木犀草素對白血病K562/ADR細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制研究

周欣宇，李京敏，張婷，賈秀紅△

慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其特征是染色體易位t（9；22）（q34；q11）導(dǎo)致BCR-ABL 融合基因的形成。BCR-ABL 融合基因編碼的蛋白具有極高的酪氨酸激酶活性，可激活Ras，使磷酸肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）等信號(hào)通路異常活化，導(dǎo)致造血干細(xì)胞增殖失控［1-2］。酪氨酸激酶抑制劑是目前治療CML的一線藥物，治療效果良好。然而，仍有10%～20%的患者在治療過程中出現(xiàn)耐藥性，使病程進(jìn)展至晚期或原始細(xì)胞危象［3］。因此，探究白血病的相關(guān)耐藥機(jī)制，尋找高效、低毒的白血病治療藥物成為亟待解決的問題。中藥提取物對逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥具有靶點(diǎn)多、毒性低等特點(diǎn)，可以通過不同的機(jī)制逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。木犀草素（Lut）是植物中廣泛存在的一類黃酮類化合物，可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞免疫耐受、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞DNA 損傷等方式發(fā)揮抗腫瘤作用［4］。Lut可在CML、骨肉瘤等腫瘤中發(fā)揮抗癌及化療藥物增敏作用［5-6］，但目前有關(guān)Lut 對K562/ADR 細(xì)胞多藥耐藥的研究報(bào)道尚少見。本研究旨在探討Lut 逆轉(zhuǎn)K562/ADR 細(xì)胞多藥耐藥的作用及機(jī)制，為白血病的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Lut購自阿拉丁生化科技股份有限公司，純度≥98%；阿霉素（adriamycin，ADR）購自MCE 公司，純度≥98%；CCK-8試劑盒購自亞科因生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；谷胱甘肽（GSH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistance protein-1，MRP1）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi（glutathione S-transferase Pi，GST-pi）、GAPDH 引物及RT-PCR 試劑盒均購自艾科瑞生物工程有限公司；鼠抗人Nrf2、MRP1、P-gp、GST-pi、GAPDH 單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。BDCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司；QuantStudio 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自美國Thermo 公司；tanon5200 化學(xué)發(fā)光成像儀購自上海天能公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞株由濱州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物研究所提供；K562/ADR 耐藥細(xì)胞株購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；K562 細(xì)胞、K562/ADR 細(xì)胞均置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以1 000 μg/L ADR 維持K562/ADR 細(xì)胞的耐藥性，實(shí)驗(yàn)前2 周培養(yǎng)液中停用ADR，于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長融合度達(dá)70%～80%時(shí)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測K562/ADR 細(xì)胞耐藥倍數(shù) 以每孔5×103個(gè)K562、K562/ADR細(xì)胞接種于96孔板，分別加入不同質(zhì)量濃度的ADR（K562 細(xì)胞中為0、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg/L，K562/ADR細(xì)胞中為0、16、32、64和128 mg/L）。干預(yù)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h。用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度（OD）值，計(jì)算半數(shù)抑制率（half maximal inhibitory concentration，IC50）和耐藥倍數(shù)。耐藥倍數(shù)=IC50（K562/ADR細(xì)胞）/IC50（K562細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)篩選Lut 對K562/ADR 細(xì)胞的無毒劑量 以每孔5×103個(gè)K562/ADR 細(xì)胞接種于96 孔板，分別加入0、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L的Lut。干預(yù)24 h后，每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液后繼續(xù)孵育4 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔的OD值，計(jì)算各濃度下細(xì)胞的抑制率，抑制率（%）=［1-（實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）］×100%。為減少Lut對K562/ADR細(xì)胞的影響，選擇無毒性（抑制率＜10%）的Lut濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測Lut 逆轉(zhuǎn)K562/KDR 細(xì)胞的耐藥倍數(shù) 以5×103細(xì)胞的密度接種于96 孔板，分別向0、2、4 μmol/L 的Lut 中加入不同質(zhì)量濃度的ADR（0、16、32、64、128 mg/L），分為0 μmol/L Lut+ADR 組、2 μmol/L Lut+ADR 組和4 μmol/L Lut+ADR 組，干預(yù)培養(yǎng)24 h 后，采用CCK-8 法檢測細(xì)胞活力，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率、IC50值和耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，以評(píng)估Lut 的逆轉(zhuǎn)效力。耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=IC50（0μmol/LLut+ADR組）/IC50（2或4μmol/LLut+ADR組）。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 以每孔1×106個(gè)K562/ADR 細(xì)胞接種于6 孔板，將實(shí)驗(yàn)設(shè)為0 μmol/L Lut 組、2 μmol/L Lut 組、4 μmol/L Lut組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組干預(yù)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測Lut對K562/KDR細(xì)胞內(nèi)ADR蓄積的影響 按1.2.5干預(yù)分組，向各組中加入3 mg/L ADR，培養(yǎng)1 h后，1 000 r/min 離心5 min，PBS 洗去游離的ADR。流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長580 nm 處各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，以評(píng)估各組細(xì)胞中ADR的蓄積量。

1.2.7 GSH試劑盒檢測Lut對K562/ADR 細(xì)胞內(nèi)GSH水平的影響 按1.2.5干預(yù)分組，收集干預(yù)后的細(xì)胞，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min取上清液，按試劑盒說明書用酶標(biāo)儀測定405 nm波長處各孔的OD值，計(jì)算每組細(xì)胞中GSH的含量。

1.2.8 RT-PCR 法檢測Nrf2、MRP1、P-gp、GST-pi mRNA 的表達(dá) 按1.2.5 干預(yù)分組，收集干預(yù)后的細(xì)胞，采用Trizol 法提取細(xì)胞中的總RNA，應(yīng)用分光光度計(jì)檢測提取RNA 的濃度和純度。按試劑盒說明書將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)SYBRGreen 試劑盒說明書檢測MRP1、P-gp、GST-pi、Nrf2 mRNA表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參基因。各基因引物序列見表1。反應(yīng)體系（20 μL）：1 μL cDNA（50 mg/L），10 μL 2×SYBR qPCR Mix，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，8 μL ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火及延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法表示目的基因的相對表達(dá)水平。

Tab.1 Primer sequence of RT-PCR表1 RT-PCR引物序列

1.2.9 Western blot 檢測Nrf2、MRP1、P-gp、GST-pi 蛋白的表達(dá) 按1.2.5 干預(yù)分組，收集干預(yù)后的細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入120 μL 裂解液，提取各組細(xì)胞中的總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。配制SDSPAGE 凝膠，每孔加30 μg 蛋白樣品，以80 V 恒壓電泳30 min，然后轉(zhuǎn)120 V電泳90 min。電泳結(jié)束后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。然后加入兔抗人Nrf2（1∶2 000）、MRP1（1∶1 000）、P-gp（1∶2 000）、GST-pi（1∶2 000）和GAPDH（1∶10 000）單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫?fù)u床上孵育2 h。條帶用200 μL ECL 發(fā)光液進(jìn)行曝光。蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 K562/ADR細(xì)胞的耐藥性 經(jīng)不同濃度ADR處理24 h 后，ADR 對K562 和K562/ADR 細(xì)胞的IC50值分別為（1.96±0.34）mg/L 和（105.23±4.83）mg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，t=36.910，P＜0.05）；與K562 細(xì)胞相比，K562/ADR細(xì)胞對ADR具有明顯的耐藥性，耐藥倍數(shù)為53.69倍。

2.2 無細(xì)胞毒性的Lut 濃度 2、4、8、16、32、64、128 μmol/L Lut 處理K562/ADR 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞增殖抑制率分別為（2.35±0.76）%、（8.93±1.07）%、（18.23±1.43）%、（22.78±0.49）%、（51.93±3.62）%、（65.72±2.33）%、（72.77±3.12）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=523.600，P＜0.05）。其中，2 μmol/L Lut 和4 μmol/L Lut 對K562/ADR 細(xì)胞的增殖抑制率＜10%，為無毒性的Lut濃度。

2.3 Lut 增強(qiáng)K562/ADR 細(xì)胞對ADR 的敏感性 與0 μmol/L Lut+ADR 組比較，2 μmol/L Lut+ADR 組和4 μmol/L Lut+ADR 組對K562/ADR 細(xì)胞的增殖抑制率更高（P＜0.05），見圖1。0 μmol/L Lut+ADR 組、2 μmol/L Lut+ADR 組、4 μmol/L Lut+ADR 組對ADR的IC50值（mg/L）分別為112.56±1.42、79.16±2.67 和34.63±0.49，依次降低（n=3，F(xiàn)=1 462.000，P＜0.05）。2、4 μmol/L Lut對ADR耐藥的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.42、3.25倍。

Fig.1 Effect of different concentrations of Lut on the sensitivity of K562/ADR cells to ADR圖1 不同濃度Lut對K562/ADR細(xì)胞ADR敏感性的影響

2.4 Lut 增加K562/ADR 細(xì)胞內(nèi)ADR 的蓄積量 結(jié)果顯示，0 μmol/L Lut 組、2 μmol/L Lut 組、4 μmol/L Lut 組細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度分別為371.00±26.06、410.00±10.15 和733.67±0.57，依次增強(qiáng)（n=3，F(xiàn)=456.000，P＜0.05）。

2.5 Lut降低K562/ADR細(xì)胞內(nèi)GSH含量 0 μmol/L Lut 組、2 μmol/L Lut 組、4 μmol/L Lut 組GSH 含量（μmol/g）分別為34.05±0.56、23.37±0.17 和13.85±0.80，依次降低（n=3，F(xiàn)=932.800，P＜0.05）。

2.6 Lut 下調(diào)K562/ADR 細(xì)胞中Nrf2、MRP1、P-gp、GST-pi mRNA 的表達(dá) 與0 μmol/L Lut 組相比，2 μmol/L Lut 組和4 μmol/L Lut 組細(xì)胞內(nèi)MRP1、Pgp、Nrf2、GST-pi mRNA 表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；與2 μmol/L Lut 組相比，4 μmol/L Lut 組細(xì)胞內(nèi)MRP1、P-gp、GST-pi mRNA 表達(dá)水平均降低（P＜0.05），Nrf2 mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of relative expression levels of MRRP1,P-gp,Nrf2 and GST-pi mRNA between the three groups表2 各組MRRP1、P-gp、Nrf2、GST-pi mRNA相對表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of MRRP1,P-gp,Nrf2 and GST-pi mRNA between the three groups表2 各組MRRP1、P-gp、Nrf2、GST-pi mRNA相對表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊P＜0.05；a 與0 μmol/L Lut 組比較，b 與2 μmol/L Lut 組比較，P＜0.05。

組別0 μmol/L Lut組2 μmol/L Lut組4 μmol/L Lut組F MRP1 1 0.76±0.05a 0.67±0.02ab 101.700＊P-gp 1 0.53±0.07a 0.36±0.05ab 130.300＊Nrf2 1 0.57±0.14a 0.35±0.20a 15.650＊GST-pi 1 0.88±0.04a 0.64±0.08ab 48.690＊

2.7 Lut 下調(diào)K562/ADR 細(xì)胞中Nrf2、MRP1、P-gp、GST-pi 蛋白的表達(dá) 與0 μ mol/L Lut 組相比，2 μmol/L Lut 組和4 μmol/L Lut 組細(xì)胞內(nèi)MRP1、Pgp、Nrf2、GST-pi 蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；與2 μmol/L Lut 組相比，4 μmol/L Lut 組細(xì)胞內(nèi)MRP1、P-gp、GST-pi 蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05），Nrf2蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

Fig.2 The expressions of MRP1,P-gp,Nrf2 and GST-pi detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測各組細(xì)胞MRP1、P-gp、Nrf2、GST-pi蛋白表達(dá)

Tab.3 Comparison of relative expression levels of MRP1,P-gp,Nrf2 and GST-pi proteins between the three groups表3 各組細(xì)胞MRP1、P-gp、Nrf2、GST-pi蛋白相對表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of relative expression levels of MRP1,P-gp,Nrf2 and GST-pi proteins between the three groups表3 各組細(xì)胞MRP1、P-gp、Nrf2、GST-pi蛋白相對表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊P＜0.05；a 與0 μmol/L Lut 組比較，b 與2 μmol/L Lut 組比較，P＜0.05。

組別0 μmol/L Lut組2 μmol/L Lut組4 μmol/L Lut組F MRP1 1.15±0.10 0.78±0.13a 0.51±0.06ab 31.370＊P-gp 1.42±0.03 1.04±0.03a 0.69±0.06ab 237.800＊Nrf2 1.89±0.19a 1.18±0.17a 0.85±0.17a 27.090＊GST-pi 1.20±0.11 0.78±0.05a 0.47±0.07ab 63.940＊

3 討論

多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞同時(shí)對不同功能和作用機(jī)制的藥物產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象，化療耐藥是目前CML治療失敗的主要原因。研究證實(shí)，Lut 可以通過PI3K/Akt信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)宮頸癌細(xì)胞對阿霉素的耐藥性［7］。本研究發(fā)現(xiàn)Lut對穩(wěn)定耐藥的K562/ADR細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用，可以增強(qiáng)K562/ADR 細(xì)胞對ADR的敏感性，并且隨著Lut的濃度升高，其逆轉(zhuǎn)耐藥的效果增強(qiáng)。

目前，對化療藥物作用于腫瘤多藥耐藥的機(jī)制研究主要集中在ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的過表達(dá)，主要包括MRP1、P-gp、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）［8-9］。這類蛋白是一種跨膜蛋白，在腫瘤細(xì)胞中可以利用ATP水解酶產(chǎn)生的能量逆濃度梯度將長春新堿、ADR 等抗腫瘤藥物及GSH、葡萄糖醛酸或硫酸鹽結(jié)合的有機(jī)陰離子輸送出細(xì)胞［10］。隨著對Nrf2 轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)的深入研究，發(fā)現(xiàn)Nrf2 作為MRP1 和P-gp的上游靶點(diǎn)，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞耐藥呈正相關(guān)，當(dāng)Nrf2 過度激活時(shí)會(huì)導(dǎo)致藥物外排蛋白的過度表達(dá)［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，紫膠素P 可通過抑制PI3K/Nrf2 信號(hào)通路下調(diào)MRP1 表達(dá)，增強(qiáng)ADR 對MCF-7和K562 細(xì)胞的毒性作用［13］。橘皮素可通過抑制Nrf2 及其下游靶點(diǎn)P-gp 表達(dá)來增高非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中紫杉醇濃度，提高非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性［14］。本研究發(fā)現(xiàn)Lut 作用于K562/ADR細(xì)胞后，Nrf2、MRP1 和P-gp 表達(dá)隨Lut 濃度增高而降低，而細(xì)胞內(nèi)ADR 的蓄積量則隨Lut 濃度增高而增加，提示Lut 可通過抑制Nrf2 下調(diào)藥物外排蛋白MRP1和P-gp的表達(dá)，使細(xì)胞外排藥物減少，增加細(xì)胞內(nèi)ADR 的累積量，提高K562/ADR 細(xì)胞對ADR 敏感性。這與上述文獻(xiàn)報(bào)道的抑制Nrf2可以靶向抑制MRP1、P-gp藥物蛋白表達(dá)的研究結(jié)果一致。

GST-pi 是Ⅱ相代謝酶GST 同工酶的主要形式，在肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，其作用機(jī)制主要是通過激活腫瘤細(xì)胞膜上ATP依賴的GST，催化GSH與化療藥物結(jié)合形成復(fù)合物，然后谷胱甘肽-S 結(jié)合泵（如MRP1、P-gp 等）促進(jìn)GSH 結(jié)合物外排，從而加強(qiáng)對化療藥物的外排作用，降低化療敏感性［15-16］。大多數(shù)過表達(dá)MRP1/P-gp的耐藥細(xì)胞均維持較高的細(xì)胞內(nèi)GSH水平，以確保抗腫瘤藥物在細(xì)胞內(nèi)處于較低濃度，而這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對化療藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力與GSH水平呈正相關(guān)［17］。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)GST-pi 蛋白表達(dá)可顯著降低K562/A02 細(xì)胞對的ADR 耐藥性［18］。本研究結(jié)果顯示，Lut 可降低K562/ADR 細(xì)胞內(nèi)GST-pi 表達(dá)和GSH 含量，進(jìn)而減少細(xì)胞內(nèi)GSH-ADR 結(jié)合物生成及ADR 外排，提高K562/ADR細(xì)胞對化療藥物的敏感性，逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥。這與上述文獻(xiàn)報(bào)道的降低GST-pi、抑制MRP1及P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)功能可提高化療敏感性一致。

綜上所述，Lut 能抑制K562/ADR 細(xì)胞生長并逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥，其作用機(jī)制可能是：一方面Lut 可降低GST-pi 表達(dá)水平及細(xì)胞內(nèi)GSH 含量，從而減少GSH-ADR結(jié)合物的生成；另一方面，Lut可通過下調(diào)Nrf2 及其下游轉(zhuǎn)錄因子MRP1、P-gp 的表達(dá)，抑制K562/ADR 細(xì)胞對GSH-ADR 結(jié)合物的泵出，使細(xì)胞中ADR得到積累以增強(qiáng)ADR的療效。本研究為Lut治療CML 提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但Lut 在CML 動(dòng)物體內(nèi)的藥理作用及具體作用機(jī)制尚需深入研究。