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    基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激應(yīng)答的膠質(zhì)瘤風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建

    2023-12-22 01:06:56帕拉沙提斯然王濤陳珂周嘉懿徐健蓉李寧寧
    實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2023年21期
    關(guān)鍵詞:分析模型

    帕拉沙提·斯然 王濤 陳珂 周嘉懿 徐健蓉 李寧寧

    1西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院(四川綿陽(yáng) 621010);2中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院托馬斯·林達(dá)爾諾獎(jiǎng)科學(xué)家實(shí)驗(yàn)室(廣東深圳 518107)

    膠質(zhì)瘤作為原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,發(fā)病率高[1-3]?,F(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)IDH分型,治療以手術(shù)為主,輔以放化療,但匱乏靶向藥物[4]。在顱外腫瘤中,取得顯著療效的藥物受限于對(duì)膠質(zhì)瘤患者響應(yīng)亞群難以精準(zhǔn)識(shí)別的問(wèn)題[5-6]。因此,亟需新型精準(zhǔn)診斷判別體系,以輔助錨定高度響應(yīng)的患者。

    在膠質(zhì)瘤惡性演進(jìn)過(guò)程中,壓力刺激可能會(huì)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激應(yīng)答(ERS),重塑細(xì)胞表型,并促進(jìn)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)[7]。但當(dāng)ERS超過(guò)負(fù)荷時(shí),會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。這提示,靶向ERS可能成為膠質(zhì)瘤精準(zhǔn)診療的一種新思路。因此,本研究的目標(biāo)是建立基于ERS分級(jí)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型,以精準(zhǔn)判別預(yù)后和惡性進(jìn)展表型,為膠質(zhì)瘤靶向藥物的研發(fā)提供新方向。

    1 材料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)集和數(shù)據(jù)收集從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)(xena.ucsc.edu)和中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜(CGGA)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.cgga.org.cn/index.jsp)中,篩選和選取具有完整臨床信息的測(cè)序數(shù)據(jù)(TCGA,n=683;CGGA,n=517)。將TCGA數(shù)據(jù)(IDHmt:IDHwt=508:175)和CGGA數(shù)據(jù)(CGGA325:IDHmt:IDHwt=101:175;CGGA693:IDHmt:IDHwt=176:65)分別作為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集。通過(guò)使用Limma數(shù)據(jù)包,進(jìn)行差異基因分析(|logFC|>1.5,P<0.005),并在與HALLMARK_UNFOLDED_PROTEIN_RESPONSE基因集交集中篩選顯著差異基因。接下來(lái),運(yùn)用單基因生存期分析、蛋白互作、Lasso-Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析和Spearman相關(guān)性分析,構(gòu)建一個(gè)包含7個(gè)ERS相關(guān)基因的膠質(zhì)瘤風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。最后,通過(guò)Kaplan-Meier分析和ROC曲線,明確該模型對(duì)于高、低風(fēng)險(xiǎn)與患者生存期差異的相關(guān)性與預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。

    在表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行Log2和Z-score標(biāo)準(zhǔn)化后,明確7個(gè)ERS風(fēng)險(xiǎn)因子表達(dá)與經(jīng)典膠質(zhì)瘤病理分級(jí)、分子分型之間的相關(guān)性,并使用Pheatmap包和ggplot2包分別創(chuàng)建相關(guān)熱圖和箱圖展示這些相關(guān)性。

    使用診斷性ROC分析,明確CD44(惡性進(jìn)展)或GPR158(有利預(yù)后)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的相關(guān)性。在整合訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的數(shù)據(jù),采用ggplot2繪制點(diǎn)圖和熱圖分別展示CD44/GPR158與ERS風(fēng)險(xiǎn)因子表達(dá)的相關(guān)性。

    1.2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)z質(zhì)瘤臨床樣本20例(IDHwt:IDHmt=10:10)取自中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院和中山大學(xué)腫瘤防治中心,標(biāo)本通過(guò)病理學(xué)評(píng)估,并附有詳細(xì)的臨床病理資料。所有患者均簽署知情同意書(shū),本課題由中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院倫理研究委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào):KY-2021-065-01)。

    膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本(IDHwt:IDHmt=5:5),進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。檢測(cè)基因的引物序列見(jiàn)表1。同時(shí),另外10例患者(IDHwt:IDHmt=5:5)標(biāo)本被制作成石蠟切片,并通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)HSP90B1(Cell Signaling Technology,4874)、HSP5A(Cell Signaling Technology,3177)和CD44(Cell Signaling Technology,37295)的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)采用DAB染色,陽(yáng)性結(jié)果顯色為黃褐色。

    表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在本研究中,R語(yǔ)言和Graph Pad Prism 9.4.1作為統(tǒng)計(jì)分析工具。按中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分類(lèi)后,使用χ2檢驗(yàn)確定樣本間的臨床特征差異。t檢驗(yàn)被用于進(jìn)行組間比較。此外,Pearson相關(guān)分析用來(lái)評(píng)估相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 利用顯著高表達(dá)的7個(gè)ERS相關(guān)基因構(gòu)建膠質(zhì)瘤分級(jí)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型首先,根據(jù)IDH基因型并利用TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析(|LogFC|>1.5,P<0.05),并與Hallmark_Unfolded_Protein_Response(UPR)基因集進(jìn)行交集分析,篩選出在IDHmt型膠質(zhì)瘤中顯著表達(dá)的41個(gè)UPR/ERS基因以及在IDHwt型膠質(zhì)瘤樣本中顯著高表達(dá)的50個(gè)UPR/ERS基因(圖1A)。接著,通過(guò)單變量Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析,發(fā)現(xiàn)有33個(gè)UPR/ERS基因與膠質(zhì)瘤不良預(yù)后之間存在顯著相關(guān)性(圖1B)。最后,通過(guò)Lasso + Cox生存分析方法(圖1C和D)篩選出7個(gè)關(guān)鍵基因,用以構(gòu)建ERS分級(jí)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)計(jì)算公式為:風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)=(0.128 4 *KDELR3)+(0.529 5 * SHC1)+(0.004 3 * DNAJC3)+(0.890 3 * PDIA6)+(-0.119 9 * CALR)+(0.496 4 *HSP90B1)+(-0.752 1 * HSPA5)(圖1C-D)。

    圖1 構(gòu)建基于7個(gè)UPR基因的Cox風(fēng)險(xiǎn)模型以預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤的預(yù)后Fig.1 Characterization of 7 ERS risk signature genes to predict the prognosis of glioma

    2.2 ERS模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)分析及預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性評(píng)估Kaplan-Meier分析顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組(高于中位風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù))的患者預(yù)后明顯不如低風(fēng)險(xiǎn)組患者(圖2A-B)。時(shí)間依賴(lài)性ROC曲線評(píng)估顯示,在1年時(shí),預(yù)后的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性超過(guò)0.7(TCGA:0.74;CGGA:0.82),在3年時(shí)超過(guò)0.76(TCGA:0.77;CGGA:0.80),在5年時(shí)超過(guò)0.62(TCGA:0.63;CGGA:0.75)(圖2C-D)。這些結(jié)果表明,與ERS相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因子在預(yù)測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后方面表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性。

    圖2 評(píng)估ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子預(yù)測(cè)預(yù)后的能力Fig.2 Assessment of the prognostic prediction ability of the ERS-related risk signature

    2.3 ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子與膠質(zhì)瘤經(jīng)典分子分型和病理級(jí)別的關(guān)聯(lián)性分析ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子是否與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的臨床病理分級(jí)存在關(guān)聯(lián)?針對(duì)訓(xùn)練集(TCGA)和驗(yàn)證集(CGGA)的數(shù)據(jù)分析顯示,以IDH基因型分組,這7個(gè)ERS風(fēng)險(xiǎn)基因在IDHwt組中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)(圖3A-B)。進(jìn)一步,在根據(jù)WHO病理分級(jí)進(jìn)行的分組中,與Grade 2相比,這7個(gè)ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子在Grade 3膠質(zhì)瘤中均呈現(xiàn)顯著高表達(dá)(圖3C-D)。通過(guò)上述分析結(jié)果的驗(yàn)證,ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子能夠有效區(qū)分不同膠質(zhì)瘤患者的經(jīng)典分子分型和病理分級(jí)特征。

    圖3 ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子在膠質(zhì)瘤患者中根據(jù)WHO分級(jí)劃分的診斷價(jià)值Fig.3 Diagnostic values of ERS risk signature genes in glioma patients based on WHO grade classification.

    2.4 ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展表型的關(guān)聯(lián)性分析在膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展過(guò)程中,CD44在促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)亞型轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮著重要作用,并與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)和預(yù)后密切相關(guān)[9-12]。Pearson相關(guān)性分析顯示,CD44與ERS風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分顯著正相關(guān)(圖4A)。此外,箱圖顯示,在ERS高風(fēng)險(xiǎn)組中CD44表達(dá)顯著升高(圖4B)。進(jìn)一步分析顯示,在將患者根據(jù)CD44表達(dá)的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組后,ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子在CD44低表達(dá)的患者中也呈現(xiàn)低表達(dá)(圖4C和D)。

    圖4 ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展表型的關(guān)系Fig.4 The correlation between ERS-related risk signatures and malignant phenotypes of glioma.

    G蛋白偶聯(lián)受體GPR158的表達(dá)隨膠質(zhì)瘤級(jí)別升高而逐級(jí)顯著降低,可作為分級(jí)預(yù)后標(biāo)志物;此外,GPR158的高表達(dá)能夠有效抑制膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展[13-14]。為進(jìn)一步驗(yàn)證ERS風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)膠質(zhì)瘤級(jí)別和惡性進(jìn)展表型評(píng)估的獨(dú)立性,研究根據(jù)GPR158的表達(dá)中位數(shù)將TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,然后比較這兩組中ERS風(fēng)險(xiǎn)因子的表達(dá)趨勢(shì)。熱圖分析顯示,在GPR158低表達(dá)組中,ERS高風(fēng)險(xiǎn)因子的表達(dá)水平顯著增加(圖4E-F)。此外,Pearson相關(guān)性分析結(jié)果提示GPR158與ERS風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間呈顯著負(fù)相關(guān)(圖4G)。最后,診斷性ROC曲線顯示,ERS風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展表型的準(zhǔn)確性超過(guò)0.7(圖4H)。綜上所述,這些研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了ERS風(fēng)險(xiǎn)因子在準(zhǔn)確預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展表型方面的重要能力。

    2.5 ERS風(fēng)險(xiǎn)因子在不同IDH基因型臨床膠質(zhì)瘤樣本中的表達(dá)差異分析經(jīng)臨床樣本的qRT-PCR分析顯示,在IDHwt膠質(zhì)瘤樣本中,7個(gè)ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子的表達(dá)顯著高于IDHmt樣本(IDHwt∶IDHmt=10 ∶ 10),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5A)。鑒于DNAJC3、CALR、PDIA6、SHC1和KDELR3缺乏適用于免疫組化級(jí)別的抗體,因此選取ERS風(fēng)險(xiǎn)因子(HSP90B1和HSPA5)與惡性表型標(biāo)志物(CD44)一同作為免疫組化實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)(圖5B)。免疫組化結(jié)果表明,在IDHwt膠質(zhì)瘤樣本中,風(fēng)險(xiǎn)因子HSP90B1和HSPA5以及CD44的表達(dá)明顯高于IDHmt膠質(zhì)瘤樣本(IDHwt∶IDHmt=5∶5),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖 5C)。

    圖5 ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子因子在不同IDH基因型臨床膠質(zhì)瘤樣本中的表達(dá)比較Fig.5 Comparison of the expression of UPR risk signature factors in clinical glioma samples with different IDH genotypes

    3 討論

    本研究基于美中兩國(guó)公共膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)庫(kù)(TCGA和CGGA)的RNA-seq數(shù)據(jù),成功篩選出7個(gè)ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因,并建立了一個(gè)具備病理分級(jí)和預(yù)后預(yù)測(cè)功能的風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。該模型在預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤患者的短期生存期(1年和3年)方面表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性(AUC>0.74)。此外,通過(guò)生物信息學(xué)分析和臨床樣本驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)ERS高風(fēng)險(xiǎn)組與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)程標(biāo)志物CD44呈顯著正相關(guān),而與代表有利預(yù)后的前神經(jīng)元標(biāo)志物GPR158之間呈顯著負(fù)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示,該模型能夠較為準(zhǔn)確地指征膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展表型。

    目前,現(xiàn)行的臨床診斷體系分類(lèi)器在與膠質(zhì)瘤靶向藥物相匹配方面存在挑戰(zhàn),例如,盡管IDH突變抑制劑在急性髓細(xì)胞性白血病的靶向治療中取得顯著療效[15],但在膠質(zhì)瘤治療方面仍處于臨床試驗(yàn)階段[16-18]。這可能是由于IDHmt以及代謝產(chǎn)物D2HG對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表觀遺傳調(diào)控以及代謝重編程產(chǎn)生重要影響,使得精確的靶向治療變得困難[19]。同樣,針對(duì)膠質(zhì)瘤的治療嘗試了多種與現(xiàn)行臨床診斷分類(lèi)系統(tǒng)相對(duì)獨(dú)立的靶向策略[20-23]和免疫療法[24-25]。然而,由于缺乏適應(yīng)于臨床診斷分類(lèi)的準(zhǔn)確分類(lèi)器,上述努力均難以確定高度響應(yīng)的患者亞群。這也成為當(dāng)前膠質(zhì)瘤靶向治療和未來(lái)特異性靶向藥物開(kāi)發(fā)所面臨的重要限制因素。

    在新版的《Hallmarks of Cancer:New Dimensions》一文中,表型可塑性被提升為腫瘤標(biāo)志性事件之一,強(qiáng)調(diào)了深入探索和驗(yàn)證其機(jī)制的重要性[26],也提示未來(lái)在研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)以及耐藥時(shí),需要從基因型和細(xì)胞表型的綜合角度進(jìn)行考慮。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到內(nèi)部或微環(huán)境壓力刺激時(shí),會(huì)觸發(fā)ERS,從而改變轉(zhuǎn)錄、翻譯和表觀修飾水平,重新塑造腫瘤細(xì)胞表型,以適應(yīng)潛在的致死性壓力,增強(qiáng)其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)能力[7]。因此,推測(cè)ERS或是調(diào)控腫瘤表型可塑性的重要源頭途徑。有學(xué)者[27-28]證實(shí)ERS可以驅(qū)動(dòng)結(jié)直腸癌細(xì)胞表型可塑性;同時(shí),WANG等[29]發(fā)現(xiàn)IDH突變介導(dǎo)的ERS調(diào)控膠質(zhì)瘤微環(huán)境中腫瘤相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞極性可塑性。這些研究提示,ERS信號(hào)通路元件可能是調(diào)控膠質(zhì)瘤實(shí)質(zhì)及其微環(huán)境表型可塑性的關(guān)鍵組分。因此,在本研究中,構(gòu)建了一個(gè)ERS風(fēng)險(xiǎn)回歸模型,并通過(guò)生物信息學(xué)分析和臨床樣本驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)該模型高風(fēng)險(xiǎn)組與惡性進(jìn)展表型標(biāo)志物如CD44呈顯著正相關(guān),與良好預(yù)后標(biāo)志物GPR158呈顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示,ERS風(fēng)險(xiǎn)特征能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展表型,為未來(lái)臨床靶向治療提供新的方向。

    ERS是腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界和內(nèi)在壓力的重要調(diào)控通路,對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、存活、分化和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)提供關(guān)鍵保障[16-18]。然而,它是一個(gè)雙刃劍,壓力過(guò)度亦會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。多項(xiàng)研究表明,IDHmt提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)于ERS的敏感性,激活PERK/ATF4信號(hào)軸,從而抑制腫瘤的增殖和侵襲能力,促進(jìn)凋亡[8,30-31]。例如,JOHNSON等[32]發(fā)現(xiàn)ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(Thapsigargin)可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。Hallahan團(tuán)隊(duì)也報(bào)道ERS增強(qiáng)GBM對(duì)于放療敏感性[33]。近期,WANG等[29]發(fā)現(xiàn)激活膠質(zhì)瘤細(xì)胞PERK通路推動(dòng)腫瘤相關(guān)小膠質(zhì)瘤細(xì)胞抗癌極化激活。基于這種機(jī)制,針對(duì)ERS進(jìn)行靶向治療可能成為一種新的方法,通過(guò)殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞來(lái)抑制腫瘤的惡性進(jìn)程,為開(kāi)發(fā)全新的藥物靶向策略提供了潛在的方向。

    綜上所述,本研究建立了一套新型的腦膠質(zhì)瘤(除GBM外)分級(jí)預(yù)后體系,不僅能夠準(zhǔn)確識(shí)別膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展表型,還能有效地橋接現(xiàn)行腦膠質(zhì)瘤臨床分子診斷體系與靶向治療所涉及的內(nèi)在分子機(jī)制。前期報(bào)道指出IDHwt和IDHmt這兩類(lèi)膠質(zhì)瘤本質(zhì)上屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激耐受和敏感型腫瘤,基于這一發(fā)現(xiàn),本研究中合理猜測(cè):未來(lái)設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)與ERS相關(guān)的靶向藥物可能會(huì)從這個(gè)新型風(fēng)險(xiǎn)模型中受益,從而彌補(bǔ)IDH分子分型無(wú)法精準(zhǔn)鎖定響應(yīng)患者亞群的不足。此外,還認(rèn)為:圍繞分子靶點(diǎn)或信號(hào)通路開(kāi)展的靶向藥物設(shè)計(jì)或可借鑒本研究的模型方法,即構(gòu)建臨床診斷體系與待開(kāi)發(fā)靶向機(jī)制的融合模型,從而更為有效地提高靶向藥物的適配度。

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