新殺菌劑inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎的毒性效應

符 康, 苗鴻飛, 劉艷霞, 李寶玲, 金銀銀,李宗杰, 汪星宇, 柴婷婷, 崔 峰*,

(1.浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術學院，浙江省綠色農(nóng)藥 2011 協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學 食品與健康學院，杭州 311300)

Inpyrfluxam [圖式1，CAS：1352994-67-2，化學名稱為3-(二氟甲基)-N-[(R)-2,3-二氫-1,1,3-三甲基-1H-茚-4-基]-1-甲基吡唑-4-甲酰胺]是由日本住友化學公司開發(fā)的新型琥珀酸脫氫酶抑制劑(succinate dehydrogenase inhibitor, SDHI) 類殺菌劑，其作用機理是通過抑制病原菌線粒體呼吸電子傳遞鏈上的蛋白復合體II 進而阻斷能量代謝，最終導致病原菌死亡[1]。Inpyrfluxam 具有高效、廣譜的殺菌活性，適用于大豆、水稻、谷物等多種作物的病害防治[2]。2020 年3 月，inpyrfluxam在日本取得了全球首個登記，后陸續(xù)于加拿大、美國、巴西登記上市[3]。

圖式 1 Inpyrfluxam 化學結構式Scheme 1 The structural formula of inpyrfluxam

近年來，隨著SDHI 類殺菌劑的大量應用，導致其在環(huán)境水體中被頻繁檢出[4]。據(jù)報道，大部分SDHI 類殺菌劑對水生生物具有較高毒性[4]。如苯丙烯氟菌唑對鯉魚和虹鱒魚的96 h-LC50值分別為3.5 和9.1 μg/L[5]，吡唑萘菌胺對斑馬魚胚胎的96 h-LC50值為230 μg/L[6]。除致死效應外，SDHI類殺菌劑還可影響水生生物的生長發(fā)育。Wu 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，500 μg/L 的聯(lián)苯吡菌胺和吡唑萘菌胺可造成熱帶爪蟾胚胎色素減退、眼睛晶狀體渾濁、尾軸短縮及鰭窄小，且畸形率可高達100%。1.1 mg/L 氟唑菌酰胺暴露48 h 后，斑馬魚胚胎孵化被顯著抑制，出現(xiàn)卵黃囊水腫、心包水腫等畸形，并伴隨心率顯著下降[8]。錢樂[9]的研究表明，1.0 mg/L 啶酰菌胺處理28 d 可導致斑馬魚成魚體重和體長被顯著抑制。綜上，SDHI 類殺菌劑對水生生物的毒性風險應引起廣泛關注。Inpyrfluxam作為一種新型SDHI 類殺菌劑，其對非靶標生物尤其是水生生物的毒性效應尚未見報道。本研究擬以斑馬魚胚胎為試驗生物，開展暴露試驗，以探明新殺菌劑inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎的致死毒性和發(fā)育毒性效應，旨在為inpyrfluxam 的合理使用和環(huán)境安全性評價提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚飼養(yǎng)與胚胎收集

野生型斑馬魚Danio rerio親魚 (AB 品系，4 月齡) 購于南京一樹梨花生物科技有限公司，飼養(yǎng)于斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng) (北京愛生科技發(fā)展有限公司)。飼養(yǎng)用水為ISO 標準水[10]，保持水溫 (27 ±1) ℃，光照/黑暗周期為14 h : 10 h，每天喂食3 次新鮮孵化的豐年蝦。試驗前一天傍晚挑選發(fā)育一致的健康斑馬魚親魚，按照雌雄比例1 : 1 放入產(chǎn)卵盒中，用隔板將雌雄魚隔開。次日早晨光照開始后抽開隔板，待雌雄魚自由追逐交配產(chǎn)卵后，收集受精2 h (2 hours post fertilization, 2hpf)的健康胚胎用于暴露試驗。

1.2 儀器與試劑

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀 (美國Waters 公司)；CX23 生物顯微鏡 (日本Olympus公司)；RXZ 智能人工氣候箱 (寧波江南儀器制造廠)；Milli-Q 超純水系統(tǒng) (美國 Millipore 公司)。

99.3% inpyrfluxam 標準品 (廣州佳途科技股份有限公司)；丙酮 (分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)；乙腈 (色譜純，北京迪馬科技有限公司)；甲酸 (色譜純，阿拉丁試劑有限公司)；99.5%氯化鈉 (分析純，上海邁瑞爾化學技術有限公司)。

1.3 致死毒性暴露試驗

參照 OECD 236 準則[11]和Lin 等[12]的方法進行。用丙酮將inpyrfluxam 配制成母液，在預實驗的基礎上，用ISO 標準水稀釋inpyrfluxam 母液配制成質量濃度分別為0.050、0.055、0.060、0.065、0.070 和0.075 mg/L 的暴露藥液，并設置空白對照組 (ISO 標準水) 和與暴露藥液含相同體積丙酮的溶劑對照組 (丙酮體積分數(shù)為 0.01%)。試驗在200 mL燒杯中進行，每個燒杯裝有150 mL的暴露溶液和20 枚2 hpf 的健康胚胎，每個濃度和對照設置3 個重復。將胚胎置于溫度為 (2 7 ± 1) ℃，光照/黑暗周期為14 h:10 h 的智能人工氣候箱中培養(yǎng)至96 hpf。暴露試驗期間每24 h 更換全部暴露藥液并在顯微鏡下觀察胚胎死亡情況 (死亡標志為卵凝結、發(fā)育停滯和心跳停止[13])，及時清除死亡胚胎并記錄死亡個數(shù)，根據(jù)胚胎死亡率求出LC50值。

1.4 發(fā)育毒性暴露試驗

根據(jù)致死毒性試驗結果，設置0.045、0.050、0.055、0.060 和0.065 mg/L 5 個暴露濃度，同時設置空白對照組和溶劑對照組。暴露方法同1.3 節(jié)。每24 h 在顯微鏡下檢查胚胎發(fā)育情況并清除死亡個體，記錄畸形類型、畸形個數(shù)、孵化個數(shù)，計算孵化率和畸形率。分別于48、72 和96 hpf，從每個重復中隨機選取5 個存活胚胎，在顯微鏡下統(tǒng)計20 s 內心跳次數(shù)。96 hpf 時，每重復隨機選取5 條存活的孵化仔魚測量體長。

1.5 暴露藥液inpyrfluxam 實際質量濃度測定

在暴露試驗開始時和暴露24 h 更換藥液前，分別從每個重復中取10 mL 暴露藥液至50 mL 離心管中，加入10 mL 乙腈，渦旋30 s，再加入5 g氯化鈉渦旋30 s，于7000 r/min 離心3 min。取0.5 mL 上清液，加入0.5 mL 超純水混勻，經(jīng)0.22 μm 的有機濾膜過濾后轉入1.5 mL 進樣瓶中。采用高效液相色譜法 (HPLC) 進行檢測。色譜條件如下：C18色譜柱 (2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm)；進樣量10 μL；流動相為V(乙腈) :V(0.1%甲酸水溶液) ＝70 : 30；流速0.2 mL/min；紫外檢測波長240 nm；檢測時間為7 min。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0 進行數(shù)據(jù)分析，用概率單位法計算LC50值。獨立樣本T 檢驗結果顯示，空白對照組和溶劑對照組胚胎所有指標均無顯著差異，故在本研究中使用溶劑對照組數(shù)據(jù)進行結果分析和討論。處理組和對照組之間的差異采樣單因素方差分析 (ANOVA) 和Dunnett 分析，P＜ 0.05，表示差異顯著；P＜ 0.01，表示差異極顯著。使用GraphPad 8.0.2 對數(shù)據(jù)進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 暴露藥液中inpyrfluxam 實際質量濃度測定結果

如表1 所示，所有暴露藥液中inpyrfluxam 實際質量濃度在0～24 h 之間與理論質量濃度的偏差均低于20%，因此，本研究中，inpyrfluxam 藥液的理論質量濃度可以代表實際質量濃度[10]。

2.2 Inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎的致死毒性

試驗結果顯示，inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎具有較強的致死能力，其對斑馬魚胚胎的72 h-LC50值和96 h-LC50值分別為0.068 mg/L 和0.063 mg/L(表2)。根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》中農(nóng)藥對魚類的毒性分級標準[14]，inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎的毒性等級為劇毒。

2.3 Inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎的致畸效應

如圖1 所示，inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎具有明顯的致畸效應，可引起斑馬魚胚胎卵黃囊水腫(yolk sac edema, Yse)、心包水腫 (pericardial edema,Pe) 以及脊柱彎曲 (spinal curvature, Sc)。從圖2-A可以看出，斑馬魚胚胎的畸形率隨inpyrfluxam質量濃度和暴露時間的增加而顯著上升?；卧?8 hpf 開始顯著出現(xiàn)在0.050 mg/L 處理組中，胚胎畸形率為18.3%；當質量濃度上升至0.065 mg/L時，畸形率增大至93.3%。在96 hpf，0.065 mg/L處理組胚胎的畸形率高達96.7%。卵黃囊水腫和心包水腫是inpyrfluxam 引起的兩種主要畸形癥狀。卵黃囊水腫率統(tǒng)計結果如圖2-B 所示，隨著暴露濃度的升高，胚胎卵黃囊水腫率逐漸增大。在48 hpf，卵黃囊水腫率由0.050 mg/L 處理組的15.0%上升至0.065 mg/L 處理組的93.3%。而隨著暴露時間的延長，卵黃囊水腫率略有下降，96 hpf時0.065 mg/L 處理組胚胎卵黃囊水腫率降至75.0%。由圖2-C 可以看出，心包水腫率隨暴露濃度和時間的增加而顯著上升，從16.7% (0.055 mg/L，48 hpf) 上升至83.3% (0.065 mg/L，96 hpf)。

圖1 Inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎的致畸作用Fig.1 Embryonic malformations caused by inpyrfluxam after exposure

圖2 Inpyrfluxam 暴露后斑馬魚胚胎的累計畸形率 (A)、卵黃囊水腫率 (B) 和心包水腫率 (C)Fig.2 The cumulative deformity rate (A), Yse rate (B) and Pe rate (C) of zebrafish embryos after inpyrfluxam exposure

2.4 Inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎孵化的影響

由圖3 可以看出，inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎孵化具有顯著抑制作用。對照組胚胎從72 hpf 開始孵化，96 hpf 時所有胚胎完成孵化。隨著暴露濃度的升高，斑馬魚胚胎的孵化率逐漸降低。72 hpf 時，胚胎孵化率由對照組的71.7%顯著降低至0.060 mg/L 處理組的5.0%，而0.065 mg/L 處理組的胚胎均未孵化。在96 hpf 時，0.065 mg/L處理組的胚胎孵化率僅26.7%。

圖3 Inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎孵化率的影響Fig.3 Effect of inpyrfluxam on the hatching rate of zebrafish embryos

2.5 Inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎心跳的影響

Inpyrfluxam 暴露后，斑馬魚胚胎的心跳被顯著抑制，并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應關系 (圖4)。在48 hpf，0.050 mg/L inpyrfluxam 處理組斑馬魚胚胎心跳次數(shù)顯著降低至對照組的88.0%，當inpyrfluxam濃度升高至0.065 mg/L 時，胚胎心跳次數(shù)下降至對照組的64.9%。72 hpf 時，0.045 mg/L inpyrfluxam即可顯著抑制胚胎心跳。在96 hpf，0.065 mg/L inpyrfluxam 處理組斑馬魚胚胎心跳次數(shù)僅為對照組的45.3%。

圖4 Inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎心跳的影響Fig.4 Effect of inpyrfluxam on the heartbeat of zebrafish embryos

2.6 Inpyrfluxam 對96 hpf 孵化仔魚體長的影響

如圖5 所示，96 hpf 時，孵化的斑馬魚仔魚體長隨inpyrfluxam 暴露濃度的升高逐漸降低。0.055 mg/L inpyrfluxam 處理組中，仔魚體長顯著減小至對照組的94.3%；當inpyrfluxam 增加至0.065 mg/L 時，仔魚體長下降至對照組的82.7%。

圖5 Inpyrfluxam 對96 hpf 孵化仔魚體長的影響Fig.5 Effect of inpyrfluxam on the body length of the hatched larvae at 96 hpf

3 結論與討論

致死毒性試驗結果顯示，inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎的96 h-LC50為0.063 mg/L，參照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》中農(nóng)藥對魚類的毒性等級標準[14]，inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎為劇毒。李紅等[4]收集了噻呋酰胺等7 種常用SDHI 類殺菌劑對斑馬魚胚胎的毒性數(shù)據(jù)，除苯并烯氟菌唑對斑馬魚胚胎96 h-LC50值為0.041 mg/L 外，其余6 種SDHI 類殺菌劑的96 h-LC50值 (0.547～3.690 mg/L) 均遠高于inpyrfluxam。由此可見，inpyrfluxam 對魚類的致死能力可能強于大部分同類殺菌劑，其對水生生物的毒性風險亟需引起足夠的重視。

除致死效應外，inpyrfluxam 對斑馬胚胎具有較強的致畸作用，畸形率隨著inpyrfluxam 濃度和暴露時間的增加而顯著上升。在48 hpf 時，inpyrfluxam暴露組胚胎開始出現(xiàn)嚴重的卵黃囊水腫。類似的情況在噻呋酰胺、啶酰菌胺、吡噻菌胺等其他SDHI 類殺菌劑處理后的斑馬魚胚胎中也有報道[9,15]。在卵生魚類胚胎中，內源性脂質主要儲存于卵黃囊中，脂質代謝若被干擾可導致卵黃囊異常[16]。已有研究表明，SDHI 類殺菌劑可造成斑馬魚胚胎脂質代謝紊亂[15]，因此在本研究中，inpyrfluxam可能影響了胚胎的脂質代謝從而導致卵黃囊水腫，相關機制需要進一步研究證實。心臟是斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的第一個功能性器官[17]。本研究發(fā)現(xiàn)inpyrfluxam 暴露后，斑馬魚胚胎發(fā)生嚴重的心包水腫。心包水腫是心臟毒性的典型特征[18]，因此，心臟可能是inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎的重要靶器官。大量研究表明，其他SDHI 類殺菌劑亦可導致斑馬魚胚胎心包水腫[19-21]。此外，inpyrfluxam處理后斑馬魚胚胎心率顯著下降，這可能與卵黃囊病變有關。據(jù)報道，斑馬魚胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)物質主要來儲存于卵黃囊中，卵黃囊發(fā)育異常會導致營養(yǎng)供應不足[22]。心臟的正常運轉需要消耗大量的能量[23]，若營養(yǎng)供應障礙造成能量供應不足，心臟的正常工作就會受到影響，進而導致心率降低。此外，inpyrfluxam 暴露還可導致斑馬魚胚胎脊柱彎曲。這種發(fā)育缺陷會影響斑馬魚捕獲食物和逃離天敵的能力，從而影響到斑馬魚的生存[24-25]。

研究發(fā)現(xiàn)，inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎發(fā)育有顯著的抑制作用。孵化抑制是inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎發(fā)育的主要影響之一。隨著暴露濃度的升高，斑馬魚胚胎的孵化率逐漸降低；在96 hpf，0.065 mg/L 處理組的胚胎孵化率僅為26.7%。此外，inpyrfluxam 還可顯著抑制孵化后的仔魚體長。0.055 mg/L 及更高濃度inpyrfluxam 處理組中斑馬魚仔魚體長均較對照組顯著減小，0.065 mg/L處理組中仔魚體長僅為對照組的82.7%。已有研究表明，其他SDHI 類殺菌劑亦可抑制斑馬魚胚胎孵化率及仔魚體長[4]。有關inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎發(fā)育的抑制機理需進一步探究。

綜上，inpyrfluxam 對斑馬魚胚胎具有較強的致死和發(fā)育毒性。據(jù)報道，inpyrfluxam 難以被光解、水解，其在水中的半衰期超過1 年[26]。因此，inpyrfluxam 對水生生物的潛在風險不容忽視，有必要進一步加強inpyrfluxam 對水生生物毒性及作用機理的研究，為inpyrfluxam 的科學合理使用和環(huán)境安全風險評價提供充足的參考依據(jù)。