外周血Tfh細(xì)胞比例及其胞內(nèi)IL-21含量與藍(lán)光視網(wǎng)膜損傷的相關(guān)性

章夢一 余洋洋，2 李征亞 俞永珍，3 張春麗 程天豪，3 雷亦笑 周文杰 鄒秀蘭，3 鄒玉平，2，3

1中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（廣州 510010）；2南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院（廣州 510515）；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州 510405）

光是視覺產(chǎn)生的基礎(chǔ)，但同時(shí)光也可激活氧化自由基等對視網(wǎng)膜造成損傷［1］。能夠產(chǎn)生視覺的環(huán)境光波長是380～760 nm，但暴露過長時(shí)間的可見光會導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷，對夜行動物來說，環(huán)境光強(qiáng)度的2～3倍能對其視網(wǎng)膜造成損傷［2］。視網(wǎng)膜光損傷模型一直被用來研究視網(wǎng)膜退行性疾病，如老年性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD），其引起的視網(wǎng)膜解剖結(jié)構(gòu)的變化與嚙齒類動物光損傷晚期階段的視網(wǎng)膜細(xì)胞重塑極其相似［3］。藍(lán)光目前是視網(wǎng)膜光損傷造模的主要選擇。NAKAMURA［3］用1100Lux的藍(lán)光連續(xù)照射C57BL/J小鼠7 d，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的視網(wǎng)膜光損傷，而12 000 Lux的白色光相同光照時(shí)間卻并沒有誘導(dǎo)嚴(yán)重的視網(wǎng)膜光損傷。JAVIER［4］等人揭示了對年輕白化小鼠暴露高強(qiáng)度（5000 Lux）白光7 d顯著引起視網(wǎng)膜光損傷，但當(dāng)濾除藍(lán)光成分后，即使暴露在強(qiáng)烈的照射下，視網(wǎng)膜的光損傷也顯著減少。

有學(xué)者［5-7］指出，視網(wǎng)膜光損傷可誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)以及補(bǔ)體反應(yīng)。Tfh 細(xì)胞和 B 細(xì)胞的關(guān)系是相輔相成，缺一不可。濾泡輔助T細(xì)胞（T follicular helper，Tfh）是CD4+效應(yīng)T細(xì)胞的一個亞群，它的效應(yīng)功能與一些與衰老和/或炎癥相關(guān)的疾病有關(guān)，如動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病［8］。Tfh細(xì)胞被認(rèn)為通過各種途徑協(xié)助B細(xì)胞增殖、類切換重組和抗體分泌，這些途徑涉及ICOS、IL-21等的作用［9］。由于這些特征，我們定義外周循環(huán)血中CXCR5+ICOS+CD4+T細(xì)胞被認(rèn)為是Tfh細(xì)胞的對應(yīng)物。研究［10］發(fā)現(xiàn)，在AMD患者中存在Tfh細(xì)胞異常上調(diào)的現(xiàn)象。但目前未見Tfh細(xì)胞在早期視網(wǎng)膜光損傷的報(bào)道，本研究擬通過檢測外周血Tfh細(xì)胞如例及胞內(nèi)IL-21含量，尋找其與視網(wǎng)膜光損傷的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器Brown Norway大鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司）；FL-1D藍(lán)光輻照計(jì)（北京師范大學(xué)光電儀器廠），LED藍(lán)光光源（具體參數(shù)：主波峰451 nm，色純0.982（中山共炫光電科技有限公司）；Topcon眼底照相機(jī)（日本Topcon公司）；羅蘭電生理儀、Ganzfeld刺激器（德國羅蘭公司），實(shí)驗(yàn)動物專用操作臺、金屬環(huán)狀角膜接觸電極、金屬針狀角膜接觸電極（北京高視遠(yuǎn)望有限責(zé)任公司），HE染色液、分化液、返藍(lán)液（武漢塞維爾生物有限公司）、中性樹膠（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），BX-51顯微鏡（日本Olympus公司），Anti-CD4 antibody（BD-561833），Anti-CXCR5 antibody（Bioss bs-3598R），Anti-ICOS antibody（Invitrogen 15-9949-82），IL-21（Bioswamp RA20183），CD4大鼠分選珠分離試劑盒、MACS 緩沖液、磁力架、磁珠分選柱（德國美天旎公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)將BN大鼠分為0 d組、3 d組、7 d組和14 d組，每組大鼠各6只，光照不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)后觀察各組各項(xiàng)指標(biāo)的變化。本實(shí)驗(yàn)獲得中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（編號：SYDW2022023）。制備大鼠用的藍(lán)光光照用 LED 燈源，使用藍(lán)光輻照計(jì)進(jìn)行測量，使大鼠飼養(yǎng)箱的藍(lán)光光照強(qiáng)度平均在（3 000 ± 500）Lux，其中該藍(lán)光燈源的長寬規(guī)格為460 mm × 300 mm，光照時(shí)將該燈源朝向內(nèi)部并置于大鼠飼養(yǎng)箱的頂部。大鼠隨機(jī)分組后均在12 h明（45 Lux）和12 h暗（0 Lux）的循環(huán)光環(huán)境中適應(yīng)2周，光照前暗適應(yīng)至少24 h。除正常對照組外，其余光照組均放在自制的大鼠光照飼養(yǎng)箱中，持續(xù)光照3 h，光照結(jié)束后將大鼠送回暗環(huán)境中。

1.3 外周血Tfh細(xì)胞（濾泡輔助性T細(xì)胞）檢測斷尾采取EDTA抗凝外周血2 mL，按說明書采用Ficoll-Hypaque密度離心法分離PBMC后，取100 μL細(xì)胞懸液，并按說明書加入FITC-CD4、PE-CXCR5和PE-Cy5-ICOS抗體，避光于室溫靜置反應(yīng)15 min后行流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 Tfh細(xì)胞胞內(nèi)IL-21含量檢測同上使用Ficoll-Hypaque密度離心法分離得到PBMC后，用CD4免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞，CXCR5抗體染色分選出的CD4+T細(xì)胞后離心得Tfh細(xì)胞，采用ELISA法檢測Tfh細(xì)胞分泌的IL-21細(xì)胞因子濃度。

1.5 視網(wǎng)膜電圖檢查提前暗適應(yīng)后，用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散開大鼠瞳孔，腹腔麻醉后按照說明書將金箔記錄電極安放在角膜中央，參考電極插入在大鼠兩側(cè)頰部淺表皮下組織，接地電極插入大鼠尾端淺表皮下組織，在Ganzfeld刺激器前暴露眼球，記錄暗適應(yīng)3.0ERG程序大鼠在光刺激下的波形。

1.6 眼底照相對大鼠行全身麻醉后，應(yīng)用Topcon眼底照相機(jī)（日本Topcon公司）對大鼠行眼底照相。

1.7 HE染色檢查行脊椎脫臼法處死大鼠后摘除雙側(cè)眼球，按脫水浸蠟、包埋、切片、切片脫蠟、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片和顯微鏡檢查順序依次處理。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各檢測指標(biāo)使用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組的樣本均數(shù)經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊。采用two-way anova及普通方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血Tfh細(xì)胞檢測0 d、3 d、7 d和14 d組的Tfh細(xì)胞比例依次為（3.75 ± 0.59）%、（6.30 ±0.63）%、（9.38 ± 0.93）%和（13.93 ± 2.19）%（總體差異F=30.74），視網(wǎng)膜藍(lán)光損傷后，外周血中 Tfh細(xì)胞比例隨光照時(shí)間延長不斷增加，3 d組、14 d組與0 d組相比，Tfh細(xì)胞比例明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05和P＜0.01）（圖1）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測 Tfh 細(xì)胞占外周血 CD3/4+T比例Fig.1 Flow cytometry was used to detect the proportion of Tfh cells in peripheral blood CD3/4+T cell

2.2 Tfh細(xì)胞內(nèi)IL-21含量檢測0 d、3 d、7 d和14 d組Tfh細(xì)胞內(nèi)IL-21含量依次為（101.2 ± 3.23）pg/mL、（135.4 ± 6.42）pg/mL、（176.6 ± 17.14）pg/mL和（225.2 ± 20.59）pg/mL，胞內(nèi) IL-21含量也隨光照時(shí)間延長均明顯增加，3 d組、7 d組和14 d組與0 d組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01）（總體差異F=57.09，見圖2）。

圖2 不同組Tfh細(xì)胞內(nèi)IL-21含量。Fig.2 IL-21 content in Tfh cells of different groups

2.3 視網(wǎng)膜電圖檢查藍(lán)光照射可導(dǎo)致視網(wǎng)膜電生理功能下降，不同時(shí)間光照射后ERG波形發(fā)生特征性變化（見圖3，表1-4）。ERG顯示光損傷后視網(wǎng)膜功能降低，隨光照時(shí)間延長而加重，a波潛伏期隨光照時(shí)間延長而延長，其中7 d組和14 d組與0 d組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（總體差異F=24.78，P＜0.01和P＜0.000 1），a波振幅隨光照時(shí)間延長而降低，3 d組、7 d組和14 d組與0 d組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（總體差異F=139.6，P＜0.01、P＜0.000 1和P＜0.000 1）；b波潛伏期隨光照時(shí)間延長而延長，3 d組、7 d組和14 d組與0 d組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（總體差異F=294.1，P均＜0.0001），b波振幅隨光照時(shí)間延長而降低，3 d組、7 d組和14 d組與0 d組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（總體差異F=120，P均＜0.000 1）。

表1 不同光照組暗適應(yīng)3.0ERG a波潛伏期（ms）Tab.1 Dark Adaptation in different light groups 3.0ERG A-wave latency （ms） ±s，ms

表1 不同光照組暗適應(yīng)3.0ERG a波潛伏期（ms）Tab.1 Dark Adaptation in different light groups 3.0ERG A-wave latency （ms） ±s，ms

分組0 d 3 d 7 d 14 d a波潛伏期（n=6）12.60 ± 0.73 15.50 ± 0.58 17.83 ± 1.08 22.65 ± 3.10 P值-ns 0.004 7＜0.000 1 F值24.78

表2 不同光照組暗適應(yīng)3.0ERG a波振幅（uv）Tab.2 Dark adaptation to 3.0ERG a amplitude （uv）in different light groups ±s，uv

表2 不同光照組暗適應(yīng)3.0ERG a波振幅（uv）Tab.2 Dark adaptation to 3.0ERG a amplitude （uv）in different light groups ±s，uv

分組0 d 3 d 7 d 14 d a波振幅（n=6）97.38 ± 2.75 84.05 ± 2.75 64.10 ± 4.62 46.75 ± 4.50 P值-0.001 5＜0.000 1＜0.000 1 F值139.6

表3 不同光照組暗適應(yīng)3.0ERG b波潛伏期（ms）Tab.3 Dark Adaptation in different light groups 3.0ERG A-wave latency （ms） ±s，ms

表3 不同光照組暗適應(yīng)3.0ERG b波潛伏期（ms）Tab.3 Dark Adaptation in different light groups 3.0ERG A-wave latency （ms） ±s，ms

分組0 d 3 d 7 d 14 d b波潛伏期（n=6）32.83 ± 0.29 39.78 ± 0.95 42.15 ± 0.39 44.40 ± 1.49 P值-＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 F值294.1

表4 不同光照組暗適應(yīng)3.0ERG b波振幅（uv）Tab.4 Dark adaptation to 3.0ERG b amplitude （uv）in different light groups ±s，uv

表4 不同光照組暗適應(yīng)3.0ERG b波振幅（uv）Tab.4 Dark adaptation to 3.0ERG b amplitude （uv）in different light groups ±s，uv

分組0 d 3 d 7 d 14 d b波振幅（n=6）167.8 ± 5.74 113.8 ± 3.59 99.25 ± 4.71 80.58 ± 2.90 P值-＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 F值294.1

圖3 各組暗適應(yīng)3.0ERG波形變化Fig.3 Variation of 3.0ERG waveform in each group

2.4 眼底照相藍(lán)光損傷可導(dǎo)致大鼠視盤色淡，視網(wǎng)膜動脈呈銅絲樣甚至銀絲樣，視網(wǎng)膜靜脈擴(kuò)張，大量骨細(xì)胞樣色素沉著以及出血和白點(diǎn)狀顆粒改變（見圖4）。其中0 d組（圖4-A）：視網(wǎng)膜平伏，視網(wǎng)膜血管、視盤結(jié)構(gòu)清楚，未見出血點(diǎn)及黃白色點(diǎn)狀顆粒；3 d組（圖4-B）：局灶性輕度的骨細(xì)胞樣色素沉著，視網(wǎng)膜靜脈擴(kuò)張，偶可透見下方脈絡(luò)膜大血管；7 d組（圖4-C）：視盤色淡，視網(wǎng)膜動脈呈銅絲樣，時(shí)可見出血點(diǎn)；14 d組（圖4-D）：見大量骨細(xì)胞樣色素沉著。

圖4 光照對各組大鼠眼底的影響Fig.4 Influence of light on fundus of rats in each group

2.5 HE染色檢查藍(lán)光照射后大鼠視網(wǎng)膜組織變薄，其中視網(wǎng)膜外核層變薄更為顯著（見圖5）。0 d組大鼠各層視網(wǎng)膜厚度正常，各層組織結(jié)構(gòu)清晰；3 d組全層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)大致正常，ONL輕度變??；7 d組視網(wǎng)膜層間輕度腫脹，甚至變薄，ONL組織疏松，變薄，細(xì)胞核排列紊亂、部分堆積、甚至斷層，RPE層萎縮、中斷不連續(xù)和脈絡(luò)膜小血管輕度萎縮；14 d組視網(wǎng)膜明顯變薄，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂，其間呈空泡樣改變，RPE 層萎縮、中斷不連續(xù)和脈絡(luò)膜小中血管萎縮。ONL厚度各組依次為（41.14 ±3.32）μm、（33.56 ± 1.28）μm、（27.82 ± 1.90）μm和（21.13 ± 2.27）μm（總體差異F=45.64），隨光照時(shí)間延長ONL厚度明顯變薄，3 d組、7 d組和14 d組與0 d組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.05和P＜0.01）。

圖5 光照對各組大鼠視網(wǎng)膜的影響Fig.5 Effect of light on the retina of rats in each group

2.6 Tfh 細(xì)胞與各指標(biāo)相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析法檢測 Tfh 細(xì)胞與各指標(biāo)之間的相關(guān)性（圖6-7）。藍(lán)光光照視網(wǎng)膜后：外周血Tfh細(xì)胞比例及其胞內(nèi)IL-21含量與視網(wǎng)膜藍(lán)光損傷的程度存在相關(guān)性（R2=0.855 1，P＜0.000 1）。其中，外周血Tfh細(xì)胞比例與ONL厚度呈負(fù)相關(guān)（R2=0.823 2，P＜0.000 1）；外周血Tfh細(xì)胞比例與a波和b波峰時(shí)呈正相關(guān)（R2=0.842 6和R2=0.702 9，P均＜0.000 1），外周血Tfh細(xì)胞比例與a波和b波振幅呈負(fù)相關(guān)（R2=0.907 8和R2=0.665 5，P均＜0.000 1）。

圖6 Tfh細(xì)胞比例與胞內(nèi)IL-21含量、ONL厚度相關(guān)分析Fig.6 Correlation analysis of Tfh cell proportion with intracellular IL-21 content and ONL thickness

圖7 Tfh 細(xì)胞比例與暗適應(yīng)3.0 ERG各指標(biāo)間關(guān)系Fig.7 Relationship between Tfh cell proportion and dark adaptation 3.0 ERG

3 討論

隨著現(xiàn)代社會的進(jìn)步與發(fā)展，人們使用和接觸手機(jī)、電腦和節(jié)能燈霓虹燈等電子產(chǎn)品的時(shí)間與頻率越來越多，電子產(chǎn)品中包含有大量450～475 nm的藍(lán)光。藍(lán)光在可見光中波長最短，光能量最大，穿透性最強(qiáng)，故藍(lán)光最容易穿透角膜和晶狀體達(dá)到眼底視網(wǎng)膜，并與視網(wǎng)膜產(chǎn)生作用造成損傷［11］。

本實(shí)驗(yàn)中，ERG 在造模后第5天［12］進(jìn)行，因?yàn)楣庹T導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷從發(fā)生到視網(wǎng)膜出現(xiàn)穩(wěn)定的損傷變化需要一定的時(shí)間，ERG 作為衡量視網(wǎng)膜功能學(xué)的指標(biāo)，其波長和振幅均有不同程度的延長和降低，其中7 d組較3 d組變化更明顯，HE染色顯示3 d組大鼠ONL厚度輕度變薄，推測因光照時(shí)間較短，細(xì)胞功能未全部失活，有一定的自愈能力，而7 d組大鼠視網(wǎng)膜明顯變薄，細(xì)胞核排列紊亂。表明7 d組大鼠無論在功能上還是形態(tài)學(xué)上，視網(wǎng)膜均有較大程度的光損傷。而程強(qiáng)［13］等人研究花青素對光誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜保護(hù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)光照3 h后3.0 ERG的a波和b波振幅明顯下降，光照后的大鼠ONL細(xì)胞數(shù)減少。張楚［14］等人將SD大鼠暴露在藍(lán)光的環(huán)境下，光照后HE染色檢測顯示視網(wǎng)膜萎縮和感光細(xì)胞層減少，上述研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果基本一致，光損傷可導(dǎo)致大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能受損。

Tfh細(xì)胞表面表達(dá)的趨化因子受體5（CXCR5）在C-X-C 趨化因子配體13 （chemokine C-X-C motif ligand 13，CXCL13）的趨化作用下介導(dǎo)Tfh細(xì)胞遷移至淋巴濾泡內(nèi)的T細(xì)胞，隨后與B細(xì)胞相互作用［9］。在生發(fā)中心，Tfh細(xì)胞被認(rèn)為通過各種途徑協(xié)助B細(xì)胞增殖、類切換重組和抗體分泌，這些途徑涉及PD-1、CD40 L、ICOS和IL-21等的作用［9］。而Tfh細(xì)胞研究多見于HIV和重癥肌無力等自身免疫性疾病的報(bào)道，與視網(wǎng)膜光損傷關(guān)系未知，本研究通過建立大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型，按照不同光照時(shí)間分組，在建模完成后抽取大鼠外周血液檢測Tfh細(xì)胞比例。結(jié)果顯示：外周血Tfh細(xì)胞比例隨著光照時(shí)間延長和大鼠視網(wǎng)膜光損傷加重呈上升趨勢，表明Tfh細(xì)胞比例與藍(lán)光視網(wǎng)膜損傷及其程度具有一定的相關(guān)性，目前國內(nèi)外均未見相關(guān)研究報(bào)道。

IL-21是PARRISH等［15］在2000年發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型細(xì)胞因子家族中IL-2亞家族的新成員，IL-21R主要在T細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）和巨噬細(xì)胞上表達(dá)，IL-21通過與IL-21R結(jié)合，調(diào)節(jié)T和B細(xì)胞的增殖和分化，影響T細(xì)胞、漿細(xì)胞和生發(fā)中心細(xì)胞的功能［16］。IL-21在促進(jìn)腫瘤［17］和纖維化［18］的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，如在結(jié)腸癌［19］的小鼠模型中，病例組的表達(dá)高于對照組。Tfh可分泌IL-21，且 IL-21為Tfh分泌的主要細(xì)胞因子，也是其最主要的效應(yīng)執(zhí)行分子。所以僅有Tfh細(xì)胞所占比例增多并不足以說明有功能的Tfh細(xì)胞參與了視網(wǎng)膜光損傷的過程，因此，本實(shí)驗(yàn)還通過胞外刺激破膜和ELISA法檢測Tfh分泌的IL-21含量，發(fā)現(xiàn)隨著光照時(shí)間延長和視網(wǎng)膜的損傷，外周血Tfh分泌的IL-21含量比例呈上升趨勢，進(jìn)一步表明Tfh細(xì)胞及其胞內(nèi)IL-21含量與藍(lán)光視網(wǎng)膜損傷相關(guān)，查閱文獻(xiàn)目前未見相關(guān)研究報(bào)道。

本研究目前發(fā)現(xiàn)外周血的檢測因子與視網(wǎng)膜藍(lán)光損傷具有相關(guān)性，但其中的作用信號通路需進(jìn)一步的研究。有研究［21］表明ICOS信號對于激活Tfh譜系轉(zhuǎn)錄因子Bcl6的早期誘導(dǎo)至關(guān)重要，Bcl6隨后上調(diào)CXCR5的表達(dá)，同時(shí)在Tfh細(xì)胞上表達(dá)ICOS有助于維持Tfh分化［20］。因此，為進(jìn)一步探討Tfh細(xì)胞在視網(wǎng)膜光損傷中的作用機(jī)制，下一步擬探討Tfh細(xì)胞是否通過ICOS/Bcl-6/CXCR5信號通路參與視網(wǎng)膜光損傷。