特應(yīng)性皮炎患者血清C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員G水平及其意義

陳祥 蔣最明 李勝 顧敏 周喜桃 羅文輝 林慧 唐滿(mǎn)玲

株洲市中心醫(yī)院1檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，2腎內(nèi)科，3皮膚科（湖南株洲 412007）

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種以皮膚炎癥和皮膚屏障缺陷為特征的慢性復(fù)發(fā)性皮膚病。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與免疫、遺傳、感染和環(huán)境等因素相互作用有關(guān)，病理機(jī)制尚未闡明［1］。為此，探索發(fā)病機(jī)制，尋找合適治療靶點(diǎn)，研發(fā)新型藥物至關(guān)重要［2］。C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員G（C-type lectin domain family 4 member G，CLEC4G）是一類(lèi)含有Ca2+依賴(lài)糖識(shí)別域的蛋白超家族中的一員，是固有免疫系統(tǒng)中重要的模式識(shí)別受體，在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)以及感染、炎癥和腫瘤免疫等疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是重要的免疫檢查節(jié)點(diǎn)［3-4］。TENGVALL等［5］對(duì)9只德國(guó)牧羊犬AD病變皮膚進(jìn)行mRNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)CLEC4G是犬AD免疫失調(diào)的重要分子，但暫無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道CLEC4G是否參與人AD的發(fā)生發(fā)展。因此，本研究旨在探討CLEC4G與AD之間的關(guān)系，為AD發(fā)病機(jī)制及診療提供數(shù)據(jù)支撐。另外，AD以Th1/Th2細(xì)胞分化失衡為基本特征［6］，IL-33是IL-1家族成員，其通過(guò)結(jié)合特異性受體轉(zhuǎn)硫酶同系物（homolog of sulfotransferase，ST）2發(fā)揮作用，能有效驅(qū)動(dòng)Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生［7］，在多種自身免疫性疾病的發(fā)病中起著重要作用。分析CLEC4G與IL-33間的相關(guān)性，可為AD病理生理過(guò)程提供理論依據(jù)，對(duì)了解AD發(fā)生的分子機(jī)制及其上下游信號(hào)通路具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象觀察組：收集2020年6-10月在株洲市中心醫(yī)院皮膚科確診的60例AD患者，根據(jù)中國(guó)特應(yīng)性皮炎診療指南（2020版）［6］將AD分為兒童期（2～12歲）、青少年與成人期（12～60歲），其中男32例，女28例，年齡（16.6 ± 10.7）歲。所有患者均符合Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。

對(duì)照組：選取同期在株洲市中心醫(yī)院體檢中心和兒保中心體檢的29例健康者，其中男15例，女14例，年齡（16.5 ± 9.4）歲，排除過(guò)敏性疾病史，近期均未使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑。兩組在性別和年齡兩方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)株洲市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021161-01)，并獲得免除患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本的收集空腹時(shí)抽取受試者3～5 mL靜脈血，室溫下2 000 ×g離心10 min，吸取上清至無(wú)菌離心管中，-70 ℃冰箱保存用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2 血清CLEC4G、IL-33水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）定量測(cè)定血清CLEC4G、IL-33水平。人CLEC4G、IL-33試劑盒購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.3 血清IgE水平檢測(cè)采用Allergy Screen變應(yīng)原定量免疫綜合組試劑條（德國(guó)Mediviss公司）檢測(cè)血清IgE水平，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。選取的過(guò)敏原包括8種常見(jiàn)吸入性過(guò)敏原：戶(hù)塵螨、貓毛皮屑、狗毛皮屑、蟑螂、桑樹(shù)、柳、蒿、屋塵；8種常見(jiàn)食入性過(guò)敏原：牛奶、牛肉、芒果、腰果、蟹、貝、蝦、雞蛋白。sIgE結(jié)果為定量數(shù)據(jù)，tIgE結(jié)果為分類(lèi)數(shù)據(jù)，以≤ 100 kU/L、100～200 kU/L、≥ 200 kU/L表示。

1.2.4 外周血嗜酸性粒細(xì)胞水平檢測(cè)所有受試者均空腹下采用EDTA-2K抗凝管抽取2 mL靜脈血，采用XN-2800全自動(dòng)血液分析儀（日本Sysmex公司）檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞水平。

1.2.5 疾病嚴(yán)重程度評(píng)分根據(jù)歐洲特應(yīng)性皮炎評(píng)分指數(shù)（scoring atopic dermatitis index，SCORAD）評(píng)估AD的嚴(yán)重程度，將60例AD患者分為輕度組（29例，0～24分），中度組（20例，25～50分），重度組（11例，＞50分）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0和Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪圖；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；采用Pearson檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析；采用logistic回歸分析評(píng)估AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者外周血中CLEC4G和嗜酸性粒細(xì)胞水平與對(duì)照組相比，觀察組CLEC4G水平顯著降低（P＜0.001），觀察組內(nèi)，兒童期、青少年與成年期及男、女性患者之間，血清CLEC4G水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，嗜酸性粒細(xì)胞水平在觀察組與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 AD組與對(duì)照組外周血中CLEC4G及嗜酸性粒細(xì)胞水平比較Tab.1 Comparison of CLEC4G and eosinophils in peripheral blood between AD group and control group ±s

表1 AD組與對(duì)照組外周血中CLEC4G及嗜酸性粒細(xì)胞水平比較Tab.1 Comparison of CLEC4G and eosinophils in peripheral blood between AD group and control group ±s

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.001

組別AD組兒童期青少年與成人期男性女性對(duì)照組嗜酸性粒細(xì)胞（× 1012個(gè)/L）0.26 ± 0.23 0.27 ± 0.18 0.23 ± 0.20 0.30 ± 0.21 0.24 ± 0.30 0.22 ± 0.20例數(shù)60 29 31 28 32 29年齡（歲）16.6 ± 10.7 8.3 ± 1.9 25.2 ± 9.3 13.3 ± 7.3 17.7 ± 11.3 16.5 ± 9.4 CLEC4G（ng/L）359.4 ± 57.3*361.0 ± 64.3 357.9 ± 50.4 353.0 ± 55.3 363.4 ± 58.9 521.8 ± 48.1

2.2 AD患者血清CLEC4G水平與tIgE相關(guān)性分析60例AD患者中有41例sIgE陽(yáng)性，陽(yáng)性率為68.3%；38例tIgE陽(yáng)性，陽(yáng)性率為63.3%，其中tIgE水平≥ 200 kU/L者20例，CLEC4G水平為（351.5 ±56.6） ng/L；100～200 kU/L者18例，CLEC4G水平（337.9 ± 57.5）ng/L；tIgE ≤ 100 kU/L者22例，CLEC4G水平（384.3 ± 50.5） ng/L。tIgE ≤ 100 kU/L組CLEC4G水平顯著高于tIgE 100～200 kU/L和tIgE ≥ 200 kU/L組（P=0.010，P=0.038），但CLEC4G水平在tIgE ≥ 200 kU/L組和100～200 kU/L組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.439）。

2.3 輕度、中度和重度AD患者CLEC4G和嗜酸性粒細(xì)胞水平比較與輕度組比較，中度組CLEC4G水平顯著降低（P＜0.05），但重度組CLEC4G水平與中度組、輕度組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；嗜酸性粒細(xì)胞水平在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同嚴(yán)重程度AD患者血清CLEC4G和嗜酸性粒細(xì)胞水平Tab.2 Serum CLEC4G and eosinophils levels in AD patients with different severity ±s

表2 不同嚴(yán)重程度AD患者血清CLEC4G和嗜酸性粒細(xì)胞水平Tab.2 Serum CLEC4G and eosinophils levels in AD patients with different severity ±s

注：與輕度組相比，*P＜0.05

組別輕度組中度組重度組F值P值嗜酸性粒細(xì)胞（1012個(gè)/L）0.28 ± 0.20 0.22 ± 0.15 0.27 ± 0.21 0.578 0.786例數(shù)29 20 11 CLEC4G（ng/L）381.4 ± 49.6 325.5 ± 52.8*363.1 ± 58.9 10.490 0.005

2.4 AD患者血清CLEC4G與IL-33水平比較與對(duì)照組［（221.2 ± 47.4）ng/L］相比，觀察組［（358.1± 51.1）ng/L］血清IL-33水平顯著升高（P＜0.001）。AD患者血清CLEC4G與IL-33之間并無(wú)顯著相關(guān)性（r=0.090，P=0.495）。

2.5 AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素分析以AD發(fā)病為自變量，以年齡、性別、CLEC4G、IL-33為協(xié)變量，采用logistic回歸分析評(píng)估AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素。結(jié)果顯示，年齡＜14歲和IL-33為AD發(fā)病的危險(xiǎn)因子，OR值分別為2.584、1.241，95%可信區(qū)間（confidenceinterval，CI）分別為1.004～6.647、1.030～1.495；而CLEC4G為AD的保護(hù)因子（OR=0.890，95%CI：0.809～0.979）。見(jiàn)表3。

表3 AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素分析Tab.3 Analysis of risk factors for the incidence of AD

3 討論

AD是一種異質(zhì)性皮膚疾病，因免疫因子表達(dá)不同，其癥狀和療效存在差異［9］。大多數(shù)輕中度AD患者接受外用藥物、潤(rùn)膚劑和口服藥物等將會(huì)獲得較好的療效，但部分中度至重度AD患者的治療效果不佳，通常需使用免疫抑制劑和生物制劑。因此，了解AD免疫失調(diào)的分子機(jī)制，根據(jù)臨床癥狀和免疫因子制定個(gè)體化治療具有重要意義［10］。

CLEC4G是固有免疫系統(tǒng)中重要的模式識(shí)別受體，在筆者先前的研究中，CLEC4G被發(fā)現(xiàn)是維持肝臟正常免疫功能重要的宿主因子，隨著肝臟免疫系統(tǒng)的失調(diào)，其表達(dá)減少［11-12］。因此，探討CLEC4G是否也參與AD免疫功能失調(diào)，引起了筆者極大的興趣。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者血清CLEC4G水平顯著降低，表明CLEC4G可能是AD發(fā)病的宿主保護(hù)因子，但這與TENGVALL［5］等在德國(guó)牧羊犬病變皮膚中的檢測(cè)結(jié)果相反，可能與不同物種，不同組織等有關(guān)，尚需在AD患者病變皮膚中進(jìn)一步確認(rèn)。研究發(fā)現(xiàn)兒童期和青少年與成人期AD及男、女性AD患者血清中CLEC4G水平無(wú)顯著差異，可能與CLEC4G作為固有免疫系統(tǒng)分子，均參與不同類(lèi)型AD的發(fā)病。但由于本研究入組AD患者數(shù)量較少，也沒(méi)收集到嬰兒及老年期患者標(biāo)本，需要在更多樣AD人群中驗(yàn)證CLEC4G水平。

嗜酸性粒細(xì)胞、血清tIgE及sIgE檢測(cè)是中國(guó)AD實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)［6］，部分病例會(huì)隨AD病情加重而升高，對(duì)AD診斷有重要參考價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞在兒童期和青少年與成人期AD及男、女性AD患者中無(wú)顯著差異。另外，60例AD患者血清tIgE陽(yáng)性率為63.3%，sIgE陽(yáng)性率為68.3%，表明本地區(qū)大多數(shù)為外源性AD患者，這與前人報(bào)道結(jié)果一致［13］。此外，研究發(fā)現(xiàn)CLEC4G水平在tIgE ≤ 100 kU/L組中顯著升高，但在tIgE ≥200 kU/L組和100～200 kU/L組間無(wú)顯著區(qū)別，這表明一定程度上，CLEC4G可作為外源性AD輔助診斷指標(biāo)。

AD根據(jù)SCORAD評(píng)分可分為輕、中、重三組，評(píng)估與疾病嚴(yán)重程度之間的關(guān)系是臨床應(yīng)用價(jià)值重要的研究?jī)?nèi)容。本研究發(fā)現(xiàn)，與輕度組比較，中度組CLEC4G水平顯著降低，但重度組CLEC4G水平與中度組、輕度組間無(wú)顯著差異，這可能與實(shí)驗(yàn)樣本量不夠有關(guān)，也可能與AD免疫失調(diào)后觸發(fā)負(fù)反饋機(jī)制有關(guān)［14］。

另一方面，IL-33是驅(qū)動(dòng)AD發(fā)病時(shí)Th1/Th2細(xì)胞分化失衡的細(xì)胞因子［7］，本研究也驗(yàn)證了IL-33在AD患者血清中的水平，與QIU等［15］研究結(jié)果一致，IL-33在AD患者血清中水平顯著升高，IL-33是AD發(fā)病的危險(xiǎn)因子，但CLEC4G與IL-33之間并無(wú)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明CLEC4G可能是獨(dú)立于IL-33介導(dǎo)AD發(fā)病的保護(hù)因子。

最后，本研究對(duì)AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，年齡小于14歲和IL-33為AD發(fā)病的危險(xiǎn)因子，年紀(jì)大于14歲和CLEC4G為AD的保護(hù)因子，性別與AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。這與AD好發(fā)于兒童期的事實(shí)一致，但其中生物學(xué)依據(jù)有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，本文初步探討了AD患者血清CLEC4G水平及其臨床意義，雖然樣本量不大，但入組對(duì)象均有典型的臨床癥狀，所以具有一定的代表性和可信度，為AD發(fā)病新機(jī)制及診療提供了新的數(shù)據(jù)。