植物病原菌對(duì)解偶聯(lián)劑的抗性機(jī)制研究進(jìn)展

程星凱, 張俊婷, 劉鵬飛, 劉西莉

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193)

植物病害一直是限制農(nóng)業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展的重要因素，在現(xiàn)階段農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，使用化學(xué)殺菌劑依然是防治農(nóng)作物病害的主要手段之一。然而隨著殺菌劑頻繁而大量的使用，不可避免地出現(xiàn)植物病原真菌的抗藥性問題，抗性菌株在病原菌群體中的比例和抗性發(fā)生范圍不斷升高，抗性水平逐漸加劇，甚至出現(xiàn)了對(duì)不同作用機(jī)制殺菌劑均產(chǎn)生抗性的病原菌群體，即多藥抗性[1-2]。多藥抗性給病害的防治帶來了極大的困難和挑戰(zhàn)，導(dǎo)致一些地區(qū)田間殺菌劑的用量需要不斷增加，一方面降低了農(nóng)作物的產(chǎn)量，提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，另一方面也給生態(tài)環(huán)境安全造成了不可逆的影響。

植物病原菌的抗藥性問題尤其是多藥抗性的治理已成為植物病害防治領(lǐng)域的世界性難題。因此，基于新穎的靶標(biāo)蛋白，創(chuàng)制綠色、高效、安全的殺菌劑，并開展科學(xué)合理的抗性監(jiān)測(cè)和管理是解決病原菌現(xiàn)有抗性問題的重要途徑。氧化磷酸化解偶聯(lián)劑在植物病害防治中扮演重要角色，與其他殺菌劑相比，其作用機(jī)制獨(dú)特，由于病原菌體內(nèi)缺少相應(yīng)的靶標(biāo)位點(diǎn)，致使植物病原菌對(duì)解偶聯(lián)劑的抗性現(xiàn)象并不常見。本文歸納總結(jié)了常見的解偶聯(lián)劑品種，同時(shí)對(duì)其作用機(jī)制及植物病原菌對(duì)其的抗性分子機(jī)制研究現(xiàn)狀展開論述，旨在豐富人們對(duì)解偶聯(lián)劑的認(rèn)識(shí)，有利于該類殺菌劑在田間的科學(xué)使用，同時(shí)為植物病原菌的抗性治理提供有效途徑。

1 解偶聯(lián)劑簡介

Mitchell 化學(xué)滲透假說解釋了氧化與磷酸化之間的偶聯(lián)機(jī)制，而解偶聯(lián)劑作為一種氧化磷酸化抑制劑，可特異性地靶向線粒體膜電位，與線粒體膜間隙中的質(zhì)子 (H+) 結(jié)合，從而以質(zhì)子化的形式穿越線粒體內(nèi)膜，同時(shí)將質(zhì)子帶回線粒體并釋放到基質(zhì)中，以此消除線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的H+濃度梯度。喪失質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力的三磷酸腺苷 (ATP) 合成酶無法正常催化二磷酸腺苷 (ADP) 的磷酸化，因而無法形成ATP[3]。在線粒體呼吸鏈電子傳遞過程中，解偶聯(lián)劑并未發(fā)揮抑制作用，反而在一定程度上還可以促進(jìn)電子傳遞，加快糖、脂肪以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)的消耗，同時(shí)刺激線粒體加速耗氧進(jìn)程，而在此過程中釋放的自由能會(huì)以熱量的形式散失[4-5]。

殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì) (Fungicide Resistance Action Committee, FRAC) 的殺菌劑分類表中列出的全球商品化的解偶聯(lián)劑共有3 個(gè)：氟啶胺(fluazinam)、樂殺螨 (binapacryl) 和硝苯菌酯(meptyl dinocap) (https://www.frac.info/)，其結(jié)構(gòu)式見圖式1。研究表明，樂殺螨對(duì)蘋果白粉病具有較高的防治活性[6]，而硝苯菌酯兼具保護(hù)和治療活性，主要用于防控蔬菜、水果以及觀賞植物上的白粉病[7-8]。氟啶胺是20 世紀(jì)80 年代初由日本石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社開發(fā)上市、現(xiàn)階段廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物病害防治的解偶聯(lián)劑品種。鑒于氟啶胺抑菌活性高，作用機(jī)制獨(dú)特，且田間少有抗性情況發(fā)生，我國沈陽化工研究院有限公司以其為基礎(chǔ)進(jìn)行衍生化合成，在“十一 ·五”期間創(chuàng)制了與氟啶胺具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的殺菌劑新品種雙苯菌胺 (SYP-14288，圖式1)。

圖式 1 幾種解偶聯(lián)劑和雙苯菌胺的結(jié)構(gòu)式Scheme 1 Structural formula of several uncouplers and SYP-14288

氟啶胺作為氧化磷酸化解偶聯(lián)劑，表現(xiàn)出高效廣譜的抑菌活性，對(duì)植物病原菌的各個(gè)生長發(fā)育階段均有較強(qiáng)的抑制作用，已被登記用于防治多種真菌、卵菌以及細(xì)菌病害[9-13]，其單劑已在馬鈴薯、番茄、柑橘等10 種作物多種病蟲害防治中登記使用，如表1 所示。此外，氟啶胺與其他殺菌劑的復(fù)配制劑在中藥材根腐病、水稻惡苗病、葡萄霜霉病、黃瓜霜霉病、花生根腐病及油菜菌核病上也獲得了登記 (http://www.chinapesticide.org.cn/)。與氟啶胺相比，雙苯菌胺同樣表現(xiàn)出高效、低毒、廣譜的特點(diǎn)，對(duì)多種植物病原菌均表現(xiàn)出良好的抑菌活性，同時(shí)其對(duì)辣椒疫霉Phytophthora capsici、致病疫霉P.infestans和黃瓜疫霉P.drechsleri的抑菌活性更高，且合成成本更低，具有廣闊的應(yīng)用前景[14-15]。

2 解偶聯(lián)劑作用機(jī)制的探索

2.1 氟啶胺

自氟啶胺問世以來，有關(guān)該藥劑的作用機(jī)制在不斷探索中。在研究氟啶胺對(duì)小鼠肝臟線粒體的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著氟啶胺處理濃度的升高，線粒體呼吸作用增強(qiáng)。加入底物琥珀酸鹽后，線粒體產(chǎn)生質(zhì)子梯度勢(shì)，親脂性陽離子四苯基膦(tetraphenylphosphonium, TPP+) 可利用質(zhì)子梯度勢(shì)被動(dòng)運(yùn)輸跨膜進(jìn)入線粒體。加入氟啶胺后，TPP+不能跨膜進(jìn)入線粒體，線粒體的質(zhì)子梯度勢(shì)被破壞，線粒體呼吸增強(qiáng)，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的解偶聯(lián)活性。在加入谷胱甘肽后，解偶聯(lián)作用顯著下降，推測(cè)可能是谷胱甘肽取代了氟啶胺結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上的氯原子，進(jìn)而影響了氟啶胺的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致其失去解偶聯(lián)活性[16]。至此，氟啶胺首先被確認(rèn)為典型的解偶聯(lián)劑，但隨后研究又發(fā)現(xiàn)，氟啶胺能顯著抑制人體神經(jīng)瘤細(xì)胞SH-SY5Y 線粒體呼吸鏈中復(fù)合物I 的活性，通過刺激細(xì)胞色素c 釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，使得細(xì)胞中的活性氧含量極劇增多，多巴胺含量顯著降低，線粒體功能受損，細(xì)胞的能量合成遭到抑制，最終引起細(xì)胞死亡[17]。Vitoratos[18]在研究氟啶胺對(duì)玉米黑粉菌Ustilago maydis的作用方式時(shí)，對(duì)篩選獲得的抗氟啶胺突變體進(jìn)行了交互抗藥性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟啶胺與萎銹靈、寡霉素具有一定的正交互抗藥性，而與解偶聯(lián)劑2,4-二硝基苯酚無交互抗藥性，推測(cè)氟啶胺通過直接抑制ATP 合成酶來抑制真菌細(xì)胞的能量產(chǎn)生過程，并非具有氧化磷酸化解偶聯(lián)活性。研究者在探究氟啶胺對(duì)灰葡萄孢Botrytis cinerea的毒理作用時(shí)，首先通過篩選釀酒酵母突變體庫，獲得了與毒理過程密切相關(guān)的基因，分析后發(fā)現(xiàn)這些基因集中于氨基酸代謝、能量代謝、核酸轉(zhuǎn)錄以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑，隨后在灰葡萄孢中鑒定到可能參與以上代謝途徑的4 個(gè)基因：BcStr2、BcElp4、BcMtg2和BcMtp1，進(jìn)一步采用遺傳轉(zhuǎn)化方法明確了它們?cè)诨移咸焰邔?duì)氟啶胺敏感性以及菌體生長發(fā)育方面具有重要作用[19]。盡管如此，有關(guān)氟啶胺的作用機(jī)制尚不明確。

2.2 雙苯菌胺

Cai 等[20]采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)來探究雙苯菌胺對(duì)辣椒疫霉的作用方式，通過對(duì)篩選獲得的差異蛋白進(jìn)行同源蛋白簇分析和KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)差異蛋白與病原菌碳水化合物代謝、能量代謝以及下游生物學(xué)功能特別是氧化還原酶活性和ATP 合成途徑方面密切相關(guān)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的上調(diào)表達(dá)可能具有協(xié)同作用，以補(bǔ)償被破壞的質(zhì)子梯度和其他下游效應(yīng)，推測(cè)雙苯菌胺具有解偶聯(lián)活性，通過抑制能量代謝而影響其他生物學(xué)過程。Wang 等[21]在研究雙苯菌胺對(duì)辣椒疫霉的作用機(jī)制時(shí)，對(duì)藥劑處理后辣椒疫霉的差異代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸、硬脂酸和油酸等脂肪酸大量積累，這與典型的解偶聯(lián)劑2,4-二硝基苯酚影響脂肪酸積累表現(xiàn)一致[22]，表明雙苯菌胺可能在破壞病原菌氧化磷酸化偶聯(lián)后導(dǎo)致各種脂肪酸積累，從而抑制植物病原菌的生長。Liang 等[23]聯(lián)合代謝組學(xué)和生理生化測(cè)定探究了雙苯菌胺對(duì)立枯絲核菌Rhizoctonia solani的作用機(jī)制，通過立枯絲核菌代謝指紋對(duì)典型的呼吸作用抑制劑進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明：氧化過程抑制劑氟嘧菌胺、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、萎銹靈和噻呋酰胺聚為一支；磷酸化過程抑制劑三苯基氯化錫、三苯基乙酸錫、寡霉素A、甲芬那酸、2,4-二硝基苯酚和氟啶胺聚為另外一支，雙苯菌胺與后者聚在一起。進(jìn)一步對(duì)呼吸作用相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)表明，雙苯菌胺可以促進(jìn)菌絲的呼吸速率，降低膜電位，并顯著抑制ATP 合成。以上兩方面試驗(yàn)結(jié)果證明了雙苯菌胺具有解偶聯(lián)活性。但是，截至目前，有關(guān)氟啶胺和雙苯菌胺的研究，并未監(jiān)測(cè)到藥劑與線粒體膜間隙中的質(zhì)子 (H+) 發(fā)生結(jié)合，并以質(zhì)子化的形式穿越線粒體內(nèi)膜這一過程，有待于進(jìn)一步研究探明。

3 病原菌對(duì)解偶聯(lián)劑抗性機(jī)制的解析

植物病原菌對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗性的機(jī)制主要包括靶標(biāo)抗性和非靶標(biāo)抗性。靶標(biāo)抗性主要涉及靶標(biāo)基因的點(diǎn)突變及過量表達(dá)，這也是病原菌最為常見和報(bào)道最多的抗性機(jī)制[24]。非靶標(biāo)抗性指的是病原菌中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過量表達(dá)和解毒代謝酶的參與增加了對(duì)藥劑的排泄或代謝解毒，減少了藥劑在細(xì)胞內(nèi)的積累，從而表現(xiàn)抗藥性，甚至出現(xiàn)多藥抗性，即某類病原菌不僅對(duì)相同作用機(jī)制的殺菌劑產(chǎn)生抗性，同時(shí)也能對(duì)作用機(jī)制不同的殺菌劑產(chǎn)生抗性[25]。

3.1 氟啶胺

由于解偶聯(lián)劑具有獨(dú)特的作用機(jī)制，在病原菌體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)解偶聯(lián)劑作用的靶標(biāo)蛋白，因而難以在抗性突變體中尋找發(fā)生變化的氨基酸位點(diǎn)。植物病原菌對(duì)該類藥劑抗性研究報(bào)道較少，目前僅有Tamura[26]研究報(bào)道了病原菌對(duì)氟啶胺的田間抗性，其在菜豆田發(fā)現(xiàn)了灰葡萄孢對(duì)氟啶胺表現(xiàn)抗性的菌株。Schepers 等[27]在荷蘭馬鈴薯晚疫病田中分離獲得新的致病疫霉基因型菌株，其在田間高病害壓力下，對(duì)氟啶胺的敏感性顯著下降。Vitoratos[18]在室內(nèi)通過化學(xué)誘變方法獲得了玉米黑粉菌對(duì)氟啶胺的抗性突變體，并發(fā)現(xiàn)其與萎銹靈、寡霉素具有交互抗性，但對(duì)線粒體解偶聯(lián)劑表現(xiàn)為敏感，表明植物病原菌對(duì)氟啶胺抗性機(jī)制與菌體能量系統(tǒng)密切相關(guān)。

Shao 等[28]開展了灰葡萄孢對(duì)氟啶胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，通過室內(nèi)馴化獲得5 株抗性突變體，其生存適合度顯著低于親本菌株，表明灰葡萄孢對(duì)氟啶胺抗性風(fēng)險(xiǎn)較低，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)所有的抗性突變體對(duì)腐霉利和咯菌腈均表現(xiàn)出抗性，同時(shí)對(duì)滲透脅迫高度敏感，這暗示著灰葡萄孢對(duì)氟啶胺的抗性可能與其對(duì)腐霉利和咯菌腈的抗性具有相似的機(jī)制。Mao 等[29]通過室內(nèi)藥劑馴化的方式篩選獲得了9 株抗氟啶胺的核盤菌Sclerotinia sclerotiorum突變體，對(duì)其生存適合度測(cè)定后發(fā)現(xiàn)其對(duì)氟啶胺具有低水平的抗性風(fēng)險(xiǎn)，但突變體對(duì)咯菌腈的敏感性降低，這表明在核盤菌中，氟啶胺和咯菌腈之間存在潛在的交互抗性，這與Shao 等[28]的研究結(jié)果類似，但在抗氟啶胺突變體中并未檢測(cè)到組氨酸激酶基因點(diǎn)突變，且咯菌腈的靶基因僅在部分抗性突變體中上調(diào)表達(dá)，表明核盤菌對(duì)氟啶胺的抗性與組氨酸激酶基因點(diǎn)突變或過表達(dá)無關(guān)。同時(shí)觀察到抗性突變體對(duì)滲透脅迫表現(xiàn)敏感，猜測(cè)突變體中與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)途徑里基因的變化導(dǎo)致其對(duì)咯菌腈敏感性降低，這些基因有可能是導(dǎo)致病原菌對(duì)氟啶胺產(chǎn)生抗性的關(guān)鍵因子。

3.2 雙苯菌胺

本課題組前期圍繞雙苯菌胺開展了系統(tǒng)的抗性機(jī)制研究。侯燕華[30]評(píng)估了辣椒疫霉對(duì)雙苯菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)，并初步探究了抗性機(jī)制。通過室內(nèi)篩選獲得了系列抗性突變體，抗性水平在3～150 倍之間，抗性較為穩(wěn)定，通過綜合突變體生存適合度以及交互抗藥性測(cè)定，明確了辣椒疫霉對(duì)雙苯菌胺具有低水平抗性風(fēng)險(xiǎn)。ATP 合酶5 個(gè)亞基編碼基因在抗性菌株和敏感菌株體內(nèi)均未發(fā)生點(diǎn)突變，而對(duì)突變體ATP 合酶的8 個(gè)亞基和ATP 酶的4 個(gè)亞基表達(dá)量測(cè)定結(jié)果表明，兩類基因的下調(diào)表達(dá)可能是導(dǎo)致抗性發(fā)生的原因。劉鵬飛等[31]研究表明，相較于親本菌株，辣椒疫霉抗藥突變體對(duì)百菌清和氟噻唑吡乙酮的敏感性均降低，并且突變體對(duì)殺菌劑的敏感性在外排蛋白抑制劑阿米替林作用下得以恢復(fù)。梁莉[32]研究發(fā)現(xiàn)，雙苯菌胺對(duì)立枯絲核菌具有較高的抑制活性，通過藥劑馴化的方式篩選獲得一系列抗雙苯菌胺突變體，經(jīng)過10 次轉(zhuǎn)代培養(yǎng)后，突變體的抗性水平介于20～100 倍之間，且多數(shù)抗性突變體對(duì)雙苯菌胺的敏感性變化較為穩(wěn)定，但相關(guān)抗性機(jī)制研究并未深入開展。

代探等[33]在探究辣椒疫霉對(duì)雙苯菌胺的抗性機(jī)制時(shí)，通過高效液相色譜法 (HPLC) 檢測(cè)了敏感菌株JA8 和抗性菌株RJ-2 菌絲中雙苯菌胺的積累量，發(fā)現(xiàn)雙苯菌胺在敏感菌株中的積累量顯著高于其在抗性菌株中，推測(cè)藥劑外排造成了辣椒疫霉抗藥性的發(fā)生。選用11 種已知作用機(jī)制的外排泵抑制劑與雙苯菌胺復(fù)配進(jìn)行增效性研究，探尋與雙苯菌胺抗性相關(guān)的外排蛋白，最終成功篩選到具有增效作用的抑制劑阿米替林，其靶標(biāo)蛋白為P-糖蛋白 (P-glycoprotein, P-gp)。進(jìn)一步測(cè)定辣椒疫霉P-gp基因的表達(dá)量，其中P-gp9606、Pgp5690、P-gp14335和P-gp5260984 個(gè)基因在抗性菌株中過量表達(dá)，表明辣椒疫霉可通過P-gp基因的過量表達(dá)介導(dǎo)藥劑外排，從而對(duì)雙苯菌胺產(chǎn)生抗藥性。此外，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (LCMS) 方法檢測(cè)到雙苯菌胺在辣椒疫霉抗性菌株和敏感菌株菌絲中的3 種代謝產(chǎn)物，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析推測(cè)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)均是由雙苯菌胺母體的一個(gè)“-NO2”還原為藥劑代謝產(chǎn)物“-NH2”的轉(zhuǎn)變，且這種還原反應(yīng)由細(xì)胞色素P450 單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase, P450) 參與完成。進(jìn)一步測(cè)定辣椒疫霉34 個(gè)P450 基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其中7 個(gè)P450 基因與3 種代謝產(chǎn)物可能存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果表明，P450s 作為重要的解毒蛋白，可能在辣椒疫霉對(duì)雙苯菌胺的抗性中發(fā)揮重要作用。

筆者所在研究團(tuán)隊(duì)以課題組前期通過雙苯菌胺馴化篩選獲得的水稻紋枯病菌Rhizoctonia solaniKühn 抗性突變體為研究材料，開展病原菌對(duì)雙苯菌胺抗性機(jī)制研究。首先根據(jù)交互抗藥性的測(cè)定結(jié)果，明確了雙苯菌胺與氟啶胺、2,4-二硝基苯酚、咯菌腈、苯醚甲環(huán)唑、氰霜唑、百菌清以及三苯基氯化錫均具有正交互抗藥性，表明在雙苯菌胺作用下，抗性突變體產(chǎn)生了多藥抗性。通過高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用 (HPLCQTOF) 方法分析獲得了雙苯菌胺在水稻紋枯病菌中產(chǎn)生“-NO2”還原為“-NH2”的代謝產(chǎn)物以及“-Cl”取代為“-NH2”的代謝產(chǎn)物。其中，還原產(chǎn)物在抗性突變體內(nèi)的積累量顯著增加，表明抗性突變體對(duì)雙苯菌胺較強(qiáng)的代謝能力是導(dǎo)致其抗性發(fā)生的重要原因。通過HPLC 檢測(cè)雙苯菌胺在抗性突變體X19-7 和親本菌株X19 菌絲中的積累量，發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的延長，突變體的藥劑積累量顯著低于親本菌株，分析抗性菌株可能發(fā)生了藥劑的外排或者代謝，從而介導(dǎo)了抗性[34]。

對(duì)抗性突變體和親本菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選獲得了與藥劑解毒代謝和外排轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白。進(jìn)一步通過q R T-P C R 進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)P450 基因、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶 (glutathioneStransferase, GST) 基因以及ATP 結(jié)合盒 (ATPbinding cassette, ABC) 和主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(major facilitator superfamily, MFS) 編碼基因在抗性突變體中均顯著上調(diào)表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)這些上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行酵母異源表達(dá)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)P450 基因AG1IA_05136、GST 基因AG1IA_07383、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因AG1IA_06082和MFS 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因AG1IA_08645的轉(zhuǎn)化子對(duì)不同作用機(jī)制殺菌劑的敏感性均發(fā)生了顯著下降，其中P450 基因轉(zhuǎn)化子中雙苯菌胺代謝產(chǎn)物顯著增加，兩個(gè)還原代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生量分別約為空載體轉(zhuǎn)化子的5 倍和10 倍。而ABC 和MFS 基因轉(zhuǎn)化子對(duì)母體外排劑量顯著上調(diào)，與空載體轉(zhuǎn)化子相比，酵母轉(zhuǎn)化子BY4741:AG1IA_06082 和BY4741:AG1IA_08645 在藥劑處理后的6 h 和12 h 外排量分別上調(diào)1.97 倍、2.09 倍和2.46 倍、2.63 倍[34-35]。以上結(jié)果均表明，代謝和外排相關(guān)基因的過量表達(dá)是導(dǎo)致水稻紋枯病菌多藥抗性發(fā)生的重要原因。

不同病原菌對(duì)氟啶胺和雙苯菌胺的抗性機(jī)制報(bào)道列于表2。

表2 不同病原菌對(duì)氟啶胺和雙苯菌胺的抗性機(jī)制Table 2 The resistance mechanism of different pathogens to fluazinam and SYP-14288

4 抗藥性治理

針對(duì)靶標(biāo)蛋白氨基酸位點(diǎn)突變引起的病原菌對(duì)殺菌劑的抗性，可以通過藥劑的輪換使用來治理，但病原菌通過代謝解毒或藥劑外排產(chǎn)生抗藥性以及多藥抗性，嚴(yán)重情況下很可能導(dǎo)致病害面臨無藥可治的局面。尋找具有殺菌增效性的抑制劑物質(zhì)可以為病原菌抗性治理提供潛在應(yīng)用手段。使用外排蛋白抑制劑聯(lián)合抗真菌藥物來延緩真菌耐藥性已經(jīng)在臨床上得以應(yīng)用。利用外排蛋白抑制劑來抑制相應(yīng)外排蛋白的過量表達(dá)，從而抑制其對(duì)藥物的外排作用，提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度以發(fā)揮其最大的抑菌活性[36]。這為臨床治療由真菌引起的感染提供了理論依據(jù)，但同時(shí)也存在著一定的隱患，即外排抑制劑在發(fā)揮自身功能的同時(shí)，會(huì)對(duì)正常的細(xì)胞組織造成損害，因此使用前必須對(duì)其安全性進(jìn)行全面的評(píng)估。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，使用外排蛋白抑制劑或者代謝酶抑制劑如細(xì)胞色素P450 酶或谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以有效逆轉(zhuǎn)雜草和昆蟲的外排抗性或代謝抗性。Shan 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，3 種ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過量表達(dá)介導(dǎo)了小菜蛾對(duì)殺蟲劑氯蟲苯甲酰胺的抗性，而將外排抑制劑維拉帕米和藥劑混合使用時(shí)可以有效提高抗性群體的死亡率。P450 基因CYP6CM1的過量表達(dá)介導(dǎo)了煙粉虱對(duì)吡蟲啉的抗性，而使用P450 酶抑制劑胡椒基丁醚能夠通過抑制P450 酶的活性而提高害蟲對(duì)殺蟲劑的敏感性[38]。GST 抑制劑4-氯-7-硝基苯并噁二唑能夠有效抑制AmGSTF1 的活性，以此恢復(fù)黑草對(duì)多種除草劑的抗性[39]。在病原菌中，針對(duì)外排抗性或代謝抗性導(dǎo)致的多藥抗性治理尚缺乏系統(tǒng)的研究，目前對(duì)相關(guān)增效劑的探索主要集中在灰葡萄孢的多藥抗性上。陳晨[40]篩選獲得了ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑法尼醇和利血平，研究發(fā)現(xiàn)，二者與不同作用機(jī)制的殺菌劑分別以一定比例復(fù)配，能夠促進(jìn)藥劑在灰葡萄孢體內(nèi)的積累，從而提高殺菌劑的活性。孫銘優(yōu)[41]研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿可以有效抑制灰葡萄孢ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，其與不同作用機(jī)制的殺菌劑復(fù)配使用后，對(duì)灰葡萄孢多藥抗性菌株表現(xiàn)出增效作用，能夠作為防控多抗菌株的有效手段。代探[42]在探究病原菌對(duì)解偶聯(lián)劑的抗性機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，外排泵抑制劑阿米替林和維拉帕米與雙苯菌胺復(fù)配對(duì)辣椒疫霉抗性菌株表現(xiàn)出增效。該研究結(jié)果表明，一方面能夠根據(jù)抑制劑的作用機(jī)制尋找到與病原菌抗藥性相關(guān)的靶標(biāo)蛋白，另一方面可為應(yīng)用外排抑制劑延緩病原菌對(duì)殺菌劑的抗性提供理論支持。

研究發(fā)現(xiàn)，雙苯菌胺可通過影響水稻紋枯病菌代謝和外排相關(guān)基因過量表達(dá)介導(dǎo)病原菌多藥抗性的發(fā)生，基于P450 和GST 這兩類基因過量表達(dá)導(dǎo)致水稻紋枯病菌產(chǎn)生代謝抗性，篩選出對(duì)殺菌劑具有增效作用的代謝酶抑制劑馬來酸二乙酯和黃烷酮，二者顯著提高了突變體X19-7 對(duì)不同供試殺菌劑的敏感性，這為植物病原菌的多藥抗性治理提供了新的思路[43-44]。

盡管具有殺菌劑增效作用的抑制劑能夠?yàn)橹参锊≡目剐灾卫硖峁撛诘慕鉀Q方案，但這些抑制劑在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用前景和使用效果仍有待于通過田間試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，對(duì)抑制劑的生物和環(huán)境安全性也需要進(jìn)行全面、系統(tǒng)的評(píng)估。此外，抑制劑在田間的使用成本也須充分考慮，開源節(jié)流，從而最大限度地確保農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。

5 小結(jié)

截至目前，植物病原菌對(duì)以氟啶胺為代表的解偶聯(lián)劑在田間的抗性發(fā)展較為緩慢，但在實(shí)驗(yàn)室藥劑馴化條件下，已獲得一系列對(duì)雙苯菌胺和氟啶胺抗性倍數(shù)較高的病原菌抗性突變體，并表現(xiàn)出對(duì)不同作用機(jī)制藥劑敏感性均下降的情況，說明該類藥劑具有導(dǎo)致病原菌多藥抗性的潛在風(fēng)險(xiǎn)。隨著氟啶胺在我國各類作物病害防治中登記范圍的擴(kuò)大和進(jìn)一步推廣應(yīng)用，該類藥劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)值得關(guān)注。已有研究揭示出植物病原菌對(duì)解偶聯(lián)劑的抗性分子機(jī)制包括P450 和GST 參與的代謝抗性機(jī)制，以及ABC 和MFS 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與的外排抗性機(jī)制，其中有關(guān)代謝抗性的研究結(jié)果豐富了殺菌劑抗性研究體系。有關(guān)田間病原菌的多藥抗性在我國果蔬灰霉病和草坪幣斑病上已被頻繁報(bào)道，其田間成因是否與某些藥劑的使用有關(guān)尚不清楚。而植物病原菌的多藥抗性問題輕則降低農(nóng)藥防效，需要加大田間用藥量，從而需要增加成本投入，影響環(huán)境安全，重則可造成病害無藥可治的局面，這對(duì)具有全新作用機(jī)制殺菌劑的創(chuàng)制提出更高的挑戰(zhàn)。植物病原菌對(duì)解偶聯(lián)劑抗性機(jī)制的揭示為病原菌多藥抗性形成機(jī)制的解析提供了參考，也為在病原菌抗性治理中增效劑的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。