山核桃干腐病菌對甲基硫菌靈等4 種殺菌劑的抗性

施心成, 李 濤, 張傳清

(浙江農(nóng)林大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，杭州 311300)

我國現(xiàn)有山核桃Carya cathayensis栽培面積約為1.3 × 106hm2，產(chǎn)值超過35 億元，其中浙江山核桃是天目山區(qū)經(jīng)濟(jì)林主栽品種，具有豐富的營養(yǎng)價值和極高的經(jīng)濟(jì)價值[1-2]。山核桃干腐病又稱潰瘍病，病原菌為球殼孢目的茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，危害較輕時影響樹體生長，造成落果和減產(chǎn)；危害嚴(yán)重時導(dǎo)致山核桃樹瀕臨枯死，造成嚴(yán)重?fù)p失[2-3]。近年來干腐病在山核桃主栽培區(qū)如浙江臨安、桐廬、淳安及安徽績溪、寧國等地普遍發(fā)生，其中臨安區(qū)發(fā)生面積達(dá)2.67 萬hm2，發(fā)病率高達(dá)80%，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

目前，生產(chǎn)中主要利用化學(xué)藥劑防治山核桃干腐病[1,5]。常用藥劑有甲基硫菌靈、戊唑醇、咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑等[6]。其中，甲基硫菌靈屬于苯并咪唑類 (benzimidazoles, BENs) 殺菌劑，此類殺菌劑通過與構(gòu)成真菌微管的β微管蛋白結(jié)合，阻礙其與另一組分α微管蛋白裝配成微管，破壞紡錘體形成，干擾細(xì)胞分裂，從而阻礙真菌繁殖[7]。戊唑醇、咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑都屬于甾醇脫甲基化抑制劑類 (sterol demethylation inhibitors, DMIs)殺菌劑，通過抑制真菌甾醇生物合成中C-14α脫甲基化反應(yīng)，使真菌麥角甾醇的生物合成受阻，從而干擾細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的形成[8]。這兩類化合物都屬于單作用位點的專化性殺菌劑，已在多種植物病原菌上出現(xiàn)抗藥性問題[9]。甲基硫菌靈、戊唑醇、咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑4 種殺菌劑已用于防治山核桃干腐病多年，為了明確該病菌對上述殺菌劑的敏感性現(xiàn)狀，本研究采用區(qū)分劑量法測定了山核桃干腐病菌對4 種殺菌劑的敏感性，評價了甲基硫菌靈抗性菌株的適合度并初步分析了其抗性分子機(jī)制，旨在為實際生產(chǎn)中科學(xué)應(yīng)用殺菌劑防治山核桃干腐病提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

96 株山核桃干腐病菌Botryosphaeria dothidea，由浙江農(nóng)林大學(xué)殺菌劑生物學(xué)與植物病害防治實驗室于2016—2018 年自浙江省杭州市臨安區(qū)和淳安縣等地山核桃各主產(chǎn)區(qū)采集分離、鑒定并保存[10-11]。

1.2 供試殺菌劑

97%甲基硫菌靈 (thiophanate-methyl) 原藥由浙江禾本農(nóng)藥化學(xué)有限公司提供，97% 戊唑醇(tebuconazole) 原藥由江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司提供，97%咪鮮胺 (prochloraz) 原藥由安道麥輝豐公司提供，95.1%苯醚甲環(huán)唑 (difenoconazole) 原藥由浙江天一生物科技有限公司提供。甲基硫菌靈用二甲亞砜配制成質(zhì)量濃度為1 × 105μg/mL 的母液，戊唑醇、咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑用丙酮配制成1 × 105μg/mL 的母液，于4 ℃保存，備用。

1.3 供試培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g，無菌水定容至1 L。

1.4 抗藥性頻率檢測

采用區(qū)分劑量法測定[12-14]。將病原菌分別在PDA 平板上活化培養(yǎng)3 d 后，用滅菌槍頭沿菌落邊緣打取直徑5.0 mm 的菌餅，將帶菌絲面朝下分別接種于含5 μg/mL 甲基硫菌靈、戊唑醇、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑的PDA 平板中央，以不含藥劑但含有相同濃度溶劑的處理作為對照 (CK)，每處理重復(fù)3 次。于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d 后觀察，將在含5 μg/mL 藥劑平板上不能生長的視為敏感菌株，能夠生長的視為抗性菌株[12-13]。按公式 (1)計算抗性頻率 (R/%)。

式中，N1：抗藥性菌株數(shù)，N：菌株總數(shù)。

1.5 有效抑制中濃度 (EC50) 測定

采用菌絲生長速率法測定[14]。隨機(jī)選取1.3 節(jié)中敏感菌株4 株和抗性菌株5 株，測定其對甲基硫菌靈的敏感性。另外，隨機(jī)選擇6 個菌株分別測定其對戊唑醇、咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的敏感性。各藥劑的處理質(zhì)量濃度見表1。

表1 敏感性測定中不同藥劑處理質(zhì)量濃度Table 1 The mass concentrations of different fungicides in the determination of sensitivity

各菌株分別在PDA 平板上活化培養(yǎng)3 d 后，用滅菌槍頭沿菌落邊緣打取直徑5.0 mm 的菌餅，將帶菌絲面朝下接種于含不同質(zhì)量濃度藥劑的PDA 平板中央，以未加入任何藥劑但含相同濃度溶劑的PDA 平板為對照，每個濃度3 次重復(fù)。于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)4 d，采用十字交叉法測定各處理菌落直徑 (mm)，取平均值后按公式 (2) 計算抑制率 (I/%)，利用SPSS 軟件，通過濃度對數(shù)值 (x) 和抑制率幾率值 (y) 之間的線性回歸分析求出毒力回歸方程和EC50值。

式中，dCK: 對照菌落直徑；dT: 處理菌落直徑。

1.6 甲基硫菌靈敏感和抗性菌株的適合度測定

1.6.1 菌絲生長能力測定 隨機(jī)選取甲基硫菌靈敏感菌株4 株和抗性菌株5 株，分別在PDA 平板上于25 ℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3 d，用滅菌槍頭沿菌落邊緣打取直徑5.0 m m 的菌餅，轉(zhuǎn)接至PDA 平板中央，每個菌株6 次重復(fù)，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值代表菌絲生長能力[14]。

1.6.2 產(chǎn)分生孢子器能力測定 將1.6.1 節(jié)中測量直徑后的菌株于25 ℃黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 d，待菌絲在平板上完全長滿再轉(zhuǎn)移至黑光燈下，照射6 d 后取出，統(tǒng)計每個菌株在整個平板內(nèi)產(chǎn)生的分生孢子器數(shù)量，取平均值代表產(chǎn)分生孢子器能力[15]。

1.6.3 菌株致病力測定 參考王瓊偉[15]的離體枝條接種技術(shù)。取粗細(xì)一致的山核桃新枝，將其截成長10 cm 左右小段，用封口膜纏繞枝條兩端后用75%酒精擦拭枝條表皮并用無菌水擦拭3 次。在超凈臺中晾干后，用滅菌小刀在枝條中央處切割出直徑5.0 mm 的小孔。用滅菌槍頭沿預(yù)培養(yǎng)3 d的山核桃干腐病菌菌落邊緣打取直徑5.0 mm 的菌餅，接種于中央小孔中。將接種后枝條置于滅菌托盤中用膠帶密封。于25 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)5 d，測定病斑直徑，取平均值代表菌株致病力。以無菌PDA 圓餅作為對照，每個處理重復(fù)3 次。

1.7 β-tubulin 序列擴(kuò)增及比對

采用CTAB 法提取甲基硫菌靈敏感和抗性菌株的DNA。利用引物TubF/TubR (GTCAGGAG TCGCAGTCAGTAATTAG/CTTCATTTTGTCGCA TGTCTGGCTC)[16]對病原菌β-tubulin 基因進(jìn)行擴(kuò)增。25 μL PCR 反應(yīng)體系：2 × PCR Mix 12.5 μL、各引物1.5 μL、ddH2O 8.5 μL、DNA 模板1 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果用DNAman軟件進(jìn)行序列比對和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 對甲基硫菌靈等四種殺菌劑的抗性頻率

區(qū)分劑量法測定結(jié)果 (圖1) 表明，96 株供試菌株中有81 株對甲基硫菌靈表現(xiàn)出抗性，抗性頻率達(dá)84.38%。對于戊唑醇、咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑3 種DMI 類殺菌劑，96 株供試菌株均表現(xiàn)為敏感，沒有檢測到抗性菌株。

圖1 山核桃干腐病菌 (n = 96) 對 4 種殺菌劑的抗性頻率Fig.1 Resistance frequency of B.dothidea (n = 96) to the four fungicides

2.2 對甲基硫菌靈的敏感性

甲基硫菌靈在低濃度 (0.096 和0.48 μg/mL) 下對各菌株菌絲生長幾乎不表現(xiàn)抑制效果，但隨著濃度上升 (2.4、12 和60 μg/mL)，對菌絲生長有明顯的抑制作用，在5 μg/mL 劑量下即能完全抑制敏感菌株的菌絲生長，而抗性菌株在12 μg/mL 甚至60 μg/mL 劑量下仍有菌絲生長。敏感菌株平均EC50值為0.263 μg/mL，抗性菌株的EC50值在13.126～22.309 μg/mL 之間 (表2)，相對抗性水平(抗性菌株EC50/敏感菌株平均EC50) 在49.9～84.8之間。LGBD18-1 (R) 13.126 c 69.2 d 81.7 c 12.7 b LGBD18-2 (R) 22.309 a 64.0 e 117.0 b 21.7 ab BDLA-7 (R) 17.356 b 69.9 d 51.7 d 27.0 ab BDLA-8 (R) 18.357 b 61.3 e 81.3 c 37.7 a TKBD18-7 (R) 15.209 bc 68.9 d 182.0 a 21.0 ab

表2 甲基硫菌靈敏感和抗性菌株的生物學(xué)性狀Table 2 Biological characteristics of thiophanate-methylsensitive and -resistant isolates

2.3 對戊唑醇、咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的敏感性

戊唑醇對隨機(jī)選取的6 株山核桃干腐病菌菌絲生長的EC50值在0.061～0.279 μg/mL 之間，平均為0.148 μg/mL；咪鮮胺對6 株山核桃干腐病菌菌絲生長的EC50值在0.003～0.044 μg/mL 之間，平均為0.023 μg/mL；苯醚甲環(huán)唑?qū)ι胶颂腋筛【z生長的EC50值在＜ 0.001～0.255 μg/mL 之間，平均為0.091 μg/mL (表3)。

表3 山核桃干腐病菌對戊唑醇、咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的敏感性Table 3 Sensitivity of B.dothidea to tebuconazole,prochloraz and difenoconazole

2.4 對甲基硫菌靈敏感菌株和抗性菌株的適合度

各菌株在菌絲生長速率方面存在顯著差異(表2)，大部分抗性菌株的生長速率顯著低于敏感菌株 。敏感菌株幾乎不產(chǎn)生分生孢子器，而抗性菌株均能產(chǎn)生大量分生孢子器，且數(shù)量顯著高于敏感菌株。敏感菌株與抗性菌株的致病力 (以病斑直徑表示) 無顯著差異(P= 0.209) (圖2)。

圖2 對甲基硫菌靈敏感和抗性菌株的生長、產(chǎn)分生孢子器能力及致病力比較Fig.2 Comparison of mycelial growth, number of pycnidia, and pathogenicity of thiophanate-methyl-sensitive and -resistant isolates

2.5 β-tubulin 序列擴(kuò)增及序列比對

對4 株敏感菌株和5 株抗性菌株的β-tubulin序列比對 (表4) 發(fā)現(xiàn)，敏感和抗性菌株的第198 位和第200 位氨基酸無差異，分別為谷丙氨酸(E)和異亮氨酸(F)。供試菌株在β-tubulin第70、90、119、380 和541 位的氨基酸存在差異，但這些差異與菌株是否具有抗藥性之間無聯(lián)系，也未有文獻(xiàn)報道過上述位點與病原菌對甲基硫菌靈的抗性有關(guān)。

表4 山核桃干腐病菌對甲基硫菌靈敏感和抗性菌株的β-tubulin 氨基酸差異Table 4 Difference of amino acids of β-tubulin from thiophanate-methyl-sensitive and -resistant isolates of B.dothidea

3 結(jié)論與討論

本研究測定了山核桃干腐病菌對戊唑醇、咪鮮胺及苯醚甲環(huán)唑的敏感性，3 種殺菌劑對所測定的山核桃干腐病菌EC50平均值分別為0.148、0.023和0.091 μg/mL，表明供試山核桃干腐病菌對3 種殺菌劑仍然表現(xiàn)較高的敏感性，未出現(xiàn)明顯的敏感性下降，在實際生產(chǎn)中仍可以繼續(xù)使用以防治山核桃干腐病。戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑?qū)τ诙喾N寄主上B.dothidea有良好的抑制效果[17-18]。張傳清等[14]研究發(fā)現(xiàn)，山核桃干腐病菌對戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑有較高的敏感性水平，戊唑醇對山核桃干腐病菌的EC50平均值為0.81 μg/mL；安徽和浙江兩省山核桃干腐病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感基線EC50為(0.43 ± 0.11) μg/mL。本研究結(jié)果與之相似。

本研究發(fā)現(xiàn)山核桃干腐病菌中已經(jīng)有大量菌株對甲基硫菌靈產(chǎn)生了抗性。而劉保友等[19]和成世杰等[20]報道，甲基硫菌靈對蘋果輪紋病菌仍然有較高的活性，未出現(xiàn)敏感性下降的亞群體。出現(xiàn)這種差異可能是分離的菌株產(chǎn)地不同以及甲基硫菌靈在兩種病原菌防治上的使用情況不同導(dǎo)致的。

王麗等[16]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果輪紋病菌抗多菌靈菌株和敏感菌株在菌絲生長速率、子囊殼數(shù)量和致病性方面均無顯著差異。劉方圓[21]報道，抗多菌靈的小麥赤霉病菌菌絲生長速率顯著低于敏感菌株，而兩者在產(chǎn)子囊殼能力方面卻無顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)，山核桃干腐病菌中，甲基硫菌靈抗性菌株和敏感菌株在致病力方面無顯著差異，這與王麗等[16]的研究結(jié)果相吻合；敏感菌株的菌絲生長速率顯著高于抗性菌株，這與劉方圓[21]的研究結(jié)果相同；但分生孢子器的數(shù)量明顯少于抗性菌株，這與以往的報道不太一致，可能是因為分離自不同寄主植物的B.dothidea之間本身存在差異。適合度測定結(jié)果表明，對甲基硫菌靈產(chǎn)生抗性的山核桃干腐病菌的適合度代價較小，使其能夠在種群中達(dá)到較高的比例，說明山核桃干腐病對這類殺菌劑的抗性風(fēng)險較高。

本研究測定并比對了山核桃干腐病菌中甲基硫菌靈抗性菌株和敏感菌株的β-tubulin序列，發(fā)現(xiàn)抗性菌株β-tubulin的第198 位和第200 位氨基酸均未發(fā)生突變，且未發(fā)現(xiàn)其他與抗性有關(guān)的突變位點。這表明，山核桃干腐病菌對甲基硫菌靈抗性的產(chǎn)生與β-tubulin序列的突變無關(guān)，其他病原菌中也報道過類似現(xiàn)象，如Penicillium digitatum中的PMR5 蛋白和Colletotrichum acutatum中的CaABC1 蛋白均與包含MBCs 在內(nèi)的多種殺菌劑抗性有關(guān)[22-24]。而Caba?as 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，從田間獲得的苯并咪唑類抗性青霉菌菌株普遍在β-tubulin序列第198 或200 位發(fā)生突變。王麗等[16]也報道了蘋果輪紋病菌中19 株多菌靈抗性菌株在β-tubulin序列發(fā)生了E198A 突變。因此，本研究中發(fā)現(xiàn)的對甲基硫菌靈產(chǎn)生抗性的菌株，很可能涉及靶標(biāo)基因突變以外的抗性機(jī)制，尚有待進(jìn)一步研究。

本研究通過評估山核桃干腐病菌田間群體對甲基硫菌靈、戊唑醇、咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的抗性發(fā)生情況及敏感性現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)山核桃干腐病菌對甲基硫菌靈抗性頻率較高，但對戊唑醇、咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑仍保持敏感，因此建議在浙江省臨安山核桃主產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)上進(jìn)行病害防治時盡量減少苯并咪唑類殺菌劑如甲基硫菌靈的使用，可以選擇DMIs 類殺菌劑進(jìn)行病害防治，從而達(dá)到病害精準(zhǔn)、可持續(xù)防控的目的。