

1.6 毒力試驗

1.6.1 Apg對雞胚的毒力 將分離的11株Apg分別接種于雞肉湯瓊脂平板,置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,挑取典型菌落接種于雞肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)11 h。按照《中華人民共和國獸藥典》三部附錄的活菌計數(shù)方法測定11株Apg菌液的活菌含量,將菌液均進(jìn)行105倍稀釋,卵黃囊接種6～7日齡SPF雞胚各10枚,每胚0.2 mL,置37 ℃繼續(xù)孵化,觀察雞胚30 h內(nèi)死亡情況。

1.6.2 Apg對雞的致病性 使用1.6.1制備的11株Apg菌液,經(jīng)眶下竇接種12～14周齡SPF雞各5只,0.2 mL/只,接種后連續(xù)觀察7 d,統(tǒng)計各菌株的發(fā)病比例,出現(xiàn)面部腫脹或流鼻涕任一項癥狀即判為發(fā)病。

1.6.3 最小發(fā)病劑量測定 根據(jù)1.6.1和1.6.2試驗結(jié)果篩選出毒力較強的A型、B型和C型Apg各2株,按照1.6.1方法制備菌液,將菌液均稀釋至活菌數(shù)約為106、105、104和103CFU/mL,分別經(jīng)眶下竇接種12～14周齡SPF雞10只,0.2 mL/只,接種后連續(xù)觀察7 d,統(tǒng)計各菌株的發(fā)病比例。

1.7 免疫原性試驗 根據(jù)1.6毒力試驗結(jié)果篩選出毒力較強的A型、B型和C型Apg各2株,按照1.6.1方法制備菌液,8 000 r/min離心10 min,去除上清,用PBS(0.01 mol/L,pH 7.2)重懸菌體沉淀至原體積的1/10,使用硫柳汞溶液滅活后,分別與氫氧化鋁膠佐劑混合制備單價鋁膠佐劑滅活疫苗(每毫升疫苗含菌數(shù)均為2.0×109CFU),免疫組每種疫苗免疫8～10周齡SPF雞各20只,0.5 mL/只,另設(shè)60只不免疫雞作為對照組。免疫后28 d,所有免疫組和對照組雞只采血、分離血清,免疫組分別使用同血清型的2株HI抗原(制備方法參考國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[14])檢測HI抗體效價(血清使用雞醛化紅細(xì)胞吸附后檢測,待檢血清起始稀釋度均為1∶5)。

免疫后28 d,對每個A型菌單價滅活苗免疫組和對照組的各20只雞,分別經(jīng)眶下竇注射2株A型Apg菌液,每株各接種10只雞,0.2 mL/只(最小發(fā)病劑量);B型菌和C型菌單價滅活苗免疫組和對照組也分別使用2株B型菌和2株C型菌以同樣方式進(jìn)行攻毒。接種后連續(xù)觀察7 d,統(tǒng)計各組的發(fā)病比例。比較各菌株的免疫原性和菌株間的交叉保護(hù)性。

1.8 最小抗原含量測定 根據(jù)1.7免疫原性試驗篩選出免疫原性和交叉保護(hù)性較好的A型、B型和C型菌株各1株,按照1.7方法均制備成抗原含量分別為5.0×108、1.0×109、1.5×109和2.0×109CFU/mL的單價鋁膠佐劑滅活疫苗,免疫組分別免疫8～10周齡SPF雞10只,0.5 mL/只,另設(shè)30只雞不免疫作為對照組。免疫后28 d,所有免疫組和對照組雞只采血、分離血清,使用對應(yīng)疫苗菌株HI抗原分別檢測HI抗體效價。

免疫后28 d,對不同抗原含量的A型菌單價滅活苗免疫組各10只雞和對照組10只雞,經(jīng)眶下竇注射A型Apg菌液,0.2 mL/只(最小發(fā)病劑量);不同抗原含量的B型和C型菌單價滅活苗免疫組和對照組也分別使用B型菌和C型菌以同樣方式進(jìn)行攻毒。接種后連續(xù)觀察7 d,統(tǒng)計各組的發(fā)病比例。

2 結(jié)果

2.1 毒力試驗

2.1.1 Apg對雞胚的毒力 經(jīng)測定,11株Apg攻毒菌液的活菌含量介于1.8×109～2.4×109CFU/mL,每胚實際接種劑量介于3.6×103～4.8×103CFU,接種后30 h內(nèi)雞胚死亡比例介于7/10～10/10(表1)。結(jié)果表明,11株Apg菌株對雞胚均具有較強的毒力。

表1 11株副雞禽桿菌的毒力測定Table 1 Virulence determination of 11 Apg strains

2.1.2 Apg對雞的致病性 經(jīng)計算,每只雞實際接種劑量介于3.6×108～4.8×108CFU。接種菌液后24～72 h試驗雞出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀,主要為面部腫脹和流鼻涕;接種后連續(xù)觀察7 d,出現(xiàn)面部腫脹或流鼻涕任一項癥狀即判為發(fā)病,各菌株攻毒雞的發(fā)病比例介于3/5～5/5(表1)。結(jié)果表明,11株Apg菌株對雞均具有一定的毒力,其中A型HN3株和HB2株,B型HN5株和SD4株,C型HN1株和SD3株毒力較強,用于后續(xù)試驗。

2.1.3 最小發(fā)病劑量測定 將Apg A型HN3株和HB2株、B型HN5株和SD4株、C型HN1株和SD3株菌液稀釋至不同活菌數(shù)后進(jìn)行攻毒,結(jié)果見表2,A型HN3株和HB2株的最小發(fā)病劑量分別約為2.0×104和2.5×105CFU;B型HN5株和SD4株的最小發(fā)病劑量分別約為1.8×103和2.2×105CFU;C型HN1株和SD3株的最小發(fā)病劑量分別約為2.1×105和2.3×103CFU。

表2 6株副雞禽桿菌最小發(fā)病劑量測定Table 2 Minimum pathogenic dose determination of 6 Apg strains

2.2 免疫原性試驗 將Apg A型HN3株和HB2株、B型HN5株和SD4株、C型HN1株和SD3株制備成單價鋁膠佐劑滅活疫苗,免疫SPF雞28 d后,檢測HI抗體效價,結(jié)果見表3～5,相同血清型之間A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株滅活疫苗免疫后血清,使用同源和異源菌株HI抗原檢測HI抗體效價的幾何平均值介于1∶139～1∶970(4.8～7.6 log2×5),陽性比例(HI抗體效價≥1∶10判為陽性)介于8/10～10/10;而A型HB2株、B型SD4株和C型HN1株滅活疫苗免疫后血清使用同源和異源菌株HI抗原檢測HI抗體效價的幾何平均值介于1∶30～1∶299(2.6～5.9 log2×5),陽性比例介于5/10～9/10。

表3 A型副雞禽桿菌不同菌株免疫原性試驗血清HI抗體檢測Table 3 Serum HI antibody determination in immunogenicity test of different Apg strains of serotype A (log2×5)

表4 B型副雞禽桿菌不同菌株免疫原性試驗血清HI抗體檢測Table 4 Serum HI antibody determination in immunogenicity test of different Apg strains of serotype B (log2×5)

表5 C型副雞禽桿菌不同菌株免疫原性試驗血清HI抗體檢測Table 5 Serum HI antibody determination in immunogenicity test of different Apg strains of serotype C (log2×5)

免疫后28 d,各型單價疫苗免疫組分別使用同血清型不同菌株進(jìn)行攻毒(含至少1個發(fā)病劑量),攻毒后發(fā)病結(jié)果見表6,相同血清型之間A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株對同源和異源菌株的攻擊均可產(chǎn)生理想的保護(hù)效果,保護(hù)比例介于8/10～10/10;而A型HB2株、B型SD4株和C型HN1株對同源菌株的保護(hù)比例分別為9/10、8/10和7/10,對異源菌株的保護(hù)比例分別只有8/10、7/10和5/10,攻毒保護(hù)結(jié)果與血清HI抗體效價結(jié)果相關(guān)性較高,HI抗體陽性的雞只攻毒后均獲得保護(hù)。因此將毒力較強、免疫原性較好的A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株作為疫苗生產(chǎn)和攻毒用菌株。

表6 副雞禽桿菌不同菌株免疫原性試驗攻毒后發(fā)病比例Table 6 Incidence ratio after challenge in immunogenicity test of different Apg strains

2.3 最小抗原含量測定 將A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株制備成不同抗原含量的單價滅活疫苗,進(jìn)行免疫攻毒保護(hù)試驗,免后28 d血清HI抗體效價和攻毒后發(fā)病比例見表7和表8。A型HN3株抗原含量不低于5.0×108CFU/mL時,免疫后28 d血清HI抗體效價幾何平均值介于1∶98～1∶1 114(4.3～7.8 log2×5),陽性比例介于8/10～10/10,攻毒后能提供8/10～10/10的保護(hù);B型抗原含量不低于1.0×109CFU/mL時,免疫后28 d血清HI抗體效價幾何平均值介于1∶184～1∶788(5.2～7.3 log2×5),陽性比例介于8/10～10/10,攻毒后能提供8/10～10/10的保護(hù);C型SD3株抗原含量不低于1.5×109CFU/mL時,免疫后28 d血清HI抗體效價幾何平均值介于1∶139～1∶368(4.8～6.2 log2×5),陽性比例介于8/10～10/10,攻毒后能提供8/10～10/10的保護(hù)。因此,疫苗中A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株的最小抗原含量分別為5.0×108、1.0×109和1.5×109CFU/mL。

表7 副雞禽桿菌不同菌株最小抗原含量測定試驗血清HI抗體檢測 Table 7 Serum HI antibody determination in minimum antigen content test of different Apg strains (log2×5)

表8 副雞禽桿菌不同菌株最小抗原含量測定攻毒后發(fā)病比例Table 8 Incidence ratio after challenge in minimum antigen content test of different Apg strains

3 討論

研究表明,不同Apg菌株的致病性存在差異,并通過田間菌株和參考菌株得到證實[15,16]。Apg的致病性與多種因素有關(guān),目前研究主要針對血凝素抗原(Hemagglutination antigen,HA)[2],HA抗原是一種大小為210 kDa的蛋白(HMTp210蛋白),由血凝素、自轉(zhuǎn)運蛋白和黏附素構(gòu)成的三聚體,具有血凝、細(xì)胞黏附和生物被膜形成活性[17]。針對HA抗原作為保護(hù)性抗原也開展了很多研究,Takagi等[18,19]已證實一種針對Page血清A型HA的特異性單克隆抗體具有被動保護(hù)作用,并且用該抗體純化的HA抗原也具有保護(hù)性。

Caballero-Garcia等[20]通過研究包含3種血清型的24株Apg菌株的致病性,選擇各血清型中致病性最強的菌株制備滅活疫苗進(jìn)行同源菌株的攻毒評價,證實菌株的免疫原性良好,同時提出了另一種篩選雞傳染性鼻炎滅活疫苗菌株的方法,即根據(jù)致病性而不僅僅是血清型來選擇疫苗菌株。

本試驗通過雞胚和雞只的毒力試驗對分離的5株A型、3株B型和3株C型Apg的毒力進(jìn)行比較,各血清型初步篩選出2株毒力較強的菌株進(jìn)行最小發(fā)病劑量測定,從而確定毒力最強的A型、B型和C型Apg菌株并建立各菌株的攻毒模型,用于疫苗效力檢驗;在此基礎(chǔ)上,通過對各血清型的2株毒力較強菌株的免疫原性研究發(fā)現(xiàn),毒力最強菌株制備的滅活疫苗免疫后不僅能夠抵抗同源菌株的攻擊,對同血清型異源菌株也能提供良好的保護(hù),說明毒力更強的菌株其免疫原性和交叉保護(hù)性更好,與Caballero-Garcia等[20]的研究結(jié)果一致。

Sawata等[21]研究發(fā)現(xiàn),用HI檢測免疫雞只的抗體效價達(dá)到1∶5或更高時,對攻毒有保護(hù)作用,但疫苗免疫后不刺激機體產(chǎn)生HI抗體也具有保護(hù)作用[15],說明其他抗體在免疫保護(hù)過程中也具有重要作用。在本試驗中對各菌株滅活疫苗免疫后28 d血清的HI抗體效價進(jìn)行測定,與攻毒保護(hù)結(jié)果具有較高的相關(guān)性,毒力更強菌株的滅活疫苗免疫血清使用同源菌株及同血清型異源菌株HI抗原檢測的HI抗體效價和陽性比例均較高,HI抗體陽性的雞只攻毒后均獲得保護(hù),個別HI抗體陰性的雞只攻毒后也獲得保護(hù),進(jìn)一步印證了上述文獻(xiàn)[21]報道的結(jié)論,但可能也與Apg HI抗體檢測方法的靈敏度不高有關(guān)。HI抗體檢測方法與滅活疫苗免疫攻毒保護(hù)結(jié)果相關(guān)性較好,可以作為疫苗攻毒保護(hù)效力評價的替代方法,但該方法所用抗原和雞醛化紅細(xì)胞制備過程較為繁瑣,在臨床推廣使用較為困難,臨床需要一種操作更簡便的方法用于疫苗免疫效果評價。

綜上所述,為了篩選更好的雞傳染性鼻炎滅活疫苗生產(chǎn)菌株,提升雞傳染性鼻炎滅活疫苗的免疫保護(hù)效果,在疫苗菌株篩選過程中,可以將菌株致病性作為一項重要指標(biāo),同時可以結(jié)合HI抗體檢測方法,使用同血清型的多個不同菌株HI抗原檢測候選菌株滅活疫苗免疫后血清的HI抗體效價,選擇能夠產(chǎn)生更高HI抗體及能夠與多個不同菌株HI抗原反應(yīng)良好的菌株作為疫苗菌株,確保疫苗具備良好和廣譜的免疫保護(hù)效果。