下調(diào)硫酸乙酰肝素酶減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的機制

李招兵 劉雨露 黃云輝

南華大學衡陽醫(yī)學院附屬南華醫(yī)院心血管內(nèi)科（湖南衡陽 421002）

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion，MI/R），因其多種復(fù)雜的機制參與心肌細胞死亡，使得I/R損傷的防治變得更加棘手［1-2］。文獻報道，I/R損傷的機制包括ROS富集、鈣超載、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等［3-5］。通過探討其調(diào)控的病理過程的關(guān)鍵靶標分子，為臨床篩選潛在的心臟保護藥物提供依據(jù)。

硫酸乙酰肝素酶（Heparanase，HPSE）是能降解細胞表面和細胞外基質(zhì)中的硫酸肝素的內(nèi)切葡萄糖醛酸酶，調(diào)控細胞黏附、增殖和遷移［6-7］。NODA等［8］研究發(fā)現(xiàn)，低表達HPSE介導(dǎo)NF-κB信號途徑，從而抵抗肺I/R。也有文獻報道，HPSE抑制劑可以減輕胰島細胞未折疊蛋白反應(yīng)及氧化應(yīng)激，減輕細胞的凋亡［9］。因此，筆者推測下調(diào)HPSE基因可以保護心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞的損傷。本研究旨在探討下調(diào)HPSE抑制UPRmt信號通路對缺血再灌注心肌細胞的影響，為MI/R的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MI/R動物模型及分組60只健康成年SD雄性大鼠，10～12周齡，280～320 g，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，使用許可證號SYXK（湘）2020-0002，本實驗經(jīng)過南華大學動物倫理委員會批準同意。飼養(yǎng)于溫度為25～28 ℃，濕度為40%～50%的SPF級環(huán)境。

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，利用隨機數(shù)字表將大鼠分為對照組、I/R組、I/R+shRNA-NC組和I/R+Heparanase-shRNA組，每組15只。對照組開胸后僅穿線但不結(jié)扎，其他各組大鼠均采用結(jié)扎冠脈左前降支的手術(shù)方式制備MI/R模型［10］，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）麻醉，并用動物呼吸器通氣，潮氣量（6～8 mL/kg），呼吸機頻率（80次/min）。夾趾無退縮后于左心耳根部下方2 mm進針，肺動脈圓錐旁出針結(jié)扎左前降支，當心尖處變蒼白、心臟搏動減弱，完全結(jié)扎時于針線上方墊一直徑為1.0 mm適當長度的棉線并打活結(jié)，30 min后解開結(jié)扎線，然后再灌注3 h，逐層縫合后關(guān)胸，術(shù)后注意保溫。動脈結(jié)扎后使用心電圖檢測結(jié)果顯示ST段上抬0.1 mV以上，持續(xù)30 min后打開結(jié)扎線，恢復(fù)血流灌注，心電圖顯示結(jié)扎后ST段下降1/2以上視為造模成功。

1.2 藥物與試劑白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） ELISA試劑盒均購自武漢菲恩生物科技有限公司；肌紅蛋白（myohemoglobin，Mb）試劑盒子、肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）和心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin，cTnI）試劑盒均購自上海基免實業(yè)有限公司；Caspase-3/鼠抗（美國CST公司）、Bax/鼠抗（上海碧云天生物科技有限公司）、Bcl-2/鼠抗（Proteintech Technology，Inc）、Heparanase/兔抗（GeneTex，Inc）、HSP70/兔抗（武漢華美生物工程有限公司）、LonP1/兔抗（Proteintech Technology，Inc）和ACTIN/兔抗（Proteintech Technology，Inc）；蘇木素、伊紅（購自北京索萊寶科技有限公司）；中性甲醛、乙醇、二甲苯（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）檢測試劑盒均購自普利萊基因技術(shù)有限公司；二抗抗鼠和抗兔（Proteintech Technology，Inc）。

1.3 主要儀器超速離心機（美國Beckman Optima公司，型號：MAX-130K）、-20 ℃冰箱（德國Siemens公司）、-80 ℃超低溫冰箱（美國Thermo Scientific公司，型號：Forma 900）、Synergy? HT多功能酶標儀（USA Bio-Tek Instruments，Inc.，型號：iMark）、微型垂直電泳槽及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號：VE 180）、凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號：2500R，1600R）。

1.4 構(gòu)建Heparanase-shRNA的載體本實驗中使用的Heparanase-shRNA和NC-shRNA均購自上海吉凱基因生物有限公司。設(shè)計靶向硫酸乙酰肝素酶RNA干擾序列，合成靶序列的雙鏈DNA，接入pGCL-GFP載體，PCR篩選陽性克隆，測序鑒定。包裝產(chǎn)生具備感染能力的慢病毒：（1）293T細胞購于中國科學院細胞庫，細胞用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，將細胞放于37 ℃（含5℅CO2）細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔24 h給細胞換1次培養(yǎng)基，每當細胞密度為70%～80%時，將細胞傳代，分瓶培養(yǎng)。（2）用pHelper1.0和pHelper2.0質(zhì)粒與相應(yīng)體積的轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫下靜置15 min。293T細胞用PBS洗3遍，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基15 mL。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入到細胞培養(yǎng)液中，充分混勻后，將細胞放于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～12 h后，給細胞換液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。（3）檢測病毒的滴度（1 × 108TU/mL）后，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠通過尾靜脈注射含50 μg Heparanase-shRNA的生理鹽水0.2 mL，I/R+shRNA-NC組大鼠尾靜脈注射含50 μg NC-shRNA的生理鹽水0.2 mL，其余兩組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.5 Western blot檢測蛋白表達水平取上述處死的大鼠心肌組織，剪取0.025 g組織，用冰預(yù)冷PBS洗組織，加入300 μL RIPA裂解液于生物樣品均質(zhì)儀中反復(fù)研磨組織直至看不見組織塊；冰上，裂解10 min；4 ℃，12 000 r/min離心 15 min；將離心后的上清轉(zhuǎn)至1.5 mL的離心管中；取200 μL蛋白上清，加入50 μL 5×loading buffer混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，用1×TBST將PVDF膜置搖床上洗凈麗春紅，隨后將放入5%的脫脂牛奶中，使PVDF膜全部浸入牛奶中，在常溫下封閉2 h，按照蛋白抗體說明書稀釋一抗，將膜置于4 ℃冰箱孵育過夜。次日用TBST洗滌PVDF膜3～5次。洗完后室溫下孵育相應(yīng)種屬的二抗1 h，TBST洗滌4～5次，每次20 min。打開全自動凝膠成像系統(tǒng)，將PVDF膜置于成像板上，滴加適量的超敏ECL化學發(fā)光試劑，檢測蛋白含量。用AlphaImager2200-灰度掃描軟件統(tǒng)計灰度值，以ACTIN為內(nèi)參蛋白，對目的蛋白進行半定量分析。

1.6 大鼠心臟功能及心肌損傷標記物檢測使用DW-T6彩色多普勒超聲儀連接小動物Medlab生物信號采集系統(tǒng)檢測各組大鼠心率（heart rate，HR）、左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室壁厚度（left ventricular wall thickness，LVWT）及再灌注末經(jīng)腹主動脈取血100 μL，靜置后以3 000 r/min離心15 min，分離血清，ELISA檢測血清MB、CK-MB和cTnI水平。

1.7 氧化應(yīng)激物質(zhì)檢測完成大鼠心臟功能檢測后從頸總動脈插管接取0.5 mL 大鼠血液，離心（1 000 ×g，20 min），取上清液留存在-20 ℃冰箱。以ELISA法檢測血清SOD、MDA的含量（具體操作依據(jù)該使用說明書）。

1.8 大鼠心肌病理情況觀察完成大鼠心肌損傷標記物檢測后斷脖法處死大鼠，取大鼠心肌組織，使用二甲苯浸泡后使用梯度乙醇脫水，蘇木精浸泡后鹽酸乙醇分化、氨水沖洗，分別使HE染色和TUNEL染色中性樹膠封片，在400倍鏡觀察大鼠心肌細胞狀態(tài)，并隨機選取5個視野統(tǒng)計心肌細胞凋亡率。

1.9 炎癥因子檢測取上述大鼠外周血，在低溫離心機中以 3 000 r/min離心15 min，取上清液嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6和TNF-α含量水平。

1.10 統(tǒng)計學方法本研究數(shù)據(jù)分析采用軟件為SPSS 22.0，本研究作圖采用軟件為GraphPad Prism5，多組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠Heparanase蛋白相對表達的檢測Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，I/R組大鼠Heparanase蛋白相對表達顯著升高（t=24.03，P＜0.01）；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+HeparanaseshRNA組Heparanase蛋白相對表達顯著降低（t=13.18，P＜0.01），見圖1。

2.2 大鼠心臟功能和心肌損傷標記物的檢測檢測大鼠心臟功能以及心肌損傷標記物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，I/R組大鼠HR、LVEF、LVWT均顯著降低，CK-Mb、cTnI、Mb水平均顯著升高（P＜0.05）；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+HeparanaseshRNA組HR、LVEF、LVWT均顯著升高，CK-Mb、cTnl、Mb水平均顯著降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 大鼠心臟功能以及心肌損傷標記物的檢測Fig.2 Detection results of cardiac function and myocardial injury markers in rat myocardium

2.3 TUNEL及HE染色觀察大鼠心肌病理改變TUNEL染色觀察大鼠心肌組織發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，I/R組大鼠心肌細胞凋亡率顯著升高（t=55.51，P＜0.01）；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠心肌細胞凋亡率顯著降低（t=32.66，P＜0.01），見圖3A。由HE染色觀察大鼠心肌組織可以看出，Control組大鼠心肌組織、肌外膜、心肌纖維均正常且完整；I/R組大鼠和I/R+shRNA-NC組大鼠心肌纖維彎曲，肌紅蛋白溶解，同時心肌肌細胞核固縮、溶解，肌束膜破裂；I/R+Heparanase-shRNA組大鼠心肌組肌外膜較為完整、心肌纖維彎曲顯著改善，見圖3B。

圖3 TUNEL及HE染色觀察大鼠心肌病理改變（400 ×）Fig.3 Observation the pathological changes of rat myocardium by TUNEL and HE staining in rat myocardium（400 ×）

2.4 大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白的檢測據(jù)Western blot方法檢測各組凋亡蛋白表達發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，I/R組大鼠Caspase-3蛋白相對表達水平顯著升高（t=8.61，P＜0.01）、Bax蛋白相對表達水平顯著升高（t=9.04，P＜0.01），Bcl-2蛋白相對表達水平顯著降低（t=14.51，P＜0.01）；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組Caspase-3蛋白相對表達水平顯著降低（t=7.27，P＜0.01）、Bax蛋白相對表達水平顯著降低（t=15.85，P＜0.01），而Bcl-2蛋白相對表達水平顯著升高（t=11.86，P＜0.01），見圖4。

圖4 大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白檢測Fig.4 Detection of apoptosis-related proteins in rat myocardium

2.5 大鼠血清氧化應(yīng)激標記物及炎癥因子檢測檢測大鼠氧化應(yīng)激標記物及炎癥因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，I/R組大鼠MDA、IL-6、TNF-α水平顯著升高，SOD水平顯著降低（P＜0.05）；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組MDA、IL-6、TNF-α水平顯著降低，SOD水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

圖5 大鼠血清氧化應(yīng)激標記物及炎癥因子檢測Fig.5 Detection the serum oxidative stress markers and inflammatory factors in rat myocardium

2.6 大鼠心肌組織UPRmt標志蛋白檢測據(jù)Western blot方法檢測凋亡蛋白發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，I/R組大鼠HSP70蛋白相對表達水平顯著上升（P＜0.05）；LonP1蛋白相對表達水平顯著下降（P＜0.05）；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠HSP70、LonP1蛋白相對表達水平顯著上升（P＜0.01），見圖6。

圖6 大鼠心肌組織UPRmt標志蛋白檢測Fig.6 Detection the UPRmt marker proteins in rat myocardium

3 討論

及時恢復(fù)堵塞冠脈的血流是實現(xiàn)挽救缺血心肌細胞的最有效方法［11-13］。然而，再灌注是一把“雙刃劍”，除了挽救缺血心肌外，還會引起新的心肌細胞死亡，即再灌注損傷［14-16］。到目前為止，臨床上較好的預(yù)防或治療再灌注損傷的方法和藥物還亟待解決。

心肌缺血再灌注發(fā)生前會導(dǎo)致氧自由基及炎癥因子的大量釋放，從而引起心肌僵硬和損傷，心臟功能障礙［17-19］。因此，早期精準清除氧自由基和炎癥因子能夠有效緩解心肌損傷和心臟功能障礙。崔勤濤等［20］研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI水平明顯升高，SOD和GSH含量降低，MDA含量升高，經(jīng)下調(diào)的長鏈非編碼RNA核內(nèi)富集轉(zhuǎn)錄物1預(yù)處理后，其心肌損傷明顯好轉(zhuǎn)，氧化應(yīng)激和炎癥水平顯著降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Heparanase的表達后，心肌缺血再灌注大鼠心臟功能明顯好轉(zhuǎn)，心肌病理損傷得到改善，心肌氧化應(yīng)激水平降低。同時與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠MDA、IL-6、TNF-α表達水平顯著下降，而SOD水平顯著升高，說明下調(diào)HPSE基因的表達后，炎癥因子水平顯著降低，提示大鼠體內(nèi)的炎癥和氧化應(yīng)激水平得到有效的抑制，與WANG等［21］研究結(jié)果相一致。因此，下調(diào)Heparanase可降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，從而緩解大鼠心肌損傷。

前期研究結(jié)果顯示：心肌缺血再灌注損傷組大鼠心肌病理損傷程度、心肌損傷標記物、氧化應(yīng)激和炎癥因子含量水平明顯升高，而大鼠EF、LVSP、FS明顯低下，心肌病理損傷嚴重，CK-MB、Mb和cTnI升高明顯［22］。通過檢測大鼠心肌血流動力學情況發(fā)現(xiàn)：與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠HR、LVEF、LVWT均顯著升高，而CK-Mb、cTnI、Mb表達水平均顯著降低，說明下調(diào)HPSE后，大鼠心臟跳動能力增強同時心臟收縮能力增強，表明大鼠心臟功能明顯改善；也表明了下調(diào)HPSE后，大鼠心肌細胞得到了有效的保護，細胞破裂顯著減少，使得細胞中的相關(guān)酶進入血液減少，緩解心肌組織受損，與PEI等［23］研究結(jié)果一致。

氧化應(yīng)激與炎癥因子之間的惡性循環(huán)直接攻擊損傷的心肌細胞導(dǎo)致膜通透性顯著增加，最終破壞促凋亡與抑凋亡之間的穩(wěn)態(tài)，進一步加重心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠Caspase-3、Bax蛋白相對表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白相對表達水平顯著升高。說明下調(diào)HPSE基因的表達后，心肌細胞中凋亡基因受到抑制，抗凋亡基因受到了促進，心肌細胞凋亡得到了明顯的改善，保護MI/R，與NGUYUEN等［24］研究結(jié)果一致。

眾所周知，不良應(yīng)激刺激可誘發(fā)線粒體未折疊蛋白反應(yīng)（UPRmt），UPRmt的分子伴侶蛋白HSP70水平不足則可促進未折疊蛋白過度富集誘導(dǎo)線粒體損傷，而UPRmt的標志蛋白LonP1不足則不能很好地介導(dǎo)蛋白降解途徑識別、降解未折疊蛋白，從而導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜顯著畸形、超極化及凋亡［25］。文獻［26］報道，HSP70與LonP1之間的穩(wěn)態(tài)遭到破壞則導(dǎo)致未折疊蛋白過度富集，造成未折疊蛋白反應(yīng)信號系統(tǒng)不能對抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的線粒體損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，I/R組大鼠HSP70蛋白相對表達顯著上升，而LonP1蛋白相對表達下降；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠HSP70、LonP1蛋白相對表達顯著上升，表明下調(diào)Heparanase促線粒體折疊系統(tǒng)和識別降解功能的恢復(fù)。

本研究僅對大鼠心肌缺血再灌注損失模型作了較多探索，但小動物生理學結(jié)構(gòu)及功能與人體差異較大，應(yīng)該更進一步尋找臨床證據(jù)和結(jié)合與之對應(yīng)的體外細胞實驗，提升該研究的實際應(yīng)用價值。

綜上所述，下調(diào)HPSE通過介導(dǎo)UPRmt信號途徑抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡從而減輕缺血再灌注大鼠心肌細胞的損傷。最近研究發(fā)現(xiàn)，HPSE抑制劑抑制人類膠質(zhì)母細胞瘤細胞自噬發(fā)生［27］，是否下調(diào)HPSE減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷是通過抑制自噬途徑也值得我們進一步探討。