抽拔輔助分散固相微萃取技術(shù)用于飲料中5 種殺菌劑殘留檢測研究

康琬琳, 張艷超, 宋惜木, 席雪霏, 高海翔, 周文峰

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，北京 100193)

嘧菌酯、三唑酮、百菌清，嘧菌環(huán)胺和肟菌酯為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的殺菌劑，廣泛被用于防治農(nóng)作物上的粉霉病、霜霉病、小麥白粉病和炭疽病等病害[1-2]。但隨之大量使用，可能導(dǎo)致殺菌劑在農(nóng)產(chǎn)品中出現(xiàn)不同程度的殘留問題，并且部分殺菌劑具有潛在毒性、內(nèi)激素破壞作用、致癌物以及低量毒性的特性，對人類健康存在潛在風(fēng)險[3]。國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定上述5 種殺菌劑的ADI (每日允許攝入量) 范圍為0.02～0.2 mg/(kg bw)[4-5]。因此，近年來，食物中殺菌劑殘留的微量檢測技術(shù)引起了廣泛關(guān)注，開發(fā)簡便、綠色、靈敏度高且易于操作的測定殺菌劑殘留的分析方法具有重要意義。

目前，實際復(fù)雜樣品的前處理方法主要有液液萃取 (LLE)[6]、液液微萃取 (LLME)[7]、固相萃取 (SPE)[8]和固相微萃取 (SPME)[9]等。相較于SPE 等傳統(tǒng)方法，分散固相微萃取 (d-SPE) 方法在萃取效率和環(huán)保性上具有明顯優(yōu)勢，在從復(fù)雜樣品基質(zhì)中萃取殺菌劑的實際應(yīng)用中表現(xiàn)優(yōu)良[10]。在d-SPE 方法中，萃取材料通常被制備成納米粒子 (NPs)，通過旋渦或超聲波將一小部分萃取材料分散在樣品溶液中。萃取后，通過離心作用可以快速將含有萃取物的萃取材料分離出來，然后用少量有機溶劑洗脫待分析物。

在d-SPE 的過程中，常用的萃取材料主要有十八烷基硅烷鍵合硅膠 (C18) 等?？紤]到環(huán)境和經(jīng)濟問題，研究人員越來越多地關(guān)注將廉價的天然陶土礦物作為萃取材料的替代品[11-12]。坡縷石(ATP) 是一種具有大表面積、多孔結(jié)構(gòu)和離子交換能力的纖維型硅酸鹽陶土礦物，在中國儲量較大[13]，其吸附作用機制主要為吸附和離子交換，但這種吸附和離子交換能力對有機污染物不具有特異性。對吸附劑進行適當(dāng)?shù)墓δ苄曰鶊F修飾是提高吸附劑分離能力的有效方法[14]。β-環(huán)糊精 (β-CD) 的獨特疏水空腔和親水壁的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其能夠捕獲特定尺寸和極性的目標(biāo)物，在內(nèi)部空腔形成超分子作用，并具有選擇特定分析物的能力[15]。已有研究證明，通過將β-環(huán)糊精和坡縷石結(jié)合使用，選擇性得到了顯著提高，進而有效地提高了分析效率[16]。離子液體 (IL) 被認(rèn)為是“綠色溶劑”，具有蒸氣壓力可忽略不計、化學(xué)和熱穩(wěn)定性，以及在有機和無機介質(zhì)中具有良好的溶解性等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于綠色分析化學(xué)領(lǐng)域[17]。此外，離子液體能夠通過π-π 鍵、n-π 鍵、氫鍵、偶極相互作用和靜電作用與分析物相互作用。研究人員利用這些突出特質(zhì)，已將離子液體負載到不同納米尺度的載體上用于分離分析[18-19]。

本研究使用坡縷石作為新型的離子液體修飾的吸附劑，從果汁和茶飲料樣品中萃取殺菌劑，通過控制單一變量法和正交試驗設(shè)計得出影響微萃取的因素，擬建立一種d-SPE 方法，并用于實際樣品中殺菌劑的測定以驗證其效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1100 HPLC (高效液相色譜) 系統(tǒng) (美國安捷倫公司)；梅特勒-托利多AL104 電子天平(精確至0.0001 g，瑞士梅特勒-托利多公司)；Zonkia SC-3610 低速冷凍離心機 (中國安徽中佳中科公司)；KQ3200DE 超聲儀 (中國昆山舒美有限公司)；JSM-6700F 掃描電子顯微鏡 (日本Jeol 電子株式會社)；IRtrace-100 傅立葉變換紅外光譜儀(日本島津公司)；DSX-300 核磁共振波譜儀 (德國布魯克上海有限公司)。

嘧菌酯 (azoxystrobin)、三唑酮 (triadimefon)、百菌清 (chlorothalonil)、嘧菌環(huán)胺 (cyprodinil) 和肟菌酯 (trifloxystrobin) 標(biāo)準(zhǔn)品，純度均大于99.0%，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所提供。色譜純乙腈，購于迪馬公司 (美國，加利福尼亞州)；分析純氯化鈉和乙醇，購于北京化工有限公司，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽 ([HMIM][PF6])和1-己基-3-甲基咪唑氯化物 ([HMIM]CL) ，購于中國科學(xué)院綠色化學(xué)與催化中心 (中國，蘭州)；雙 (三氟甲基磺酰胺)，購于中國浙江九州制藥公司；坡縷石 (attapulgite)，由中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所提供；β-環(huán)糊精、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、氫化鈉 (NaH)和γ-(2,3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷 (KH-560)，購于中國上海國藥集團化學(xué)試劑公司；0.22 μm 聚醚砜 (PES) 濾膜，購于中國比克曼公司。

1.2 樣品準(zhǔn)備

綠茶、紅茶、葡萄汁和蘋果汁4 種飲料樣品從本地超市 (中國，北京) 采購。準(zhǔn)確稱取殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解，配制成質(zhì)量濃度為 100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再用乙腈稀釋成系列質(zhì)量濃度(5、10、50、100、125、200 和500 μg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在對樣品進行分析之前，兩種茶飲料樣品無需離心和過0.22 μm 濾膜；兩種果汁樣品在4000 r/min 下離心10 min，過0.22 μm PES 濾膜。4 種樣品各取50.0 mL，加入標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成目標(biāo)濃度樣品溶液；空白樣品進行相同處理，但不加入標(biāo)準(zhǔn)儲備液。所有樣品均于4 ℃條件下儲存，備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 離子液體的制備以及離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石的合成

1.3.1.1 離子液體的制備 1-己基-3-甲基咪唑氯化物和等質(zhì)量的雙 (三氟甲基磺酰亞胺) 在去離子水中經(jīng)離子交換反應(yīng)，制成1-己基-3-甲基咪唑雙(三氟甲基磺酰亞胺) 離子液體([HMIM][NTF2])，其制備方法如下：

在1 L 單頸圓底燒瓶中加入1-己基-3-甲基咪唑氯化物20.2 g (0.1 mol)和雙(三氟甲基磺酰亞胺) 28.7 g (0.1 mol)，加入70 mL無水乙醇，在室溫下攪拌2 h，形成兩相體系。有機相用3 × 50 mL 水洗滌，減壓(0.01 kPa, 0.001 mm)干燥。然后加入100 mL 二氯甲烷和35 g 無水硫酸鎂，攪拌1 h，過濾除去不溶物，再在30 ℃、減壓(0.01 kPa, 0.1 mm) 條件下蒸發(fā)2 h，得淺黃色黏稠液體，即1-己基-3-甲基咪唑雙(三氟甲基磺酰亞胺)37.2 g (收率95%)。離子液相用水洗滌6～8 次后，在真空爐中50 ℃干燥8 h，去除水相，得目標(biāo)離子液體。

1.3.1.2 離子液體涂覆的β-環(huán)糊精/坡縷石(β-CD/ATP)納米復(fù)合材料的合成 分為兩個步驟[20]：

第1 步，將坡縷石進行酸化。準(zhǔn)確量取100 mL 3.0 mol/L 的鹽酸溶液，加入坡縷石中，在室溫下攪拌3 h，過濾，用去離子水反復(fù)洗滌，直到濾液呈中性；將經(jīng)過初步處理的坡縷石置于110 ℃烘箱中干燥8 h 后，懸浮于150 mL 無水甲苯中，加入1.5 g KH-560 和1 mL 三乙胺，在90 ℃及氮氣保護下通過電磁攪拌回流24 h；用甲苯、乙醇、蒸餾水和丙酮依次洗滌沉淀物 (Si-ATP)，然后在60 ℃下真空干燥8 h；將重結(jié)晶的β-環(huán)糊精溶解于100 mL 無水DMF 中，加入0.3 g NaH，于室溫下攪拌，直到?jīng)]有氣體排出，過濾去除過量的NaH；向溶液中加入5.0 g Si-ATP，在110 ℃及氮氣保護下攪拌12 h；用DMF、甲醇和蒸餾水依次洗滌反應(yīng)產(chǎn)物β-環(huán)糊精/坡縷石復(fù)合物，然后在60 ℃真空下干燥，即得固體β-環(huán)糊精/坡縷石。

第2 步，將離子液體固定在β-環(huán)糊精/坡縷石表面。將1 g 離子液體分散在6 mL 乙醇中，加入1 gβ-環(huán)糊精/坡縷石，于室溫下攪拌30 min，然后在60 ℃真空下干燥6 h，即得離子液體 (IL)涂覆的β-環(huán)糊精/坡縷石(β-CD/ATP)納米復(fù)合材料。

1.3.2 離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石分散固相微萃取步驟 將含有目標(biāo)分析物的8 mL 均勻樣品溶液裝入10 mL 聚四氟乙烯管中，加入40 mg 離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石 (由[HMIM][NTF2]修飾的β-CD/ATP)，用10 mL 注射器進行6 次分散；過0.22 μm 的PES 濾膜，將納米粒子從樣品溶液中分離出來，然后用600 μL 丙酮進行7 次洗脫以提取分析物；將洗脫液轉(zhuǎn)移至另一支管中，在50 ℃下用氮氣吹干，用60 μL 乙腈重溶，待HPLC 測定。微萃取流程示意圖見圖1。

圖1 離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石抽拔輔助分散固相微萃取流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the ionic liquid-coated β-cyclodextrin/attapulgite syringe-assisted dispersive solid phase mixroprocess

1.4 方法驗證

外標(biāo)法定量。用蒸餾水稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成5、10、50、100、125、200 和500μg/L 系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后使用離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石進行d-SPE。在5～500 μg/L 范圍內(nèi)使用標(biāo)準(zhǔn)溶液建立校準(zhǔn)曲線，通過相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD，n=3) 在1 或2 d 內(nèi)評估提取過程的精密度，峰值出現(xiàn)在50 μg/L 處。計算相應(yīng)殺菌劑類農(nóng)藥的平均回收率來評估測量的正確度。

1.5 富集因子和萃取回收率的計算

萃取性能通過回收率 (R) 來評估，回收率定義為從最終有機溶液 (nc) 中收集的目標(biāo)分析物和水樣中最初添加的分析物 (n0) 的百分比。富集因子(EF) 定義為有機相 (Cc) 中分析物濃度與樣品中分析物濃度 (C0) 的比值。R和EF可通過公式 (1) 和(2) 計算。

式中，Vc和Vaq分別表示最終有機相和樣品溶液的體積。Cc根據(jù)將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注入HPLC 獲得的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石的特性

圖2 展示了坡縷石、β-環(huán)糊精/坡縷石和離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石的傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)。

圖2 FT-IR 表征：(a)坡縷石；(b)β-環(huán)糊精/坡縷石；(c) 離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石Fig.2 FT-IR characterization of (a) attapulgite, (b) βcyclodextrin/attapulgite, and (c) ionic liquid coated β-cyclodextrin/attapulgite

對于離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石，在3620～3580 cm-1范圍內(nèi)的寬峰是與八面體鎂和四面體硅配位的羰基伸縮振動信號。與坡縷石相比，β-環(huán)糊精/坡縷石和離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石在2939 cm-1和2882 cm-1處的吸收峰強度更強，這些峰對應(yīng)于與β-環(huán)糊精配位的-CH-基團的伸縮振動。在2800 cm-1和300 cm-1處，特征峰清晰地顯示了咪唑環(huán)氮原子處烷基的-CH-伸縮振動。3249 cm-1處的特征峰由-C-H-基團的伸縮振動引起的兩個峰構(gòu)成。此外，1138 cm-1和1058 cm-1處的峰是由于O-S-O 的非對稱和對稱伸縮振動。

通過掃描電鏡 (SEM) 圖像證明了β-環(huán)糊精/坡縷石以及由此產(chǎn)生的離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石納米復(fù)合材料的存在 (圖3)。將離子液體涂覆在β-環(huán)糊精/坡縷石上保持了坡縷石吸附材料的固體特性，這顯示出疏水性離子液體在固體吸附材料方面具有潛力。

圖3 掃描電鏡表征：(a) 坡縷石； (b) β-環(huán)糊精/坡縷石； (c) 離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石Fig.3 SEM of (a) attapulgite，(b) β-cyclodextrin/attapulgite，and (c) ionic liquid coating β-cyclodextrin/attapulgite

2.2 萃取條件的優(yōu)化

采用控制單一變量法確定萃取條件對分散固相微萃取的影響。確定最佳方案，進一步使用正交試驗設(shè)計 (OAD) 和方差分析 (ANOVA) 方法確定影響提取效率的因素及其與主要因素之間的關(guān)系。結(jié)果表明，萃取材料質(zhì)量對萃取效率的影響最大。

2.2.1 吸附劑納米粒子的選擇 由表1 可知：離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石的回收率高于其他類型的坡縷石，提取性能更好，可能是由于離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石具有較大的表面積、較強的陰離子交換能力以及離子液體和坡縷石的物理吸附性能。β-環(huán)糊精的存在可能提高了吸附劑與目標(biāo)物之間的靈敏度。因此，在后續(xù)試驗中選擇離子液體涂覆β-環(huán)糊精/坡縷石顆粒作為固體吸附劑。

表1 材料吸附萃取性能對比Table 1 Comparison of adsorption performance of the materials

2.2.2 納米顆粒質(zhì)量的優(yōu)化 在分散固相微萃取過程中，需要使用注射器將樣品泵送至分散狀態(tài)進行萃取，然后使用濾膜從萃取樣品中提取吸附材料，最后進行脫附。因此，本研究考察了不同萃取材料用量 (10、20、30、40 和50 mg) 對萃取效果的影響。結(jié)果 (圖4a) 顯示，當(dāng)萃取材料用量為40 mg 時獲得了最佳的萃取效果，并且數(shù)據(jù)平行性良好。

圖4 (a) 萃取劑用量、(b) 洗脫劑種類、(c) 洗脫劑體積、(d) 抽拔分散次數(shù)、(e) 抽拔洗脫次數(shù)、(f) 洗脫間隔對萃取效果的影響Fig.4 Effect of (a) dosage of extractant; (b) type of eluent; (c) volume of eluent; (d) dispersion pumping times;(e) pumping elution times; and (f) interval of elution on the extraction efficiency

2.2.3 洗脫劑的選擇 比較了乙腈、甲醇、丙酮和乙醇4 種常用有機溶劑作為洗脫劑對5 種殺菌劑的洗脫效果。綜合考慮試驗結(jié)果、溶劑的毒性、成本和對環(huán)境的影響，發(fā)現(xiàn)丙酮效果最好，因此最終選擇丙酮作為洗脫劑 (圖4b)。

2.2.4 洗脫劑體積的優(yōu)化 為了進一步提高洗脫劑對分析物的解吸效率，比較了不同體積的丙酮對回收率的影響。結(jié)果 (圖4c) 顯示，當(dāng)丙酮體積為600 μL 時平均回收率最高，并且數(shù)據(jù)平行性良好。因此，選擇600 μL 丙酮為洗脫劑。

2.2.5 抽拔分散循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化 在試驗過程中，采用注射器輔助分散技術(shù)將萃取吸附材料均勻分散在樣品溶液中。通過試驗發(fā)現(xiàn)，進行6 次循環(huán)后，萃取效率已經(jīng)趨于飽和 (圖4d)，繼續(xù)增加提取次數(shù)會導(dǎo)致提取劑在殘渣中的殘留量增加，從而降低回收率并影響數(shù)據(jù)平行性。因此，采用6 次抽拔循環(huán)來分散萃取材料。

2.2.6 抽拔洗脫循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化 為了提高洗脫液中吸附物質(zhì)對目標(biāo)分析物的洗脫效率，采用了多次循環(huán)洗脫的方法。在預(yù)試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，研究了洗脫1、3、5、7、9 次對萃取效率的影響。結(jié)果 (圖4e) 發(fā)現(xiàn)，在進行7 次抽拔洗脫后，目標(biāo)分析物的洗脫已經(jīng)基本完成，此時平均回收率最高，繼續(xù)增加抽拔次數(shù)，回收率沒有明顯變化。因此，采用7 次抽拔循環(huán)來進行目標(biāo)物的洗脫。

2.2.7 正交試驗和方差分析 本研究設(shè)計了[L25(54)] 正交試驗來評估可能影響提取效率的4 個潛在因素。為排除人為因素，共進行了25 組隨機模擬試驗 (表2)，重復(fù)3 次。通過方差分析，得出了各種參數(shù)的系數(shù)R值，結(jié)果 (表3) 顯示，萃取劑用量 ＞ 抽拔分散循環(huán)次數(shù) ＞ 抽拔洗脫循環(huán)次數(shù) ＞ 洗脫劑用量。萃取劑用量置信水平為95%，F(xiàn)值為67.93，P值為0.004，表明萃取劑用量是影響提取回收效率最重要的因素。因此，最佳組合參數(shù)為：40 mg 萃取劑，6 次抽拔分散循環(huán)，7 次抽拔洗脫循環(huán)和600 μL 丙酮洗脫。

表2 正交試驗設(shè)計和分析結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and analysis of results

表3 方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA

2.3 萃取材料的日間洗脫率變化

在實際工作中，完成樣品萃取后的材料不能立即用于后續(xù)的試驗步驟，需要通過抽拔分散萃取和固液分離，在相對較長的時間內(nèi)記錄和保存樣品中分析物的濃度狀況，以供未來的分析和研究使用。萃取材料完成抽拔分散和固液分離后，用濾膜封裝，并在濾膜的兩端使用密封膜進行密封。隨后，在0、24、48、72 和96 h 的時間間隔點進行洗脫，通過回收率來評估萃取材料對目標(biāo)物的保存分析能力。結(jié)果 (圖4f) 顯示，5 種分析物的平均回收率均未明顯下降，表明萃取材料對分析物具有良好的保留能力，并延緩了分析物的自然降解。

2.4 方法驗證

在空白樣本中添加特定濃度化合物進行檢測，以3 倍信噪比對應(yīng)的被測化合物的含量為檢出限，以10 倍信噪比對應(yīng)的被測化合物的含量為定量限。結(jié)果表明：在水基質(zhì) (表4) 中，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，決定系數(shù) (R2) 在0.9982～0.9999 之間，尖峰濃度在5～500 μg/L 范圍內(nèi)；檢出限 (LOD) 在0.03～0.38 μg/L 之間；定量限 (LOQ)在0.09～1.15 μg/L 之間，遠小于歐盟制定的嘧菌酯等農(nóng)藥在茶水飲料中的LOQ 值 (0.05 mg/L)[21]，該方法適用于實際樣品測量；日內(nèi)精密度的RSD 值在1.6%～3.1%之間，日間RSD 值在1.8%～4.1%之間，表明該方法具有出色的檢測能力。在果汁基質(zhì) (表5) 中，R2在0.9980～0.9989 之間，尖峰質(zhì)量濃度在5～500 μg/L 內(nèi)，回收率在90%～100%之間； LOD 在0.27～0.44 μg/L 之間； LOQ 在0.30～1.33 μg/L 之間，日內(nèi)精密度的RSD 值在1.8%～4.6%之間，日間的RSD 值在1.8%～3.6%之間，表明該方法在果汁基質(zhì)中同樣呈現(xiàn)良好線性關(guān)系并且有出色的檢測能力。

表4 抽拔分散固相萃取方法用于水中目標(biāo)物分析的確證參數(shù)(n=3)Table 4 syringe-assisted dispersive solid-phase microextraction method of confirming water matrix (n=3)

表5 抽拔分散固相微萃取方法用于果汁基質(zhì)中目標(biāo)物分析的確證參數(shù)Table 5 Confirmation parameters of syringe-assisted dispersive solid phase microextraction method for target substance analysis in fruit juice matrix

2.5 實際樣品分析

運用本研究建立的方法對從當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I的葡萄汁、蘋果汁、綠茶和紅茶4 種飲料樣品進行了驗證。結(jié)果未檢出目標(biāo)農(nóng)藥 (表6)。添加回收試驗結(jié)果表明：5 種殺菌劑添加水平為50 μg/L 時，回收率在82%～106%之間；當(dāng)添加水平為200 μg/L時，回收率在83%～100%之間；典型的色譜圖如圖5 所示。

表6 實際樣品添加回收試驗結(jié)果Table 6 The test results in spiked real samples

圖5 5 種農(nóng)藥在綠茶飲料中的添加回收色譜圖Fig.5 Chromatograms of the 5 pesticides in green tea beverage

3 結(jié)論

本研究通過簡單的直接浸漬法制備了一種新型吸附劑，即β-環(huán)糊精/坡縷石固定化離子液體納米粒子。合成的復(fù)合材料結(jié)合了離子液體、β-環(huán)糊精和坡縷石的優(yōu)點，具有良好的吸附能力和選擇性。該復(fù)合材料被應(yīng)用于空氣輔助泵送分散模式中，用于富集飲料中的殺菌劑。在優(yōu)化的條件下，該技術(shù)可高效測定茶飲料和果汁樣品中殺菌劑的殘留，具有較高的精密度和正確度；檢出限為0.03～0.38 μg/L，遠低于普通固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測方法的檢出限[16]，對于5 種殺菌劑，可檢測的線性范圍為5～500 μg/L，決定系數(shù) (R2) 在0.9982～0.9999 之間，回收率在91%～102%之間。本方法簡便、靈敏、成本效益高且環(huán)境友好。該方法將為全面提取測定不同基質(zhì)中的污染物提供技術(shù)支持，并在富集和測定其他環(huán)境污染物方面具有較大潛力。此外，該方法還可作為開發(fā)低成本、靈敏的農(nóng)藥殘留檢測方法的可能選擇。