木質(zhì)素基苯醚甲環(huán)唑納米顆粒構(gòu)建及防控楊梅凋萎病研究

張 啟, 張家棟, 方 云, 熊秋雨, 王 嶸,程敬麗, 孫 鸝, 趙金浩*,

(1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲(chóng)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省作物病蟲(chóng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058；2.浙江省蘭溪市經(jīng)濟(jì)特產(chǎn)技術(shù)推廣中心，浙江 蘭溪 321100；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，杭州 310021)

楊梅凋萎病于2004 年首次在浙江發(fā)現(xiàn)[1]，目前已成為南方楊梅樹(shù)生長(zhǎng)的主要病害。染病初期，楊梅樹(shù)嫩梢部分枯萎，隨著病情加重，小枝枯死會(huì)發(fā)展為大枝枯死，進(jìn)而引起主干枯死[2-3]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，楊梅凋萎病主要以化學(xué)農(nóng)藥防治為主[4]。市場(chǎng)上的農(nóng)藥主要是懸浮劑和可濕性粉劑等傳統(tǒng)制劑，存在農(nóng)藥助劑用量高、農(nóng)藥液滴粒徑大和容易漂移流失的弊端[5]，易導(dǎo)致環(huán)境污染、藥效期縮短和利用率降低等問(wèn)題[6]。此外，農(nóng)藥施用后易受到各種因素的影響，比如葉片彈跳滾落、地表徑流和農(nóng)藥降解等[7]，部分藥液無(wú)法到達(dá)靶標(biāo)部位，導(dǎo)致農(nóng)藥利用率偏低和農(nóng)藥環(huán)境富集等問(wèn)題[8]。而與納米技術(shù)相結(jié)合的納米農(nóng)藥為解決該問(wèn)題提供了新的研究思路。納米農(nóng)藥具有粒徑小、比表面積和分散性高等特點(diǎn)，可以提高農(nóng)藥的持效期和葉面親和性[9]，并有望通過(guò)減少農(nóng)藥助劑的使用來(lái)最大限度地降低環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

現(xiàn)已有多種以木質(zhì)素類材料為納米載體制備納米農(nóng)藥的報(bào)道[10]。木質(zhì)素是地球上最豐富的生物聚合物之一，其化學(xué)結(jié)構(gòu)可能因木質(zhì)素來(lái)源而異[11]。近年來(lái)，木質(zhì)素磺酸鹽及其改性衍生物因具有成本低、生物降解性好、紫外吸收能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，受到納米農(nóng)藥領(lǐng)域的關(guān)注。但由于木質(zhì)素磺酸鹽的強(qiáng)水溶性，限制了其在納米農(nóng)藥諸多制備方法中的使用，比如界面聚合法、溶劑揮發(fā)法、溶劑交換法等，對(duì)木質(zhì)素磺酸鹽進(jìn)行改性，提高其脂溶性，拓寬其使用范圍，成為研究的熱點(diǎn)[12]。苯醚甲環(huán)唑 (difenoconazole) 是一種廣譜性殺菌劑，對(duì)多種病害有良好的防效，尤其對(duì)引起楊梅凋萎病的病原真菌有良好的防控作用[13]。本研究以苯醚甲環(huán)唑?yàn)楣┰囁巹帽郊姿狒麑?duì)木質(zhì)素磺酸鈉進(jìn)行疏水性改性后負(fù)載苯醚甲環(huán)唑，制備了木質(zhì)素基苯醚甲環(huán)唑納米顆粒，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，并進(jìn)一步評(píng)估了該制劑的穩(wěn)定性、藥效持留期及其對(duì)楊梅凋萎病的防控效果。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

苯甲酸酐和木質(zhì)素磺酸鈉 (分析純，上海笛柏生物科技有限公司)；十二烷基硫酸鈉 (純度93%，山東優(yōu)索化工科技有限公司，SDS)；氯化鈉、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、二氯甲烷 (DCM)、三乙胺 (TEA)、異丙醇、無(wú)水硫酸鎂和乙腈 (分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙二胺-N-丙基硅烷 (分析純，月旭科技 (上海) 股份有限公司，簡(jiǎn)稱PSA)；氯化鋰和十八烷基硅烷鍵合硅膠 (分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司)。10%苯醚甲環(huán)唑微乳劑 (河北威遠(yuǎn)生物化工有限公司，簡(jiǎn)稱Di ME)；十六烷基三甲基溴化銨 (分析純，上海展云化工有限公司，簡(jiǎn)稱CTAB)；苯乙基酚聚氧乙烯醚 (分析純，江蘇省海安石油化工廠，簡(jiǎn)稱農(nóng)乳602)；93%十二烷基硫酸鈉 (簡(jiǎn)稱SDS) 和辛基苯酚聚氧乙烯醚 (簡(jiǎn)稱OP-10) (山東優(yōu)索化工科技有限公司)；椰油酰胺丙基甜菜堿 (分析純，上海源葉生物科技有限公司，簡(jiǎn)稱CAB)；苯醚甲環(huán)唑原藥 (difenoconazole，純度96%，武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，簡(jiǎn)稱Di Tech)。

楊梅凋萎病的致病菌，由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物所從楊梅凋萎病的病枝上進(jìn)行病菌分離和純化，并提取病菌的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，在GenBank 中進(jìn)行同源性分析比較，確定致病菌種屬。

LGJ-10 真空冷凍干燥機(jī) (北京松源華興科技有限公司)；LC-20A 高效液相色譜儀 (日本島津株式會(huì)社)；Zetasizer Nano ZS-90 馬爾文激光粒度儀(英國(guó)馬爾文公司)；G300 掃描電子顯微鏡 (德國(guó)卡爾蔡司公司)；Nicolet Ava-tar370傅里葉變換紅外光譜儀 (美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；BS210S 電子天平 (德國(guó)賽多利斯公司)；TG-16 高速離心機(jī) (四川蜀科儀器有限公司)；Turbiscan Lab 穩(wěn)定性分析儀 (法國(guó)Formulation 儀器公司)；RXZ-310C 恒溫光照培養(yǎng)箱 (寧波江南儀器制造廠)；GC-2010 Plus 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (日本島津公司)。

1.2 木質(zhì)素磺酸鹽納米農(nóng)藥顆粒的制備

1.2.1 苯甲酸酯化的木質(zhì)素磺酸鈉 (BLS) 的制備參考文獻(xiàn)方法[14]進(jìn)行。將1 g 木質(zhì)素磺酸鈉在90 ℃下攪拌溶解于15 mL 質(zhì)量濃度為10% 的LiCl/DMF 溶液中，降至室溫后，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)。將5 g 苯甲酸酐溶解在DMF 中，加入室溫?cái)嚢柘碌哪举|(zhì)素磺酸鈉DMF 溶液，再加入0.022 mol 三乙胺，60 ℃下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)液以8000 r/min的速率攪拌5 min，取約15 mL 上清液加入300 mL異丙醇，于8000 r/min 下離心5 min，得到產(chǎn)物沉淀，用異丙醇清洗3 次。將沉淀移入40 ℃的真空干燥箱內(nèi)干燥，得到苯甲酸酯化的BLS 樣品。

1.2.2 苯醚甲環(huán)唑納米顆粒 (Di@BLS) 的制備 稱取10 mg SDS 溶于5 mL 水中，得到質(zhì)量濃度為0.2%的SDS 水溶液，作為水相。將10 mg Di 和50 mg BLS 溶于500 mg 的DCM 中 (即BLS 載體的質(zhì)量濃度為1%，藥料比為1 : 5)，作為油相。在1000 r/min 的攪拌下，將油相滴入水相，使用高剪切乳化機(jī)以10000 r/min 對(duì)油水混合物剪切1 min，進(jìn)行預(yù)乳化。將剪切后的溶液放入細(xì)胞破碎儀，在70%的功率下超聲2 min (超聲1 s，暫停2 s)，使兩相充分混合乳化。將乳液以500 r/min 的轉(zhuǎn)速攪拌2 h，使溶液內(nèi)部的DCM 揮發(fā)后，得到Di@BLS。

1.3 木質(zhì)素磺酸鹽納米顆粒的配方優(yōu)化

1.3.1 BLS 載體濃度配方篩選 以溶液粒徑大小為參照，對(duì)制得BLS 的最佳濃度進(jìn)行了篩選，將15～75 mg 的BLS 載體分別溶于500 mg DCM 中，后續(xù)不同BLS 濃度的Di@BLS 的制備步驟參照

1.2.2 節(jié)，使用馬爾文激光粒度測(cè)定儀檢測(cè)不同溶液的粒徑大小變化。

1.3.2 BLS 載體與Di 料藥比篩選 將BLS 載體與10 mg Di 分別按照質(zhì)量比為1 : 1、3 : 2、2 : 1、3 : 1、5 : 1 和7 : 1 溶于500 mg DCM 中，后續(xù)Di@BLS 的配制步驟參照1.2.2 節(jié)，使用制劑穩(wěn)定分析儀和馬爾文激光粒度儀檢測(cè)不同料藥比Di@BLS 的TSI 指數(shù)和粒徑變化。

1.3.3 表面活性劑種類篩選 分別對(duì)陽(yáng)離子、陰離子、兩性和非離子型表面活性劑進(jìn)行了篩選。將50 mg BLS 載體與10 mg Di 加入5 mL 含有質(zhì)量濃度為0.2%表面活性劑的水溶液中，后續(xù)步驟參考1.2.2 節(jié)，檢測(cè)不添加表面活性劑的Di@BLS的Zeta 電位以及添加不同表面活性劑后的Di@BLS粒徑大小。

1.3.4 表面活性劑用量篩選 將50 mg BLS 載體與10 mg Di 加入5 mL 含優(yōu)化篩選的表面活性劑水溶液中，表面活性劑水溶液的質(zhì)量濃度設(shè)置為0.1%、0.3%、0.8%、1%、1.3% 和1.5%，后續(xù)Di@BLS 的配制步驟參考1.2.2 節(jié)，使用馬爾文激光粒度測(cè)定儀檢測(cè)不同表面活性劑含量的Di@BLS粒徑大小，確定表面活性劑使用的最佳濃度。

1.4 BLS 和Di@BLS 的表征

1.4.1 BLS 的核磁共振氫譜(1H NMR) 將10 mg干燥樣品溶于0.5 mL 氘代DMSO，對(duì)樣品進(jìn)行1H NMR 分析。

1.4.2 Di@BLS 的紅外光譜分析 (FT-IR) 通過(guò)FT-IR 對(duì)Di 原藥、BLS 和Di@BLS 等樣品化學(xué)官能團(tuán)的變化進(jìn)行檢測(cè)。取適量干燥的樣品粉末與KBr 粉末混合后，研磨3～5 min 進(jìn)行壓片，在4000～500 cm-1的波數(shù)范圍進(jìn)行紅外檢測(cè)。

1.4.3 Di@BLS 的形貌表征和粒徑分析 通過(guò)掃描電子顯微鏡 (SEM) 觀察Di@BLS 的形貌特征。取適量干燥的Di@BLS 樣品粉末固定在導(dǎo)電膠上，設(shè)定加速電壓為3.00 kV，工作距離為5.5 mm，觀察其形態(tài)特征。并在視野內(nèi)選擇200 個(gè)納米顆粒檢測(cè)平均粒徑，同時(shí)使用馬爾文激光粒度測(cè)定儀檢測(cè)Di@BLS 的粒徑分布。

1.5 楊梅凋萎病致病菌分離鑒定

由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物所進(jìn)行。從浙江省蘭溪市馬澗鎮(zhèn)采集楊梅凋萎病病枝，采用科赫氏法則對(duì)其致病菌進(jìn)行分離鑒定。對(duì)所分離的致病菌進(jìn)行培養(yǎng)后再接種到楊梅樹(shù)苗上。楊梅苗為網(wǎng)上購(gòu)買，為降低楊梅在運(yùn)送時(shí)的蒸騰作用，對(duì)楊梅葉片進(jìn)行了切割：將致病菌菌餅接種于楊梅葉痕處[15]，以接種空白菌餅的楊梅葉作為對(duì)照。對(duì)楊梅套袋保濕，觀察記錄發(fā)病情況，確定是否與田間病害癥狀一致。之后從發(fā)病部位再分離病原菌進(jìn)行鑒定，觀察是否與原致病菌一致。

1.6 離體抑菌活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[16]分別測(cè)定Di@BLS、Di ME 和Di 對(duì)楊梅凋萎病致病菌的抑制活性，計(jì)算有效中濃度 (EC50)。配制PDA 培養(yǎng)基，加熱融化后混入供試藥劑，質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0.125、0.25、0.5、1 和2 μg/mL，以不含藥劑的PDA 培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。將致病菌接種于PDA 培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)菌落生長(zhǎng)情況，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 Di 在楊梅體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 稱取10.0 mg Di，用乙腈溶解并定容至10 mL，再用乙腈稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12、15、30、60 和120 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用高效液相色譜 (HPLC) 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積為縱坐標(biāo) (y)，Di 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。HPLC 條件：流動(dòng)相為V(甲醇) :V(水) = 30 : 70，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量 20 μL。

1.7.2 添加回收試驗(yàn) 使用QuEChERS 方法[17]提取楊梅葉片中的苯醚甲環(huán)唑。稱取0.5 g 楊梅葉片，加入含Di 質(zhì)量分別為1、5、10、50 μg 的Di 乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液。將葉片烘干后放入研缽內(nèi)，加入液氮搗碎。將碎葉放入50 mL 離心管中，加入0.5 g 無(wú)水硫酸鎂、0.35 g 氯化鈉和10 mL 乙腈，超聲20 min，于8000 r/min 下離心5 min。取5 mL上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入1 mL 乙腈重新溶解；加入30 mg 硅鎂型吸附劑、100 mg 無(wú)水硫酸鎂、15 mg C18和30 mg PSA。用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，HPLC 法檢測(cè)其葉片內(nèi)部Di 的質(zhì)量濃度，計(jì)算其含量，并與原添加藥劑量進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。每個(gè)濃度重復(fù)5 次試驗(yàn)。

1.7.3 Di 在楊梅苗上的持效期試驗(yàn) 取多株長(zhǎng)勢(shì)相近的一年生楊梅苗，在中間的葉片上分別滴加0.5 mL 0.2%的Di@BLS 與Di ME，自然晾干后，分別于1、4、7、10、14 d 后檢測(cè)楊梅苗上葉與下葉的藥劑含量變化，確定兩種藥液的持效期。葉片中藥劑的提取步驟參考1.7.2 節(jié)中QuEChERS方法，并使用HPLC 檢測(cè)藥劑濃度。

1.7.4 Di 的田間持效期試驗(yàn) 將40 mL 質(zhì)量濃度為200 mg/L 的Di@BLS 裝入50 mL 注干瓶中，于田間對(duì)楊梅苗進(jìn)行樹(shù)干注射，檢測(cè)藥液持留情況，試驗(yàn)地點(diǎn)選在浙江省蘭溪市馬澗鎮(zhèn)家庭農(nóng)場(chǎng)。使用電鉆在楊梅樹(shù)基干距地面10 cm 處斜向下鉆孔，插入注干瓶，并在注干瓶后插洞，維持內(nèi)外大氣壓平衡，30 d 后取樣檢測(cè)楊梅葉片內(nèi)的藥劑存留情況。葉片中藥劑的提取步驟參考

1.7.2 中QuEChERS 方法，并略作改進(jìn)：取5 g 樹(shù)葉加入液氮磨碎后，轉(zhuǎn)入50 mL 離心管內(nèi)，加入20 mL 乙腈、0.5 g 氯化鈉和2 g 無(wú)水硫酸鎂，超聲20 min 后，于8000 r/min 下離心5 min。取上清液10 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后加入1 mL 丙酮重新溶解，加入50 mg PSA、50 mg 硅鎂型吸附劑、150 mg無(wú)水硫酸鎂和25 mg C18，超聲1 min 后，采用0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (GC-MS) 檢測(cè)樣品。

GC-MS 條件：進(jìn)樣溫度250 ℃，程序升溫：120 ℃保持1 min，以30 ℃/min 的速度升至130 ℃，5 ℃/min 升溫至250 ℃，最后以10 ℃/min 的速率升至300 ℃，保持5 min，色譜柱為HP-5MS 石英毛細(xì)管柱 (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent)，電離方式EI；質(zhì)量掃描范圍m/z30～500；接口溫度280 ℃；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃。

1.8 盆栽試驗(yàn)

以東魁楊梅為供試品種，測(cè)試Di@BLS 對(duì)楊梅凋萎病的防治效果。在1 年樹(shù)齡的楊梅苗上噴灑20 mL 有效成分含量 200 μg/mL 的Di@BLS，楊梅苗在室溫下自然晾干后，立即接種楊梅凋萎病病菌，以噴施清水的楊梅苗作為空白對(duì)照，噴施同等藥劑濃度的Di ME 作為陽(yáng)性對(duì)照。施藥后，葉片應(yīng)呈全部潤(rùn)濕的狀態(tài)。接種楊梅凋萎病菌后培養(yǎng)30 d，按公式 (1) 計(jì)算發(fā)病率。每處理3 次重復(fù)。

其中：E為發(fā)病率，%；Dt為發(fā)病掉落葉片數(shù)，Dc為總?cè)~片數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 BLS 和Di@BLS 結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 BLS 的1H NMR 如圖1 所示，與木質(zhì)素磺酸鈉 (LS) 相比，BLS 的1H NMR 在化學(xué)位移δ7.2～8.2 處出現(xiàn)新的吸收峰，這是由于苯環(huán)上的H 電子云密度較小，屏蔽效應(yīng)較弱，苯甲酸酐在取代LS 上的羥基后，LS 在低場(chǎng)出現(xiàn)新的吸收峰，表明苯甲酸酐成功對(duì)木質(zhì)素磺酸鹽進(jìn)行了酯化。

圖1 BLS 和LS 的 1H NMR 譜圖Fig.1 1H NMR spectra of BLS and LS

2.1.2 Di@BLS 的紅外譜圖 測(cè)試結(jié)果如圖2 所示。在Di@BLS 的紅外譜圖中，1682 cm-1處的吸收峰為Di 上特有的C＝N 伸縮振動(dòng)峰，750 cm-1處的特征峰為Di 上C－Cl 的伸縮振動(dòng)峰[18]，通過(guò)對(duì)比Di 與Di@BLS 的譜圖可以發(fā)現(xiàn)兩者的特征峰位置基本一致，證明本研究成功合成了負(fù)載Di 的Di@BLS 納米農(nóng)藥顆粒。

圖2 LS、BLS、Di 及Di@BLS 的FT-IR 譜圖Fig.2 FT-IR spectra of LS, BLS, Di and Di@BLS

2.1.3 Di@BLS 的粒徑與形貌表征 圖3 (a) 為Di@BLS 納米顆粒的掃描電子顯微鏡照片?？梢?jiàn)Di@BLS 納米顆粒的球體形狀規(guī)則，顆粒的表面光滑，大小分布比較均勻，粒徑在86.82 nm 左右；圖3 (b) 為使用馬爾文激光粒度儀檢測(cè)得到的Di@BLS 粒徑分布圖，Di@BLS 的平均粒徑大小在135.2 nm，馬爾文激光粒度儀檢測(cè)的粒徑較掃描電子顯微鏡統(tǒng)計(jì)大的原因與馬爾文檢測(cè)粒徑為納米顆粒的水合粒徑 (流體動(dòng)力學(xué)粒徑) 有關(guān)[19]。

圖3 Di@BLS 的掃描電鏡圖 (a) 以及Di@BLS 的粒徑分布圖 (b)Fig.3 SEM (a) and particle size distribution of Di@BLS (b)

2.2 木質(zhì)素磺酸鹽納米顆粒的配方優(yōu)化

2.2.1 BLS 載體濃度配方優(yōu)化 圖4 為BLS 濃度對(duì)Di@BLS 納米顆粒粒徑的影響。通過(guò)調(diào)節(jié)BLS的濃度可以發(fā)現(xiàn)，隨著B(niǎo)LS 濃度的提高，納米顆粒的粒徑不斷增大；在BLS 質(zhì)量濃度從1.3%提升至1.5%后，所得納米顆粒的粒徑大幅上漲。造成這一現(xiàn)象的原因可能是高濃度的BLS 油相進(jìn)入水中時(shí)，分子間距離較小，易聚集形成大粒徑的納米顆粒。后續(xù)試驗(yàn)為獲得粒徑較小的Di@BLS 納米顆粒，選用質(zhì)量濃度為0.2%的BLS 配制農(nóng)藥納米顆粒。

圖4 BLS 濃度對(duì)Di@BLS 納米顆粒粒徑的影響Fig.4 The effect of BLS concentration on the particle size of Di@BLS nanoparticles

2.2.2 BLS 和Di 的料藥比配方優(yōu)化 圖5 (a) 為Di@BLS 的料藥比對(duì)粒徑的影響。從中可以發(fā)現(xiàn)，隨著料藥比的增加，Di@BLS 的顆粒粒徑呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，在料藥比為5 : 1 時(shí)，粒徑最??；圖5 (b) 為料藥比對(duì)Di@BLS 的TSI 指數(shù)的影響。TSI 指數(shù)越小，說(shuō)明樣品的穩(wěn)定性越高，在料藥比為1 : 1 時(shí)制得的Di@BLS 樣品TSI 指數(shù)較高，表明樣品穩(wěn)定性低，這可能是因?yàn)橥度氲妮d體較少，樣品中存在大量未被包覆的藥劑懸浮。而TSI 指數(shù)最小、穩(wěn)定性最高的料藥比為5 : 1，之后，隨著料藥比進(jìn)一步增加，TSI 指數(shù)升高，這可能與料藥比增加導(dǎo)致顆粒粒徑增大，顆粒之間的靜電斥力減小有關(guān)。綜上，最佳料藥比為5 : 1。

圖5 料藥比對(duì)納米農(nóng)藥粒徑的影響 (a) 以及穩(wěn)定性指數(shù)(TSI) 的影響 (b)Fig.5 The influence of material-to-pesticide ratio on the particle size of nanopesticides (a) and the influence of Instability Index (TSI) (b)

2.2.3 Di@BLS 的表面活性劑種類篩選 圖6 為表面活性劑種類對(duì)Di@BLS 樣品粒徑大小的影響。從中可以發(fā)現(xiàn)，使用表面活性劑CTAB 制備的Di@BLS 粒徑最大，接近800 nm，而使用SDS制備的Di@BLS 粒徑最小，這可能是因?yàn)镾DS 是陰離子型表面活性劑，而Di@BLS 內(nèi)部含有較強(qiáng)的負(fù)電荷，SDS 的引入帶去了更多負(fù)電荷，增大了Di@BLS 顆粒間的斥力，使顆粒形成時(shí)不容易聚集，粒徑減?。欢鳦TAB 是陽(yáng)離子型表面活性劑，會(huì)引入大量正電荷，使Di@BLS 顆粒之間的靜電斥力減弱，更容易發(fā)生聚集沉淀，因而增大納米顆粒的粒徑。故選用SDS 作為表面活性劑。

圖6 表面活性劑種類對(duì)納米農(nóng)藥粒徑的影響Fig.6 The effect of surfactant types on the particle size of nanopesticides

2.2.4 Di@BLS 中表面活性劑用量的篩選 圖7 為SDS 濃度對(duì)Di@BLS 粒徑的影響?？梢?jiàn)，隨著SDS 濃度提高，Di@BLS 粒徑逐漸增大，這可能是因?yàn)楸砻婊钚詣舛仍龃螅瑢?dǎo)致溶液的黏度增高，使納米顆粒在形成過(guò)程中不易分散，從而形成了粒徑較大的Di@BLS 納米顆粒。當(dāng)SDS 質(zhì)量濃度為0.1%～0.4%時(shí)，顆粒粒徑較?。欢?dāng)SDS 質(zhì)量濃度在0.8%以上時(shí)，顆粒粒徑在200 nm 以上，所以后續(xù)試驗(yàn)使用的SDS 質(zhì)量濃度維持在0.1%～0.4%。

圖7 SDS 濃度對(duì)納米農(nóng)藥粒徑的影響Fig.7 The effect of SDS concentration on the particle size of nanopesticides

綜上，本研究最佳制劑配方選擇在BLS 載體濃度為1%、料藥比為5 : 1、質(zhì)量濃度為0.2%的SDS 用量條件下配制Di@BLS。

2.3 致病菌的鑒定

從浙江省蘭溪市馬澗鎮(zhèn)采收集的楊梅樹(shù)病枝分離出4 種病菌，隨后將分離出的病菌分別回接到楊梅植株上，發(fā)現(xiàn)菌株Z2-2 可引起楊梅苗發(fā)生楊梅凋萎病 (表1)。圖8 為接種病菌Z2-2 的楊梅苗發(fā)生楊梅凋萎病的相關(guān)癥狀，可以看出：接種Z2-2 的楊梅苗發(fā)病時(shí)，首先于接種病菌菌餅的葉痕處變黑，之后頂芽枯萎，從頂端葉片開(kāi)始向下葉片出現(xiàn)枯萎癥狀；之后從接種發(fā)病的楊梅病株上重新分離病菌，經(jīng)鑒定為可可毛色二孢菌Lasiodiplodia，因此最終確定病菌Z2-2 為致病菌。

表1 蘭溪市馬澗鎮(zhèn)下杜村的楊梅病菌分離鑒定情況Table 1 Isolation and identification of diseased bayberry branches from Xiadu Village, Majian Town, Lanxi City

圖8 Lasiodiplodia 在楊梅苗上的接種效果Fig.8 Lasiodiplodia inoculation effect on bayberry seedlings

2.4 離體抑菌活性

圖9 為不同濃度下Di Tech、Di ME 與Di@BLS在培養(yǎng)基中對(duì)Lasiodiplodia的離體抑制效果。3 種藥劑對(duì)Lasiodiplodia的EC50值分別為0.395、0.484和0.643 μg/mL (表2)，其中Di@BLS 的抑菌效果稍弱于Di ME 與Di。這可能是由于Di 從Di@BLS中釋放需要一定時(shí)間，因此Di@BLS 處理組中游離的Di 濃度低于Di ME 與Di Tech 處理組中的濃度。

表2 Di Tech、Di ME 和Di@BLS 對(duì)Lasiodiplodia 的抑菌活性Table 2 The antimicrobial activities of Di Tech, Di ME and Di@BLS against Lasiodiplodia

圖9 不同質(zhì)量濃度下Di Tech、Di@BLS 與Di ME 對(duì)Lasiodiplodia 的抑制作用Fig.9 Inhibition of Di Tech, Di@BLS and Di ME on Lasiodiplodia at different concentrations

2.5 Di 在楊梅體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及添加回收試驗(yàn)結(jié)果 測(cè)定結(jié)果表明，Di 在0.05～120 μg/mL 濃度范圍內(nèi)相關(guān)性良好，回歸方程為y=11641.6x+ 5122.3，決定系數(shù)R2= 0.999，表明儀器方法準(zhǔn)確性良好，可用于定量分析。添加回收試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，當(dāng)Di 的添加水平在0.5～25 μg/mL 時(shí)，Di 的平均回收率為95%～97%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%～9.9%，表明本研究建立的樣品前處理方法對(duì)Di 的回收率符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可以用于后續(xù)對(duì)葉片中Di 提取試驗(yàn)。

表3 苯醚甲環(huán)唑在楊梅葉片中的添加回收率Table 3 Recovery rate of difenoconazole in bayberry leaves

2.5.2 Di 在楊梅苗上的持效性 圖10 顯示了14 d 內(nèi)Di 在楊梅苗體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)趨勢(shì)以及各部位持留情況。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Di ME 與Di@BLS 均能被楊梅苗葉部吸收，但其在體內(nèi)的各部位含量變化差異較大。

圖10 Di@BLS 與Di ME 在楊梅苗上葉與下葉中含量的變化Fig.10 Changes of Di@BLS and Di ME contents in the upper and lower leaves of bayberry seedlings

對(duì)于向上運(yùn)輸，處理1 d 后Di ME 處理組在楊梅上葉的含量為34.89 mg/kg ± 1.29 mg/kg，較高于Di@BLS 含量 (7.03 mg/kg ± 0.97 mg/kg)，這與已知的苯醚甲環(huán)唑作為一種內(nèi)吸性殺菌劑能通過(guò)木質(zhì)部向上傳導(dǎo)的性質(zhì)保持一致，而將Di 進(jìn)行納米包封后可能對(duì)其在楊梅體內(nèi)的運(yùn)輸方式上有所影響從而造成了短時(shí)間內(nèi)的運(yùn)輸差異。但隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，Di@BLS 處理組的楊梅葉片中Di 含量較為穩(wěn)定，并且在14 d 時(shí)Di 含量仍有所增加，為10.15 mg/kg ± 1.21 mg/kg，高于Di ME處理組的含量 (5.85 mg/kg ± 1.28 mg/kg)，而Di ME在前7 d 內(nèi)含量快速下降后趨于平穩(wěn)，這說(shuō)明Di@BLS 具有良好的緩釋性能，使其保護(hù)藥劑不被快速降解，從而在楊梅植株體內(nèi)具有更長(zhǎng)的藥劑持效時(shí)間。

對(duì)于向下運(yùn)輸，Di ME 在14 d 內(nèi)呈現(xiàn)出了先增后減再增再減的趨勢(shì)，而Di@BLS 則是先增后減然后穩(wěn)定增加的趨勢(shì)。兩者在前兩種趨勢(shì)上保持一致，這可能是由于下葉一邊接收來(lái)自處理葉的藥劑，一邊向下繼續(xù)運(yùn)輸藥劑，在第4 天時(shí)兩者速度達(dá)到平衡，從而出現(xiàn)最多積累量。處理10 d后Di ME 含量快速下降，這可能是積累的藥劑降解所致；而Di@BLS 含量則是持續(xù)增長(zhǎng)，證明了Di@BLS 能有效向下運(yùn)輸Di 并且延緩其降解速度，提高藥劑持續(xù)期。綜上可知，Di@BLS 能通過(guò)楊梅苗葉部吸收至體內(nèi)，并且擁有上下雙向運(yùn)輸性能。此外，Di@BLS 的緩釋性能延緩了藥劑的降解，使具有更長(zhǎng)的持留時(shí)間。

2.6 Di 的田間持效性

圖11 為Di@BLS 樹(shù)干注射30 d 后的GC-MS譜圖。可以看出，Di@BLS 中的Di 在30.3 min 時(shí)出峰，與Di 標(biāo)準(zhǔn)樣品的出峰時(shí)間相同。同時(shí)可以觀察到，在葉片與Di 標(biāo)準(zhǔn)樣品中，出現(xiàn)了同樣的SIM 離子碎片265 與323[20]，這是Di 的SIM 離子數(shù)值。證明楊梅樹(shù)中仍有Di@BLS 持留，而Di ME 樣品中沒(méi)有檢測(cè)出Di 存在。

圖11 苯醚甲環(huán)唑標(biāo)樣 (a) 與楊梅葉片 (b) 的質(zhì)譜圖；標(biāo)樣 (c) 與葉片中苯醚甲環(huán)唑出峰位置 (d) 對(duì)應(yīng)的SIM 離子圖Fig.11 The mass spectra of the standard sample(a) and bayberry leaves (b); SIM ion map corresponding to the peak position of difenoconazole standard sample (c) and the leaf (d).

2.7 盆栽試驗(yàn)結(jié)果

圖12 為Di@BLS 和Di ME 對(duì)楊梅凋萎病的盆栽試驗(yàn)防治效果。可以看出，與清水對(duì)照相比，噴施Di@BLS 和Di ME 均降低了楊梅凋萎病的發(fā)病率，其中Di ME 處理組的發(fā)病率為27.3%，Di@BLS處理組的發(fā)病率為25.0%，與Di ME 的接近，說(shuō)明Di@BLS 對(duì)楊梅凋萎病具有較好的防治效果。

圖12 Di@BLS 和Di ME 在200 μg/mL 下對(duì)楊梅凋萎病的盆栽試驗(yàn)防治效果Fig.12 Potted control effect of Di@BLS and Di ME on wilting disease of bayberry at 200 μg/mL

3 結(jié)論

本研究基于苯甲酸酐疏水化改性木質(zhì)素磺酸鹽制備納米農(nóng)藥，從納米載體濃度、料藥比、表面活性劑種類及用量等多方面進(jìn)行配方優(yōu)化，制備了負(fù)載苯醚甲環(huán)唑的木質(zhì)素基納米農(nóng)藥 (Di@BLS)，其外觀形貌呈現(xiàn)為球形顆粒，平均粒徑為135.2 nm。Di@BLS 的制備采用“溶劑揮發(fā)法”，苯醚甲環(huán)唑進(jìn)入改性木質(zhì)素磺酸鈉納米顆粒內(nèi)部，并受到載體保護(hù)，在減少助劑用量得到納米制劑的同時(shí)，提升了苯醚甲環(huán)唑的持留效果。Di@BLS 具有良好的緩釋性能，相比于商品化的苯醚甲環(huán)唑微乳劑，其可以幫助苯醚甲環(huán)唑在楊梅體內(nèi)存留更長(zhǎng)時(shí)間，對(duì)楊梅提供更長(zhǎng)久的保護(hù)。目前本研究?jī)H處于探索發(fā)展階段，后續(xù)可通過(guò)控制粒徑、藥劑混配和提高葉面黏附性等進(jìn)一步提高Di@BLS的性能，使此類木質(zhì)素納米材料作為有效的緩釋納米載體更好地應(yīng)用于作物病蟲(chóng)害防控，該研究成果對(duì)于后續(xù)開(kāi)發(fā)及構(gòu)建緩釋農(nóng)藥新制劑具有重要參考價(jià)值。