豇豆中10 種農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用

趙 穎, 虞 淼, 張嘯濤, 壽林飛*,

(1.浙江省植保檢疫與農(nóng)藥管理總站，杭州 310009；2.杭州佰盛匯星生物科技有限公司，杭州 311112)

豇豆Vigna unguiculata(Linn.) Walp 在世界范圍內(nèi)、特別是熱帶和亞熱帶地區(qū)被廣泛種植，全世界豇豆種植面積達(dá)1250 萬hm2[1]，同時(shí)作為我國(guó)重要的“菜籃子”產(chǎn)品[2]，與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民群眾日常生活息息相關(guān)。由于豇豆上病蟲害多發(fā)、用藥頻繁，花果同期、采摘間隔短，加之以小農(nóng)戶分散生產(chǎn)為主，豇豆農(nóng)藥殘留問題突出[3]，連續(xù)多年監(jiān)測(cè)合格率始終偏低，南方省份農(nóng)藥殘留問題尤為突出[4]。2023 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳發(fā)布的《豇豆農(nóng)藥殘留突出問題攻堅(jiān)治理方案》文件[5]中指出，豇豆中存在的突出重點(diǎn)問題包括禁用農(nóng)藥檢出和常規(guī)農(nóng)藥超標(biāo)。2022 年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部鼓勵(lì)食用農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)開辦者對(duì)“三棵菜”(豇豆、韭菜、芹菜)中克百威、三唑磷等禁限用農(nóng)藥，腐霉利、滅蠅胺等易超標(biāo)的常規(guī)農(nóng)藥殘留開展針對(duì)性速測(cè)。同年，浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳公開征集豇豆上克百威等7 種農(nóng)藥的快速檢測(cè)產(chǎn)品[5]。綜合以上文件數(shù)據(jù)，本研究選取了豇豆中克百威等10 種農(nóng)藥為檢測(cè)對(duì)象，旨在為我國(guó)豇豆農(nóng)產(chǎn)品安全提供快速篩查方案。

GB 2763—2021 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[6]和GB 2763.1—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中2, 4-滴丁酸鈉鹽等112 種農(nóng)藥最大殘留限量》[7]規(guī)定，豇豆上的農(nóng)藥最大殘留限量(MRL)分別為克百威0.02 mg/kg、三唑磷0.05 mg/kg、毒死蜱0.02 mg/kg、啶蟲脒0.4 mg/kg、異菌脲2 mg/kg(參考菜豆)、吡唑醚菌酯2 mg/kg(參考葉用萵苣)、多菌靈0.5 mg/kg(參考菜豆)、腐霉利5 mg/kg(參考莖用萵苣)、滅蠅胺0.5 mg/kg 和甲氰菊酯1 mg/kg(參考青花菜)。豇豆中農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析方法主要有液相色譜法[8]、氣相色譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-16]、液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法[17]和增強(qiáng)拉曼光譜法[18-20]等?；谏锓磻?yīng)或特殊介質(zhì)的快速檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)報(bào)道主要集中于金納米探針法[21-22]、免疫熒光法[23-24]、分子印跡法[25-26]和電化學(xué)傳感器[27]，研究的主要農(nóng)藥類別為有機(jī)磷[23,28-29]、氨基甲酸酯[30]、擬除蟲菊酯[31]和新煙堿類農(nóng)藥[32-33]。免疫快速檢測(cè)在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)領(lǐng)域具有明顯優(yōu)勢(shì)，開發(fā)免疫快速檢測(cè)方法，應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查豇豆中多種農(nóng)藥殘留超標(biāo)情況，有助于科學(xué)評(píng)估豇豆殘留水平與膳食風(fēng)險(xiǎn)，為我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品安全保駕護(hù)航。

目前，關(guān)于豇豆中農(nóng)藥多殘留的免疫快速檢測(cè)方法報(bào)道較少，本研究采用免疫快速檢測(cè)技術(shù)，開發(fā)了豇豆中常用10 種農(nóng)藥的免疫層析試紙，優(yōu)化了各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)，評(píng)估了10 種農(nóng)藥快速檢測(cè)方法的靈敏度和正確度，并應(yīng)用于豇豆實(shí)際樣品的抽樣檢測(cè)，綜合評(píng)價(jià)快速檢測(cè)方法的實(shí)用性與準(zhǔn)確性，旨在為豇豆中農(nóng)藥殘留的快速篩查提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Fresco21 低溫高速離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；Nano-300 超微量核酸蛋白測(cè)定儀 (杭州奧盛儀器有限公司)；BSA323S 千分之一天平、BSA224S 萬分之一天平 (德國(guó)賽多利斯公司)；超聲波清洗器(蘇州昆山超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀 (美國(guó)密理博公司)；恒溫磁力攪拌器(美國(guó)沃特世公司)；Vortex-5 旋渦混合器 (海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；噴金劃膜儀(杭州峰杭科技有限公司)；自動(dòng)切條機(jī)(杭州韓感科技有限公司)；Waters TQ-S 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)沃特世公司)；手持便攜式讀數(shù)儀(蘇州和邁精密儀器有限公司)。

克百威、3-羥基克百威、丁硫克百威、異丙威、涕滅威、甲萘威、滅多威、三唑磷、二嗪磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、對(duì)硫磷、丙溴磷、辛硫磷、啶蟲脒、吡蟲啉、氯噻啉、噻蟲嗪、噻蟲胺、呋蟲胺、烯啶蟲胺、異菌脲、乙烯菌核利、腐霉利、吡唑醚菌酯、醚菌酯、嘧菌酯、肟菌酯、多菌靈、甲基硫菌靈、滅蠅胺、敵菌靈、甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯和溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr.E)；克百威、三唑磷、毒死蜱、啶蟲脒、異菌脲、吡唑醚菌酯、多菌靈、腐霉利、滅蠅胺和甲氰菊酯的包被抗原和相應(yīng)的抗體(杭州佰盛實(shí)驗(yàn)室)；羊抗鼠二抗(北京博奧龍)；甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck)；鹽酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；金標(biāo)優(yōu)化劑SDS-L(深圳逗點(diǎn))；聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鉀、乙酸銨和二氯甲烷(上海國(guó)藥)；磷酸緩沖液(PBS)(實(shí)驗(yàn)室自制)；氨基凈化柱(美國(guó) Waters)；CN140 醋酸纖維膜和8964 玻璃纖維膜(美國(guó)Sartorius)；AN3 吸水墊和PVC 襯板(南京微測(cè))；牛血清蛋白(BSA，MW67000)、兔抗鼠IgG、三水合氯金酸和檸檬酸三鈉(美國(guó)Sigma)；豇豆樣品(浙江省各地區(qū)田間)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金標(biāo)抗體與抗原優(yōu)化組合 根據(jù)經(jīng)典的競(jìng)爭(zhēng)型抗原抗體免疫反應(yīng)原理建立金標(biāo)免疫層析試紙方法，采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備30 nm粒徑的膠體金溶液[34]，以此膠體金納米粒子靜電吸附10 種農(nóng)藥抗體，形成10 種膠體金標(biāo)記抗體作為免疫識(shí)別探針。

金標(biāo)免疫識(shí)別探針的制備：準(zhǔn)確量取100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的三水合氯金酸水溶液在恒溫磁力攪拌器上攪拌加熱至沸騰，快速加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%檸檬酸三鈉水溶液，在100 ℃條件下繼續(xù)攪拌，加熱反應(yīng)3 min，得到酒紅色膠體金溶液，冷卻后備用。分別取1 mL 膠體金溶液至6 個(gè)1.5 mL 低吸附尖底聚乙烯離心管中，分別用0.2 mol/L 的碳酸鉀調(diào)節(jié)pH 值至6.0、6.5、7.0、8.0、8.5 和9.0，分別逐滴加入0.1 mL 50 μg/mL的農(nóng)藥抗體，渦旋混合均勻后，靜置1 h；加入0.1 mL 含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% BSA 和1% PEG 的0.01 mol/L PBS 溶液，渦旋混合均勻，靜置0.5 h；于4 ℃、10000 r/min 條件下離心20 min，棄上清液；用0.25 mL 含5% 蔗糖、1% BSA 和0.1% PEG 的0.01 mol/L PBS 溶液渦旋混勻，得到金標(biāo)免疫識(shí)別探針，用于免疫層析試紙測(cè)試。通過空白和農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液添加樣品的測(cè)試線顯色情況篩選出最適pH 值(顯色判斷規(guī)則：陽性樣品的測(cè)試線顯色最深，同時(shí)陰性樣品的測(cè)試線顯色最淺)。

篩選得到最適pH 值后，以同樣的方法篩選最適抗體穩(wěn)定量，將膠體金溶液用0.2 mol/L 的碳酸鉀調(diào)節(jié)至最適pH 值 (如pH 6.5)，分別取1 mL pH 6.5 的膠體金溶液至6 個(gè)1.5 mL 低吸附尖底聚乙烯離心管中，分別逐滴加入0.1 mL 質(zhì)量濃度為10、20、40、80、120 和160 μg/mL 的農(nóng)藥抗體，其他步驟同上述金標(biāo)免疫識(shí)別探針制備過程，最后篩選得到最適抗體穩(wěn)定量。

用篩選得到的最適pH 值和最適抗體穩(wěn)定量，制備10 種金標(biāo)免疫探針，用于檢測(cè)線(T 線)和質(zhì)控線(C 線)測(cè)試。

T 線和C 線優(yōu)化：用劃線稀釋液配制農(nóng)藥包被抗原和羊抗鼠二抗溶液，農(nóng)藥包被抗原用于T 線劃膜，羊抗鼠二抗用于C 線劃膜。設(shè)置T 線質(zhì)量濃度為0.1、0.25、0.5、0.75 和1.0 mg/mL，C 線質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。噴金劃膜儀完成試紙大板NC 膜上的T 線和C 線劃膜后，將膜材料置于抽真空恒溫干燥箱中37 ℃干燥2 h，完全干燥后將試紙大板切成3 mm 小條，用于篩選測(cè)試。測(cè)試時(shí)每個(gè)試紙條的金標(biāo)免疫探針用量為5～10 μL，以顯色為篩選標(biāo)準(zhǔn)，空白對(duì)照顯色為B3的T 線濃度為最適濃度(將紅色顯色分為8 檔，B1～B8，參見表1，B1 表示紅色顯色最深，B8 表示顯色最淺（即不顯色），此判斷標(biāo)準(zhǔn)由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部制定)，同時(shí)結(jié)合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試顯色，T 線顯色為B3，篩選得到最適T 線抗原濃度。確定T 線濃度后，根據(jù)相應(yīng)的C 線顯色情況，適當(dāng)調(diào)整C 線濃度，使C 線顯色達(dá)到B3 即與T 線一致。最終優(yōu)化得到10 種金標(biāo)免疫層析試紙的T 線和C 線組合。

表1 T 線和C 線顯色比色表Table 1 Color comparison table for T and C lines

1.2.2 金標(biāo)試紙的組裝和制備

金標(biāo)試紙封閉體系：選擇合適的封閉配方和封閉方式，有利于控制層析速度和防止非特異吸附。本研究采用間接封閉模式，將含0.5%金標(biāo)優(yōu)化劑、0.25% BSA、0.25% PVP 及 2%蔗糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的0.01 mol/L的PBST (指含0.05% 吐溫-20體積分?jǐn)?shù)的PBS) 溶液均勻吸附于樣品墊中，于37 ℃條件下真空干燥，制成具備間接封閉性能的樣品墊。

金墊和金杯制備方法：金標(biāo)試紙分為兩種反應(yīng)模式，第1 種為金墊法，將金標(biāo)探針均勻吸附于玻璃纖維膜上，于37 ℃條件下真空干燥2 h，制成金墊。第2 種為金杯法，將金標(biāo)探針加入96 孔板微孔中，于37 ℃條件下真空干燥2 h，干燥后加密封蓋，制成金杯。

金標(biāo)試紙的主要組成部件為襯板、樣品墊、金墊、NC 膜、T 線、C 線和吸水墊，其組裝過程如圖1 所示：T 線(5)和C 線(6)分別包被于NC膜(2) 上，并根據(jù)先后順序，將NC 膜、吸水墊(7)、金墊(4-1)(若使用金杯法則不需要金標(biāo)墊，采用金杯(4-2)、樣品墊(3) 依次粘于襯板(1)上。將組裝好的試紙切成3 mm 寬的試紙條，于室溫干燥柜中保存并控制相對(duì)濕度為30%以下。

圖1 金標(biāo)試紙組裝示意圖Fig.1 Schematic diagram of the composition of the gold immunostrips

1.2.3 免疫層析試紙性能測(cè)試 根據(jù)比色判斷金標(biāo)試紙條對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限測(cè)試結(jié)果，通過手持便攜式讀數(shù)儀識(shí)別試紙檢測(cè)區(qū)域顯色，從而判定農(nóng)藥殘留情況。

準(zhǔn)確量取100 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加于金標(biāo)試紙樣品孔(S)，反應(yīng)10 min 時(shí)判斷T 線顯色情況。T 線顯色等于、深于或略淺于C 線表示樣品中相應(yīng)農(nóng)藥的濃度低于檢出限(陰性)；T 線不顯色表示樣本中相應(yīng)農(nóng)藥的濃度等于或高于檢出限(陽性)。顯色判斷圖示見圖2。

圖2 金標(biāo)試紙顯色判斷圖示Fig.2 Color rendering diagram for gold immunostrips judgment

1.2.4 快速檢測(cè)前處理方法 本研究在儀器參比方法的前處理方法基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)化了前處理試劑與提取方法。由于層析試紙的NC 膜對(duì)有機(jī)溶劑不耐受，通用的乙腈、甲醇和乙酸乙酯等溶劑不能直接用于金標(biāo)試紙條測(cè)試，因而選擇了20%甲醇-0.01 mol/L PBS 為提取試劑，可有效保證金標(biāo)試紙的測(cè)試效果。

準(zhǔn)確稱取1.0 g 勻漿豇豆樣品至15 mL 離心管中，加入5 mL 20%甲醇-0.01 mol/L PBS，渦旋振蕩30 s，于4000 r/min 下離心3 min；取上清液，根據(jù)不同農(nóng)藥的檢測(cè)要求，用20%甲醇-0.01 mol/L PBS 進(jìn)行不同比例的稀釋，稀釋后取100 μL 用于金標(biāo)試紙快速檢測(cè)。檢測(cè)流程示意圖見圖3。

圖3 豇豆快速檢測(cè)流程示意圖Fig.3 Diagram of cowpea rapid detection process

1.2.5 儀器比對(duì)驗(yàn)證方法 參考GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[35]建立豇豆上10 種農(nóng)藥的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLCMS/MS)分析方法，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化方法。

樣品制備、提取與凈化：準(zhǔn)確稱取 20 g 豇豆勻漿樣品(精確至0.01 g)于250 mL 燒杯中，加入40 mL 乙腈，用高速勻漿機(jī)在15 000 r/min 勻漿提取1 min，用布氏漏斗抽濾液倒入裝有5 g 氯化鈉的100 mL 具塞量筒中，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min 后于室溫下靜置30 min；吸取10 mL 有機(jī)相，放入50 mL 燒杯中，置于80 ℃水浴鍋中，并向杯內(nèi)緩緩?fù)ㄈ氲獨(dú)?，將乙腈蒸發(fā)至近干；加入2.0 mLV(甲醇) :V(二氯甲烷) = 1 : 9溶液溶解，蓋上鋁箔，待凈化。將氨基凈化柱用4.0 mLV(甲醇) :V(二氯甲烷)=1 : 9 溶液淋洗，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即加入上述待凈化溶液，收集洗脫液，用4.0 mLV(甲醇) :V(二氯甲烷)=1 : 9溶液淋洗燒杯后過柱，合并洗脫液；將洗脫液氮吹至近干，用甲醇定容至2.0 mL，超聲溶解后加入超純水定容至5.0 mL，混勻，過0.2 μm 濾膜，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定條件：Waters C18不銹鋼色譜柱(2.1 mm × 100 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相A 為5 mmol/L 乙酸銨水溶液，B 為甲醇；流速0.3 mL/min。流動(dòng)相梯度洗脫條件：0～2min，80%～20% A；＞ 2～4min，20～5% A；＞ 4～6 min，5% A；＞ 6～6.1 min，5%～80% A； ＞ 6.1～8min；80%。柱溫40 ℃；進(jìn)樣量1 μL。電噴霧(ESI)離子源；正離子和負(fù)離子同時(shí)掃描方式；ESI 正離子電壓5000 V，ESI 負(fù)離子電壓 -4500 V；離子源溫度500 ℃；輔助加熱氣379 kPa；氣簾氣壓力241 kPa；監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓和碰撞能見表2。

表2 10 種農(nóng)藥的監(jiān)測(cè)離子對(duì)和電壓參數(shù)Table 2 Monitoring ion pairs and voltage parameters of 10 pesticides

1.3 方法評(píng)價(jià)

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液檢出限評(píng)價(jià) 采用20% 甲醇-0.01mol/L PBS 配制10 種農(nóng)藥的0.001～1 mg/L 梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用相應(yīng)的農(nóng)藥金標(biāo)免疫層析試紙檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液。用1.2.3 節(jié)方法判斷檢測(cè)結(jié)果，以陽性樣本的最小標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度作為檢出限。

1.3.2 豇豆中10 種農(nóng)藥檢出限評(píng)價(jià) 向空白豇豆樣品中獨(dú)立添加10 種農(nóng)藥的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品充分混勻并靜置2 h后，按照1.2.4 節(jié)方法進(jìn)行提取，提取液用于相應(yīng)農(nóng)藥金標(biāo)試紙檢測(cè)。

1.3.3 交叉反應(yīng)率評(píng)價(jià) 基于抗原抗體的免疫識(shí)別特性，特定農(nóng)藥抗體對(duì)結(jié)構(gòu)類似物可能存在一定的交叉反應(yīng)。10 種農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)類似物(以目標(biāo)農(nóng)藥—結(jié)構(gòu)類似農(nóng)藥表述)：克百威—3-羥基克百威、丁硫克百威、異丙威、涕滅威、甲萘威、滅多威；三唑磷—二嗪磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、對(duì)硫磷、丙溴磷、辛硫磷；毒死蜱—甲基毒死蜱、三唑磷、二嗪磷、對(duì)硫磷、丙溴磷、辛硫磷；啶蟲脒—吡蟲啉、氯噻啉、噻蟲嗪、噻蟲胺、呋蟲胺、烯啶蟲胺；異菌脲—乙烯菌核利、腐霉利；吡唑醚菌酯—醚菌酯、嘧菌酯、肟菌酯；多菌靈—甲基硫菌靈；腐霉利—乙烯菌核利、異菌脲；滅蠅胺—敵菌靈；甲氰菊酯—氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、溴氰菊酯。用20% 甲醇-0.01 mol/L PBS 溶液配制結(jié)構(gòu)類似農(nóng)藥的0.01～10 μg/mL 梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，用相應(yīng)金標(biāo)試紙檢測(cè)結(jié)構(gòu)類似農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)出相應(yīng)檢出限，最后根據(jù)目標(biāo)農(nóng)藥檢出限與交叉反應(yīng)農(nóng)藥檢出限按公式(1)計(jì)算交叉反應(yīng)率(CRR)。

1.3.4 準(zhǔn)確性評(píng)價(jià) 按照1.2.4 節(jié)的方法提取豇豆樣品，得到豇豆基質(zhì)溶液，進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析，外標(biāo)法定量，確認(rèn)豇豆中未檢出10 種農(nóng)藥，即空白豇豆樣品。用該空白基質(zhì)溶液將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋成0.01、0.1、0.2、0.5 和1 mg/L 的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。以農(nóng)藥的質(zhì)譜響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

向豇豆空白樣品中分別添加0、0.1、0.5、1、2 和10 倍檢出限(mg/kg) 6 個(gè)水平的10 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)5 次，按照1.2.3 節(jié)和1.2.4節(jié)的方法進(jìn)行樣品檢測(cè)分析，每個(gè)樣品檢測(cè)3 次。檢測(cè)結(jié)果用陽性和陰性表示，結(jié)果用于假陽性率、假陰性率和準(zhǔn)確率的評(píng)價(jià)，統(tǒng)計(jì)方法參考文獻(xiàn)[36]。

1.3.5 不同檢測(cè)方法對(duì)實(shí)際樣品的比對(duì)測(cè)試 選取浙江省36 個(gè)縣級(jí)市或區(qū)的田間豇豆樣品各1 份，用HPLC-MS/MS 分析方法(1.2.5 節(jié))定量檢測(cè)10 種農(nóng)藥的殘留量，每份樣品3 個(gè)重復(fù)；同時(shí)36 份樣品用快速檢測(cè)前處理和金標(biāo)免疫層析試紙測(cè)試方法(1.2.3 節(jié)和1.2.4 節(jié)) 進(jìn)行樣品檢測(cè)分析，每份樣品3 個(gè)重復(fù)。統(tǒng)計(jì)儀器定量結(jié)果與快速檢測(cè)結(jié)果，并對(duì)快速檢測(cè)方法與儀器參比方法進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)[36]。

2 結(jié)果與分析

2.1 金標(biāo)免疫層析試紙關(guān)鍵性參數(shù)

結(jié)果見表3。在最適pH 值和最適抗體穩(wěn)定量下制備得到的金標(biāo)抗體具有最優(yōu)探針顯色效果，并可有效識(shí)別相應(yīng)農(nóng)藥；劃膜10 種農(nóng)藥免疫層析試紙，優(yōu)化得到最適T 線和C 線所用試紙的濃度組合；在最適金標(biāo)免疫探針和T/C 線組合條件下，測(cè)試得到標(biāo)準(zhǔn)溶液檢出限，參照豇豆中農(nóng)藥MRL 值要求[6-7]，選擇金墊或金杯反應(yīng)模式。若金墊法檢出限低于我國(guó)MRL 值，則采用金墊法；若金墊法檢出限高于我國(guó)MRL 值，則采用金杯法，通過金標(biāo)抗體與樣品預(yù)反應(yīng)，從而提高檢測(cè)靈敏度。

表3 10 種農(nóng)藥的金標(biāo)免疫層析試紙關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化值Table 3 Optimization values of key parameters in gold labeled immunochromatographic test strips for 10 pesticides

2.2 快速前處理方法優(yōu)化

由于豇豆樣品中農(nóng)藥的檢出限與MRL 值存在一定差異，因而需要對(duì)前處理方法進(jìn)行優(yōu)化。按1.2.4 節(jié)的前處理方法，結(jié)合我國(guó)規(guī)定的在豇豆中相應(yīng)農(nóng)藥的MRL 值，對(duì)豇豆中農(nóng)藥添加樣品的快速提取液進(jìn)行HPLC-MS/MS 定量檢測(cè)，每個(gè)添加樣品重復(fù)3 次，同時(shí)對(duì)提取液進(jìn)行不同比例稀釋，之后進(jìn)行快速檢測(cè)。結(jié)果 (表4) 表明：克百威、三唑磷、毒死蜱和多菌靈提取后無需稀釋，吡唑醚菌酯、滅蠅胺和甲氰菊酯提取后需稀釋2 倍，異菌脲提取后稀釋4 倍，啶蟲脒提取后稀釋16 倍，腐霉利提取后稀釋50 倍，可用于金標(biāo)試紙檢測(cè)，而毒死蜱的檢測(cè)靈敏度尚不能達(dá)到MRL 值要求。

表4 采用HPLC-MS/MS 驗(yàn)證前處理方法回收率與試紙檢測(cè)靈敏度Table 4 Using HPLC-MS/MS to verify recoveries of the sample preparation method and the sensitivity of the test-strip detection method

2.3 快速檢測(cè)方法性能評(píng)價(jià)

2.3.1 豇豆樣品檢出限 檢出限測(cè)定結(jié)果(表5)表明，10 種農(nóng)藥在豇豆中的檢出限除毒死蜱(0.25 mg/kg) 與MRL 值存在一定差距外，其他9 種農(nóng)藥的檢出限均可達(dá)到MRL 值要求[6-7]。典型的試紙條檢測(cè)實(shí)物圖見圖4。

圖4 豇豆中10 種農(nóng)藥的試紙條檢測(cè)實(shí)物圖Fig.4 Illustration of the detection results of the 10 pesticides in cowpeas using the test-strip method

表5 豇豆樣品中10 種農(nóng)藥的檢出限和MRL 值Table 5 Detection limit and MRL values of 10 pesticides in cowpea samples

2.3.2 特異性 交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果表明，除克百威金標(biāo)試紙對(duì)丁硫克百威和異丙威交叉反應(yīng)為10%外，其余農(nóng)藥金標(biāo)試紙對(duì)結(jié)構(gòu)類似農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率均 ＜ 1%。表明當(dāng)豇豆樣品中丁硫克百威或異丙威的殘留量≥ 0.2 mg/kg 時(shí)，可以被克百威金標(biāo)試紙檢出，而其余9 種農(nóng)藥的金標(biāo)試紙具備高特異性，與結(jié)構(gòu)類似的農(nóng)藥無交叉性反應(yīng)。另外，由于菊酯類農(nóng)藥在水中溶解度極低，存在提取不充分的因素，需在后續(xù)研究中繼續(xù)改進(jìn)。

2.3.3 準(zhǔn)確性 在0.01～1 mg/L 濃度范圍內(nèi)，豇豆基質(zhì)中10 種農(nóng)藥線性關(guān)系良好，決定系數(shù)R2均大于 0.992，表明儀器方法準(zhǔn)確性良好，可用于定量分析。

對(duì)空白豇豆樣品中10 種農(nóng)藥的0、0.1、0.5、1、2 和10 倍檢出限添加樣品的快速檢測(cè)結(jié)果顯示：1、2 和10 倍檢出限的添加樣品均為陽性，0 和0.1 倍檢出限的添加樣品均為陰性，0.5 倍檢出限的添加樣品存在≤ 11.1%比例的假陽性，方法準(zhǔn)確率≥ 94.4%。以甲氰菊酯為例，典型的試紙條檢測(cè)實(shí)物圖見圖5。10 種農(nóng)藥快速檢測(cè)方法假陽性率、假陰性率和準(zhǔn)確率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖6。

圖5 豇豆中甲氰菊酯添加樣品的試紙條檢測(cè)實(shí)物圖Fig.5 Illustrations of the detection results on the test strips for the spiked cowpea samples with different levels of fenpropathrin

圖6 豇豆中10 種農(nóng)藥添加樣品的快速檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)Fig.6 Accuracy of the rapid test results for the spiked cowpea samples with 10 pesticides

2.3.4 實(shí)用性 機(jī)抽檢浙江省36 個(gè)縣市區(qū)的36 份豇豆樣品，將本研究建立的快速檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的HPLC-MS/MS 方法進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表6所示，其中，1.2.4 節(jié)快速檢測(cè)方法檢測(cè)得出陽性和陰性結(jié)果，其中陽性表示樣品中相應(yīng)農(nóng)藥濃度高于或等于MRL，陰性表示樣品中相應(yīng)農(nóng)藥濃度低于MRL。結(jié)果顯示：36 份豇豆樣品中克百威超標(biāo)1 個(gè)、三唑磷超標(biāo)2 個(gè)、毒死蜱超標(biāo)1 個(gè)、吡唑醚菌酯超標(biāo)1 個(gè)、多菌靈超標(biāo)1 個(gè)、滅蠅胺超標(biāo)1 個(gè)，其余4 種農(nóng)藥有檢出，但均未超標(biāo)。快速檢測(cè)方法結(jié)果與定量檢測(cè)方法結(jié)果比對(duì)，其準(zhǔn)確率≥ 97.2%，表明該快速檢測(cè)方法在實(shí)際樣品分析中具有較強(qiáng)的實(shí)用性。

表6 豇豆實(shí)際樣品定量檢測(cè)和快速檢測(cè)比對(duì)結(jié)果Table 6 Comparison results of quantitative testing and rapid testing of actual cowpea samples

3 結(jié)論與討論

本研究建立了豇豆樣品中10 種農(nóng)藥殘留的金標(biāo)免疫層析試紙快速檢測(cè)方法，并采用真實(shí)樣品進(jìn)行HPLC-MS/MS 檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，快速檢測(cè)方法準(zhǔn)確率可達(dá)97.2%以上。所建立的金標(biāo)試紙除毒死蜱外，克百威、三唑磷、啶蟲脒、異菌脲、吡唑醚菌酯、多菌靈、腐霉利、滅蠅胺和甲氰菊酯9 種金標(biāo)試紙對(duì)豇豆中相應(yīng)農(nóng)藥的檢出限均滿足我國(guó)MRL 標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)要求。雖然毒死蜱快速檢測(cè)方法的檢出限0.25 mg/kg 與豇豆中MRL 0.02 mg/kg存在差距，但在實(shí)際樣品檢測(cè)中，毒死蜱殘留量為0.310 mg/kg 的豇豆樣品快速檢測(cè)結(jié)果顯示陽性，可以用于毒死蜱超標(biāo)高風(fēng)險(xiǎn)樣品的快速篩查。除克百威金標(biāo)試紙對(duì)丁硫克百威和異丙威存在10%交叉反應(yīng)外，三唑磷、毒死蜱、啶蟲脒、異菌脲、吡唑醚菌酯、多菌靈、腐霉利、滅蠅胺和甲氰菊酯9 種金標(biāo)試紙具有高特異性，與其結(jié)構(gòu)類似農(nóng)藥物無明顯交叉反應(yīng)。GB 2763—2021 中規(guī)定，除克百威的殘留物以克百威及3-羥基克百威之和表示外，其他9 種農(nóng)藥的殘留物中無代謝物，因此克百威的快速檢測(cè)結(jié)果不能指示其代謝物3-羥基克百威的殘留情況。

綜上所述，金標(biāo)快速檢測(cè)方法可實(shí)現(xiàn)豇豆中10 種農(nóng)藥殘留的快速、準(zhǔn)確及定性分析。樣品的前處理過程簡(jiǎn)易、快速、環(huán)保，樣品前處理和金標(biāo)試紙檢測(cè)時(shí)間僅需15 min，提取溶液為20%甲醇PBS 溶液，極大地減少了分析樣品時(shí)間和有機(jī)溶劑用量，有較強(qiáng)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)實(shí)用性，可為豇豆中10 種農(nóng)藥殘留的快速篩查提供技術(shù)保障，并為建立我國(guó)豇豆中農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)金標(biāo)免疫層析方法標(biāo)準(zhǔn)提供重要的參考數(shù)據(jù)。