核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)研究進展

何承帥, 張 輝, 吳順凡, 高云昊, 高聰芬

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 綠色農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，植物保護學(xué)院，南京 210095)

化學(xué)防治是防控農(nóng)業(yè)有害生物的有效措施，在保障糧食安全方面有著不可或缺的地位。據(jù)統(tǒng)計，全球每年由病蟲害導(dǎo)致的作物產(chǎn)量損失在30%～40%[1]，使用化學(xué)農(nóng)藥可至少挽回30%的產(chǎn)量損失?；瘜W(xué)農(nóng)藥具有使用方便、防治速度快、防治效果好等優(yōu)點，但長期或不合理使用可能引致防治對象對農(nóng)藥產(chǎn)生抗性、農(nóng)藥對非目標生物的毒副作用以及環(huán)境污染等一系列問題。因此，尋找高效且安全的新型綠色農(nóng)藥是農(nóng)藥行業(yè)發(fā)展的重要方向。

RNA 干擾 (RNA interference，RNAi) 是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA (doublestranded RNA，dsRNA) 誘發(fā)的、同源信使RNA(messenger RNA，mRNA) 高效特異性降解的現(xiàn)象，可通過抑制轉(zhuǎn)錄前水平或轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達而誘導(dǎo)功能缺失的表型[2]。核酸農(nóng)藥是一類可以特異性地結(jié)合靶標生物中特定基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 的多核苷酸，通過靶標生物體內(nèi)天然存在的RNAi 系統(tǒng)沉默相應(yīng)基因的表達，從而干擾靶標生物的正常生長及其對寄主植物的危害，最終達到保護植物目的的植物保護劑[3]。核酸農(nóng)藥具有特異性強、見效周期短、無殘留和對非靶標生物影響較小等優(yōu)勢，被譽為農(nóng)藥史上第3 次革命，是新型綠色農(nóng)藥創(chuàng)制領(lǐng)域的熱點[4]。近年來，基于RNAi技術(shù)的核酸農(nóng)藥已逐漸走向市場[3,5]。目前，核酸農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)有害生物防治方面的應(yīng)用方式主要包括以轉(zhuǎn)基因作物為主的轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥和直接噴施dsRNA 為主的可噴灑核酸農(nóng)藥兩種類型[3,6]。相較于具有潛在風險的轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥，外源施用的可噴灑核酸農(nóng)藥更符合公眾對農(nóng)藥的認知，更具應(yīng)用前景和市場潛力，是未來核酸農(nóng)藥的理想應(yīng)用方式。然而，體外應(yīng)用dsRNA在環(huán)境中不穩(wěn)定，易被RNA 降解酶、紫外光和高溫降解[7-8]，難以有效地導(dǎo)入靶標生物體內(nèi)等技術(shù)難題，嚴重限制了可噴灑核酸農(nóng)藥的實際應(yīng)用效果。

納米材料具有納米尺度下的小尺寸效應(yīng)、界面效應(yīng)以及良好的生物兼容性等特點，其作為dsRNA載體可以增強dsRNA 在環(huán)境中的穩(wěn)定性和進入目標生物組織或細胞的能力，進而提高靶向遞送效率，是解決核酸農(nóng)藥外源施用難的有效手段[9-12]。近年來，隨著納米材料的快速發(fā)展和dsRNA 高效合成技術(shù)日漸成熟，基于納米材料的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)在有害生物防治方面取得了一系列重要的進展。鑒于此，本文對核酸農(nóng)藥的應(yīng)用方式與挑戰(zhàn)、產(chǎn)業(yè)化進展、基于納米材料的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)及其國內(nèi)外應(yīng)用研究進展進行綜述，并對核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的前景和面臨的挑戰(zhàn)進行展望，旨在為核酸農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)有害生物綠色防控中的推廣應(yīng)用提供參考。

1 核酸農(nóng)藥的應(yīng)用方式與挑戰(zhàn)

自從1998 年Fire 等[13]在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans中發(fā)現(xiàn)RNAi 現(xiàn)象以來，開發(fā)基于RNAi 原理的核酸農(nóng)藥應(yīng)用于保護植物和防治有害生物方面就受到廣泛關(guān)注并取得了重要進展。之前龔流娥等[14]、王治文等[3]在影響RNAi 效率的主要因素、核酸農(nóng)藥防治原理及應(yīng)用現(xiàn)狀等相關(guān)方面進行了綜述，本節(jié)側(cè)重于討論核酸農(nóng)藥在病蟲害防治中應(yīng)用方式的研究進展與挑戰(zhàn)。

1.1 轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥

轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥可以通過轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)傳遞針對害蟲致命基因的dsRNA 或者小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)，從而賦予作物自身防御病蟲害的能力[15-16]。轉(zhuǎn)基因作物可以通過植物細胞產(chǎn)生dsRNA/siRNA，而后經(jīng)過食物鏈進入靶標生物體內(nèi)，打破dsRNA/siRNA 穩(wěn)定供應(yīng)的限制，從而觸發(fā)持續(xù)的RNAi 反應(yīng)。轉(zhuǎn)基因作物自身表達dsRNA 或者siRNA 的轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥在有害生物管理方面具有成本低、穩(wěn)定表達和高特異性等諸多優(yōu)勢[17]。

目前，新型的葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以讓dsRNA 穩(wěn)定地在葉綠體中積累而不會被自身的RNAi 元件 (Dicer 酶) 切割降解，其克服了基于常規(guī)細胞核轉(zhuǎn)基因技術(shù)的轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥會被植物自身RNAi 系統(tǒng)識別切割，進而影響RNAi 效率和防控效果的應(yīng)用難題[18-20]。然而，轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥仍具有一定的局限性，例如：許多作物無法進行基因改造[8]；在水稻、小麥和玉米等主要糧食作物上難以開發(fā)葉綠體轉(zhuǎn)化方案[5]。此外，轉(zhuǎn)基因作物的農(nóng)產(chǎn)品在大多數(shù)國家具有較低的市場公眾接受度，對其潛在的環(huán)境風險需要進行嚴格的風險評估[21-23]。

1.2 可噴灑核酸農(nóng)藥

近年來，利用噴霧誘導(dǎo)基因沉默 (spray-induced gene silencing，SIGS) 技術(shù)在植物表面應(yīng)用可噴灑核酸農(nóng)藥進行農(nóng)業(yè)有害生物防治的方式受到了核酸農(nóng)藥研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[24-26]。與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比，可噴灑核酸農(nóng)藥具有對靶標生物的高特異性和快速自然降解的優(yōu)點[27-29]。

隨著對核酸農(nóng)藥研究的不斷深入，關(guān)于葉面噴施核酸農(nóng)藥進行有害生物防治的研究越來越多。2001 年，Tenllado 等[30]首次報道了葉面應(yīng)用dsRNA 可成功干擾辣椒輕斑駁病毒 (pepper mild mottle virus，PMMoV)、苜?；ㄈ~病毒 (alfalfa mosaic virus，AMV) 和煙草蝕紋病毒 (tobacco etch virus，TEV) 對煙草Nicotiana tabacum的侵染。Koch 等[31]研究表明，在大麥Hordeum vulgare葉片表面噴灑靶向3 個禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum麥角甾醇生物合成基因 (CYP51A、CYP51B、CYP51C) 的dsRNA (CYP3-dsRNA)，可有效抑制禾谷鐮刀菌的生長。Wang 等[32]發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢菌Botrytis cinerea在侵染植物時可以將siRNAs(主要由灰葡萄孢菌Dicer 蛋白BcDCL1 和BcDCL2產(chǎn)生) 傳遞到植物細胞中，以沉默宿主免疫基因；在植物表面應(yīng)用靶向灰葡萄孢菌DCL1 和DCL2基因的siRNA 或dsRNA 可削弱這種沉默，進而顯著抑制灰霉病。李本杰等[33]在馬鈴薯Solanum tuberosum葉面上施用針對馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata肌動蛋白基因的dsRNA，能夠有效防治該類害蟲28 d 以上。Andrade 等[34]用靶向亞洲柑橘木虱Diaphorina citri精氨酸激酶基因的dsRNA 處理柑橘Citrus sinensis葉片，發(fā)現(xiàn)柑橘木虱取食后會因精氨酸激酶基因的表達受到干擾而死亡。

與轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥相比，可噴灑核酸農(nóng)藥因開發(fā)時間短、開發(fā)成本低、抗性風險低、調(diào)控過程簡單及對所有作物的可行性高而備受青睞[35]。噴施操作便捷且應(yīng)用場景多樣，是核酸農(nóng)藥未來主要的應(yīng)用方式。然而，可噴灑核酸農(nóng)藥在實際應(yīng)用中也受到諸多因素的限制。例如：植物細胞和大多病原菌細胞具有由纖維素等物質(zhì)構(gòu)成的較厚且堅硬的細胞壁，厚度從0.1 μm 到幾個微米不等，這對核酸農(nóng)藥的傳遞構(gòu)成了物理障礙[36-37]；昆蟲中腸內(nèi)的內(nèi)切酶可以降解進入體內(nèi)的dsRNA，從而降低昆蟲的RNAi 效率[38-40]。此外，dsRNA 在環(huán)境中的降解也是RNAi 無效誘導(dǎo)的主要原因[28,41-44]。

2 核酸農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化進展

在過去的幾十年里，隨著生物技術(shù)迅速發(fā)展，核酸農(nóng)藥作為一種新興的農(nóng)業(yè)防治手段引起了廣泛關(guān)注。通過對潛在靶基因的篩選和功能分析，以及基于RNAi 的作物保護和作物改良策略的設(shè)計，部分核酸農(nóng)藥已成功實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

2.1 轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥

2017 年，孟山都公司 (現(xiàn)已被拜耳公司收購)利用一種天然高效的轉(zhuǎn)基因載體——農(nóng)桿菌 (屬于革蘭氏陰性細菌) 將目的基因轉(zhuǎn)入受體品種中，開發(fā)了一種可以同時表達蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis，Bt) Cry3Bt1 蛋白和西方玉米根甲蟲Diabrotica virgifera virgifera Snf7基因dsRNA 的商業(yè)轉(zhuǎn)基因玉米MON87411，并獲得美國環(huán)境保護署 (EPA) 批準，成為全球獲批的首項基于RNAi技術(shù)控制害蟲的核酸農(nóng)藥[45]。該產(chǎn)品創(chuàng)新性地通過將RNAi 技術(shù)與Bt 毒素相結(jié)合的方式，改善了對西方玉米根甲蟲的控制[46]。2021 年，該產(chǎn)品成功獲得了中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技教育司頒發(fā)的轉(zhuǎn)基因生物安全證書 (進口) 批準 (http://www.kjs.moa.gov.cn/gzdt/202101/t20210113_6359909.htm)，主要用作加工原料。同年，歐盟委員會批準了該產(chǎn)品用于食品和飼料的加工原料[47]。2022—2023 年，拜耳公司在美國和加拿大對該產(chǎn)品進行了商業(yè)化種植與推廣[48]。

宿主誘導(dǎo)的基因沉默并不局限于對害蟲的控制，一些使用RNAi 來改善作物質(zhì)量的產(chǎn)品也已被授權(quán)批準，或?qū)⒃诓痪玫膶磉M入市場。例如，2018 年，拜耳公司通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化傳統(tǒng)大豆Glycine max得到含有FAD2-1A/FATB1Ab(脂肪酸生物合成途徑關(guān)鍵基因) 表達抑制盒和cp4-epsps耐除草劑基因的轉(zhuǎn)基因大豆MON87705，該產(chǎn)品可以改良大豆脂肪酸組成，并對除草劑草甘膦具有抗性，目前該產(chǎn)品在美國、加拿大和日本已被批準用于食品和飼料的加工原料以及商業(yè)化種植，在歐盟已被批準用于飼料和食品的加工原料[47]。2022 年，美國農(nóng)業(yè)部動植物衛(wèi)生檢驗局(APHIS) 解除了同樣采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯Z6 的管制。在該馬鈴薯品種中，RNAi 介導(dǎo)的靶基因沉默可以防止馬鈴薯擦傷，減少丙烯酰胺的含量，并提高淀粉質(zhì)量[49]。然而，這種基于農(nóng)桿菌侵染植物實現(xiàn)核酸農(nóng)藥遞送的方式仍然存在不足之處。例如，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體物種有限，單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，往往具有較低的轉(zhuǎn)化率和外源基因表達水平，大多數(shù)單子葉植物無法通過農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化[50]。

2.2 可噴灑核酸農(nóng)藥

基于SIGS 技術(shù)的可噴灑核酸農(nóng)藥不需要植物轉(zhuǎn)化就可以為植物提供病蟲害的高度定向保護，不受因植物轉(zhuǎn)化所涉及的技術(shù)挑戰(zhàn)以及獲得監(jiān)管批準的時間和成本的限制，近年來得到了蓬勃發(fā)展。2019 年，拜耳公司向EPA 提交了全球首個可噴灑核酸農(nóng)藥新產(chǎn)品BioDirect，該產(chǎn)品可顯著降低養(yǎng)蜂業(yè)的主要害蟲狄斯瓦螨Varroadestructor的存活率，卻對蜜蜂沒有影響[47]。2021 年，拜耳將該產(chǎn)品專利授權(quán)給Greenlight Biosciences 公司進行生產(chǎn)，新產(chǎn)品預(yù)計2024 年上市[6]。馬鈴薯甲蟲因其對RNAi 反應(yīng)的高度敏感性成為了核酸農(nóng)藥公司研發(fā)可噴灑核酸農(nóng)藥的焦點。2021 年，先正達公司在田間驗證了直接噴灑dsRNA 用于控制馬鈴薯甲蟲的可行性，相關(guān)產(chǎn)品預(yù)計在7～10 年內(nèi)實現(xiàn)商業(yè)化[51]。2022 年，Greenlight Biosciences 公司研發(fā)的可噴灑核酸農(nóng)藥ledprona 通用名獲得國際標準化組織 (ISO) 的批準 (https://committee.iso.org/)，葉面噴施該產(chǎn)品可以有效防治馬鈴薯甲蟲，Greenlight Biosciences 公司就該產(chǎn)品已向EPA 提交申請登記。

總體而言，核酸農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化進展迅速，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了新的選擇。隨著核酸合成技術(shù)的進一步成熟和市場需求的增加，核酸農(nóng)藥在未來將得到進一步的研發(fā)和推廣，同時可噴灑核酸農(nóng)藥展現(xiàn)出良好的商業(yè)化前景?？蓢姙⒑怂徂r(nóng)藥的應(yīng)用效率與dsRNA 在環(huán)境中的穩(wěn)定性密切相關(guān)，研發(fā)安全高效的保護遞送系統(tǒng)已成為克服可噴灑核酸農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化瓶頸的前沿熱點。

3 納米材料介導(dǎo)的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)

核酸農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力和商業(yè)價值，然而，其應(yīng)用效果受環(huán)境因素影響較大，噴灑使用后易降解失效，嚴重限制了核酸農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用。近年來，納米科技的迅猛發(fā)展為安全、高效、穩(wěn)定地向靶標對象 (植物、昆蟲等)遞送核酸農(nóng)藥提供了新途徑，基于納米材料負載核酸農(nóng)藥的納米遞送系統(tǒng) (圖1) 相關(guān)研究備受關(guān)注。

圖1 納米材料介導(dǎo)的dsRNA/siRNA 傳遞系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic representation of nanomaterial-mediated dsRNA/siRNA delivery systems

3.1 納米材料的優(yōu)勢

國際上關(guān)于納米材料和納米尺度的定義尚無統(tǒng)一規(guī)定[52-53]。我國關(guān)于納米材料的定義為任一外部維度、內(nèi)部或表面結(jié)構(gòu)處于納米尺度 (1～100 nm)的材料稱為納米材料 (https://openstd.samr.gov.cn/bzgk/gb/)。納米材料作為新興的核酸遞送載體，在提高核酸農(nóng)藥轉(zhuǎn)染效率、干擾效率和穩(wěn)定性等方面具有獨特優(yōu)勢。

1) 提高轉(zhuǎn)染效率。據(jù)報道，由介孔二氧化硅納米顆粒、層狀雙氫氧化物納米片和碳納米管等納米材料負載DNA 或RNA，可在沒有機械輔助(例如基因槍、超聲波、渦旋和電穿孔等) 條件下穿透植物細胞和病原菌細胞的細胞壁，從而產(chǎn)生瞬時或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化[54]。納米材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方式已成功應(yīng)用于煙草、玉米、擬南芥、洋蔥等作物，展現(xiàn)出普適性[55]。

2) 提升干擾效率。Avila 等[56]設(shè)計了一種基于兩親性肽的納米膠囊負載BiP(Binding protein) 基因 (編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熱休克蛋白) 的dsRNA，飼喂法生物測定結(jié)果表明，相較于裸BiP-dsRNA，BiPdsRNA 納米膠囊可縮短豌豆蚜Acyrthosiphon pisum幼蟲的死亡時間，并顯著提高赤擬谷盜Tribolium castaneum的死亡率。

3) 增加dsRNA 穩(wěn)定性。納米材料可以將dsRNA包裹在其表面或內(nèi)部，其本身的尺寸和結(jié)構(gòu)可以提供物理屏障，防止dsRNA 與酶相互作用，從而增強dsRNA 的穩(wěn)定性。例如，Ma 等[57]利用一種星狀陽離子聚合物納米載體 (star polycation，SPc)對dseGFP進行負載后形成dsRNA/SPc 復(fù)合物，RNase A 酶和昆蟲血淋巴處理不會造成復(fù)合物中dseGFP的降解，表明該納米載體對dseGFP提供了強有力的保護作用。Christiaens 等[58]發(fā)現(xiàn)，鳥苷酸聚合物作為納米載體可以防止外源dsRNA 在甜菜夜蛾Spodoptera exigua堿性腸道中的降解，證明了該類納米材料對核酸具有高效保護性。此外，納米材料還可以克服昆蟲腸道圍食膜、植物表皮以及昆蟲體壁等障礙，進而顯著提升RNAi效率和病蟲害控制效果[9,11-12]。

3.2 核酸農(nóng)藥的負載

通過納米材料的負載，可有效延長核酸農(nóng)藥在環(huán)境中的降解周期以及保護核酸農(nóng)藥免受生物機體的免疫識別。納米材料應(yīng)該具有結(jié)合或封裝核酸分子的能力，這是其負載核酸農(nóng)藥的一個重要前提。通常情況下，帶正電荷的納米材料可與帶負電荷的RNA 分子，通過靜電作用形成dsRNA/siRNA-納米材料復(fù)合物[59-60]。例如：殼聚糖含有大量的氨基，在生物微酸性條件下帶有正電荷，其可以通過靜電作用負載RNA，形成RNA-殼聚糖復(fù)合物[61-62]；樹枝狀陽離子聚合物的表面具有大量帶正電荷的胺類官能團，可以與負電性的dsRNA/siRNA 結(jié)合，完成核酸農(nóng)藥的負載[63]。同樣的，支鏈兩親性肽膠囊的表面具有大量的陽離子賴氨酸基團，其可以與核酸分子形成dsRNA/siRNA-支鏈兩親性肽膠囊復(fù)合物[64]。對于負載率低的無機納米材料，可以對其表面進行多官能團 (-NH2、-CHO 和-OH 等) 修飾，使其通過化學(xué)偶聯(lián)作用或者配體反應(yīng)等與核酸分子結(jié)合[65-66]。Zhao 等[66]采用帶正電荷的聚乙烯亞胺 (polyethyleneimine，PEI) 對四氧化三鐵磁性納米顆粒 (magnetic nanoparticle，MNP) 進行表面修飾后作為DNA 載體，可以與電負性DNA 結(jié)合，并凝聚形成MNPDNA 復(fù)合物。Yang 等[67]利用陽離子聚酰胺樹狀分子 (polyamidoamine dendrimer，PAMAM) 來改善碳納米管的功能特性，使其與帶負電荷的siRNA 發(fā)生靜電相互作用，從而增加碳納米管對核酸分子的負載。脂質(zhì)體可以通過將核酸分子包裹在其親水內(nèi)核，從而完成負載結(jié)合[60,68]，而脂質(zhì)納米顆粒則是通過具有的陽離子脂質(zhì)與核酸物質(zhì)通過靜電絡(luò)合作用在其內(nèi)部形成膠束結(jié)構(gòu)，從而完成核酸農(nóng)藥的負載[69]。

3.3 細胞攝取與內(nèi)體逃逸

細胞攝取是影響核酸農(nóng)藥對宿主細胞有效生物利用度的重要因素。核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)可以利用細胞壁間的孔洞 (例如花粉孔、葉面氣孔)直接穿過細胞壁[70]。表面帶有正電荷的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)可以與帶有負電荷的細胞膜表面結(jié)合，在胞吞作用下進入細胞質(zhì)，完成跨膜轉(zhuǎn)運[53,59,71]。因此，具有正電荷的陽離子納米載體材料較中性或陰離子納米載體材料更容易被細胞攝取，表現(xiàn)出更高的細胞轉(zhuǎn)染效率[71-72]。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)沈杰研究團隊發(fā)現(xiàn)，dseGFP/SPc 處理可顯著上調(diào)Sf9 細胞的Chc基因 (編碼網(wǎng)格蛋白的包被凹坑和囊泡表面結(jié)構(gòu)的主要多肽[73])、AP2S1基因 (編碼AP2 異四聚體復(fù)合物的σ 亞單位，AP2 復(fù)合物是網(wǎng)格蛋白包被小泡的核心成分，促進膜蛋白的內(nèi)吞作用[74])、Arf1基因 (ARF 蛋白通過募集各種輔助蛋白構(gòu)成運輸囊泡，是內(nèi)吞作用中的關(guān)鍵蛋白[75])等關(guān)鍵基因的表達，激活網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞通路，從而增強細胞對dsRNA 的攝?。贿M一步采用質(zhì)子泵抑制劑 (抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用) 巴佛洛霉素A (bafilomycin-A，Baf A) 體外處理Sf9細胞后，dseGFP/SPc 無法激活細胞內(nèi)的RNAi 效應(yīng)；該研究證明了網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是細胞攝取SPc 介導(dǎo)的dsRNA 遞送的主要途徑[57]。

核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)通過內(nèi)吞作用被內(nèi)化形成內(nèi)吞囊泡，若其不能從內(nèi)體及時逃逸，則會與內(nèi)體一起進入溶酶體中從而降解，從而限制核酸農(nóng)藥的細胞生物利用度。目前研究表明，大多數(shù)RNA 納米遞送系統(tǒng)內(nèi)體逃逸的重要機制為“質(zhì)子海綿效應(yīng)”[68,76]，即RNA 納米遞送系統(tǒng)進入內(nèi)體后，為緩沖內(nèi)體內(nèi)的酸性環(huán)境而吸收大量質(zhì)子，大量質(zhì)子涌入內(nèi)吞囊泡導(dǎo)致內(nèi)體的滲透性水腫脹，最終導(dǎo)致內(nèi)體破裂，完成內(nèi)體逃逸[77-78]。值得注意的是，陽離子脂質(zhì)納米顆粒具有獨特的內(nèi)體逃逸機制，它們通過識別并結(jié)合內(nèi)體膜上的磷脂分子，從而破壞內(nèi)體的穩(wěn)定性，完成內(nèi)體逃逸并釋放所負載的dsRNA/siRNA[79-80]。納米遞送載體或可以促進核酸農(nóng)藥的內(nèi)體逃逸。例如，Ma等[57]通過激光共聚焦顯微成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與裸露的dsRNA 相比，dseGFP/SPc 孵育的Sf9 細胞的晚期核內(nèi)體中沒有dsRNA 的積累，表明SPc 納米載體可以促進dsRNA 的內(nèi)體逃逸。

3.4 核酸農(nóng)藥的釋放

核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)具有生物活性的本質(zhì)是基于dsRNA/siRNA 的RNAi 作用。因此，dsRNA/siRNA 必須從納米載體中釋放出來才能激活RNAi途徑，抑制靶標生物特異mRNA 的表達，最終發(fā)揮核酸農(nóng)藥的生物效應(yīng)。然而，目前關(guān)于dsRNA/siRNA 從納米載體中的釋放機制研究報道相對較少。

2001 年，Moret 等[81]研究發(fā)現(xiàn)，肝素、硫酸軟骨素等生物體內(nèi)的聚陰離子可以解離穩(wěn)定的DNA 與PEI 復(fù)合物PEI-DNA，釋放DNA。2004年，Okuda 等[82]首次在體外證明了PEI-DNA 復(fù)合物在細胞質(zhì)中的解離，并且發(fā)現(xiàn)陽離子含量比例低的陽離子聚合物類納米材料-DNA 復(fù)合物可以自主釋放DNA；該研究表明，具有較高親和力的生物體內(nèi)聚陰離子可以通過競爭結(jié)合，導(dǎo)致PEI-DNA的解離，并將DNA 釋放到細胞質(zhì)中。然而，這種競爭性的置換過程通常是非常緩慢的[83]。

納米材料響應(yīng)細胞內(nèi)刺激而造成的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)結(jié)構(gòu)崩解是另一種誘導(dǎo)核酸農(nóng)藥釋放的機制。該類納米材料自身的物理或化學(xué)性質(zhì)可以在生物細胞內(nèi)環(huán)境因素的刺激下發(fā)生響應(yīng)性改變，如胞漿pH 值和氧化還原性的改變從而誘導(dǎo)遞送系統(tǒng)結(jié)構(gòu)崩解[83]。例如：聚(β-氨基酯) (poly(β-aminoester)s) 是一種基因遞送常用的陽離子聚合物，其解離速率取決于環(huán)境pH 和組成聚合物的鏈構(gòu)象[84-86]；含有二硫鍵 (S－S) 的核酸納米遞送系統(tǒng)在組織或細胞中谷胱甘肽的氧化還原刺激下，其二硫鍵被催化斷裂，進而響應(yīng)釋放裝載的核酸分子[87]。

3.5 基于納米材料遞送核酸農(nóng)藥的應(yīng)用進展

基于RNAi 的病蟲害防治技術(shù)正在給農(nóng)藥領(lǐng)域帶來革命性的變化，因為其針對的是有害生物的遺傳基因，而不是下游的蛋白質(zhì)，這為許多棘手的病蟲害防治提供了潛在的防治可能。為了解決核酸農(nóng)藥自身的局限性，開發(fā)能夠促進核酸農(nóng)藥分子進入到靶標生物細胞的高效遞送系統(tǒng)尤為重要。目前，基于載體的核酸農(nóng)藥遞送系統(tǒng)按其遞送載體的來源和性質(zhì)，可以分為病毒類和非病毒類遞送載體兩種類型。病毒類載體是通過改造病毒來遞送目標基因的常用工具，具有較高的細胞轉(zhuǎn)染效率，但其存在制備工藝復(fù)雜、成本昂貴、可載入基因片段大小有限 (通常低于7 kb) 且容易引起機體免疫反應(yīng)等缺陷，極大地限制了病毒類載體的應(yīng)用[88]。而非病毒類遞送載體因其具有低免疫性、低毒性和高安全性等優(yōu)勢逐步成為核酸農(nóng)藥遞送載體領(lǐng)域的研究熱點[89]。近年來，納米材料作為新興的非病毒類核酸遞送載體，在新型核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的開發(fā)中得到了廣泛的關(guān)注 (表1)。在此基礎(chǔ)上，本小節(jié)對基于有機(脂質(zhì)、聚合物、多肽) 和無機 (碳、層狀雙氫氧化物) 納米材料的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)研究報道進行歸納綜述。

3.5.1 基于脂質(zhì)的納米材料 基于脂質(zhì)的納米材料是一類用途極為廣泛的非病毒類核酸載體材料，在各種生理環(huán)境下具有穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)，并且可以輕松地與各種生物膜結(jié)合，從而能夠有效地遞送核酸分子[60,108]。脂質(zhì)通常被定義為疏水性或兩親性分子，在結(jié)構(gòu)組成上包括一個親水性的頭部和一個疏水性的尾部，以及它們之間的連接物。基于脂質(zhì)的納米材料通常含有一定的脂質(zhì)成分，如磷脂、膽固醇或聚乙二醇組分等。由于合成方法、脂質(zhì)成分、形態(tài)結(jié)構(gòu)等存在差異，目前用于核酸遞送的脂質(zhì)納米材料可劃分為脂質(zhì)體與脂質(zhì)納米顆粒兩種類型 (圖2)[69,109]。

圖2 脂質(zhì)體 (左) 和脂質(zhì)納米粒 (右) 的示意圖[109]Fig.2 Schematic representation of liposomes (left) and lipid nanoparticles (right)[109]

3.5.1.1 脂質(zhì)體 脂質(zhì)體是由脂質(zhì)自組裝成有序排列的雙分子層封閉囊泡，具有親水的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu) (圖2 左)。脂質(zhì)體由于其良好的生物相容性、生物降解性、低毒性以及遞送親水和親脂性藥物的能力，已成為促進小分子和大分子傳遞的強大藥物載體[110-111]。Lin 等[90]將靶向德國小蠊Blattella germanica微管蛋白基因 (α-tubulin，Tub) 的dsRNA(dsTub) 封裝進脂質(zhì)體中，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體可以有效防止該dsTub在中腸中的降解，飼喂dsTub/脂質(zhì)體復(fù)合物的基因沉默效率達60%，顯著提高了dsTub處理害蟲的死亡率。類似地，Castellanos 等[91]利用脂質(zhì)體2000 封裝靶向ATP 酶 (vATPase A) 和肌肉肌動蛋白 (act-2) 的dsRNA，飼喂新熱帶區(qū)褐臭蝽Euschistus heros上述復(fù)合物，14 d 后可以導(dǎo)致45%和42%的試蟲死亡，相較于裸露的dsRNA和dsRNA/EDTA 處理，dsRNA/脂質(zhì)體系統(tǒng)具有更好的遞送效果。盡管脂質(zhì)體作為核酸農(nóng)藥載體有很大優(yōu)勢，但其合成方法較復(fù)雜，并需要使用大量的有機溶劑，這可能會不利于其大規(guī)模生產(chǎn)[111]。

3.5.1.2 脂質(zhì)納米顆粒 脂質(zhì)納米顆粒 (lipid nanoparticles，LNPs) 在廣義上是指以脂質(zhì)形成的納米顆粒，是用來描述一種不同于脂質(zhì)體的特定類型的納米顆粒[109]。從組成上，LNPs 與脂質(zhì)體的主要成分大致相同，都含有脂質(zhì)和膽固醇，但形成LNPs 的脂質(zhì)必須包含可電離脂質(zhì)，而脂質(zhì)體則對此沒有嚴格的限制。從各成分比例上看，LNPs與脂質(zhì)體之間存在較大的差異，尤其是中性輔助脂類 (膽固醇、磷脂等) 的用量，LNPs 需要物質(zhì)的量之比 (摩爾比例) 在30%～40%的輔助脂類，才能有效封裝dsRNA/siRNA[109]。從形貌來上，LNPs沒有脂質(zhì)體的親水空腔，相反，其內(nèi)部具有膠束結(jié)構(gòu)[69,109](圖2 右)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所任廣偉團隊采用PEI 修飾的LNPs 封裝昆蟲生長發(fā)育關(guān)鍵基因，即保幼激素受體基因 (Methoprenetolerant，Met) 的dsRNA，成功制備了Met3@PEI@LNPs 納米復(fù)合物 (385 nm，-36.9 mV)，其細胞轉(zhuǎn)染效率達到96.4%；飼喂法生物測定結(jié)果表明，在僅為對照組25%的dsRNA 濃度下，Met3@PEI@LNPs 處理的草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda干擾效率仍高達91.7%，顯著控制了草地貪夜蛾種群數(shù)量[92]。與脂質(zhì)體相比，LNPs 具有更高的動力學(xué)穩(wěn)定性和生物利用度，且易于大規(guī)模生產(chǎn)。

3.5.2 聚合物納米材料 聚合物納米材料 (polymer nanoparticles，PNPs) 是指由小分子化合物通過聚合反應(yīng)形成的具有納米尺度 (1～1000 nm) 的一類膠體材料，具有較高生物安全性、廣泛結(jié)構(gòu)多樣性和良好生物降解性[112]。因具有易于合成、結(jié)構(gòu)多樣、高轉(zhuǎn)染效率和生物相容性等特性，PNPs 成為了非病毒類核酸分子遞送載體的主要材料，被廣泛應(yīng)用于基因治療和核酸農(nóng)藥遞送領(lǐng)域。

3.5.2.1 殼聚糖 殼聚糖是天然多糖甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物，含有羥基和氨基，是最常用的天然聚合物材料之一。由于具有低成本、易于降解和生物相容性等特點，殼聚糖納米顆粒 (chitosan nanoparticles，CNPs) 已被廣泛應(yīng)用于dsRNA、siRNA、質(zhì)粒、寡核苷酸、多肽、甚至蛋白質(zhì)等生物分子遞送[97,113-114]。Zhang 等[93]于2010 年首次利用CNPs (70 nm) 裝載dsRNA，發(fā)現(xiàn)飼喂dsRNA/CNPs 復(fù)合物 (100～200 nm) 可以顯著增加岡比亞按蚊Anopheles gambiae AgCHS1基因的沉默效率(62.8%)。Kumar 等[61]研究表明，dsRNA/CNPs 復(fù)合物 (100～200 nm，+12 mV，包封率85%) 可以明顯抑制與翅膀發(fā)育相關(guān)的Vg基因的表達，顯著提高埃及伊蚊Aedes aegypti3 齡幼蟲的死亡率，延遲幼蟲的生長發(fā)育，并導(dǎo)致成蟲翅膀畸形。Lichtenberg 等[94]證明，采用dsRNA/CNPs (CNPs：15.6 nm ± 3.5 nm，+29 mV ± 4.0 mV) 浸泡處理秀麗隱桿線蟲，比僅使用dsRNA 處理具有更高的轉(zhuǎn)染效率和沉默效率；另外發(fā)現(xiàn)，CNPs 可以下調(diào)線蟲體內(nèi)肌凝蛋白的表達。Kolge 等[95]發(fā)現(xiàn)，CNPs(100 nm，+32 mV) 可以有效介導(dǎo)針對棉鈴蟲Helicoverpa armigera保幼激素甲基轉(zhuǎn)移酶(Juvenile hormone methyltransferase，JHAMT) 和乙酰膽堿酯酶 (Acetylcholine esterase，ACHE) 靶基因的dsRNA 的遞送，提高dsRNA 沉默效率和抑制相關(guān)酶活性，室內(nèi)生物測定結(jié)果表明，僅噴灑1 mL dsRNA/CNPs 復(fù)合物(200 μg:1000 ng)可使害蟲死亡率達100%，且對非靶標生物黑腹果蠅Drosophila melanogaster和斜紋夜蛾Spodoptera litura無影響。類似地，CNPs (95 nm，+36 mV)可有效保護針對棉鈴蟲中性脂肪酶 (HaLipn 001)和幾丁質(zhì)酶靶基因的dsRNA 在昆蟲腸道核酸酶和不同pH 條件下的降解，通過飼喂法測定發(fā)現(xiàn)，dsRNA/CNPs 復(fù)合物可有效地沉默脂肪酶和幾丁質(zhì)酶靶基因 (2.0～2.7 倍下調(diào))，并抑制其酶活性(2.0～5.3 倍)[96]。

通過將殼聚糖與三聚磷酸鈉 (tripolyphosphate，TPP)、葉酸、聚乙二醇 (polyethylene glycol，PEG)、聚乙烯亞胺和葡聚糖硫酸鹽等交聯(lián)劑結(jié)合，可進一步提高其對dsRNA/siRNA 的保護能力，并提高轉(zhuǎn)染效率和沉默效率[115-116]。例如，Dhandapani 等[97]將殼聚糖與TPP 交聯(lián)，合成了粒徑小于200 nm 載有dsRNA 的納米復(fù)合物 (CS-TPPdsRNA)，其使埃及伊蚊的死亡率提高到60%以上，而同樣條件下，dsRNA-殼聚糖納米復(fù)合物(CS-dsRNA) 的死亡率僅為35%。Lyu 等[98]將松香改性的PEG 與殼聚糖交聯(lián) (rosin-modified polyethylene glycol and chitosan，ROPE@C) (418 nm，+26.5 mV) 負載褐飛虱Nilaparvata lugens(Brown planthopper，BPH) 體內(nèi)幾丁質(zhì)合成酶基因A(Chitin synthetase A，CHSA) 的dsRNA (dsNlCHSA)，得到了dsNlCHSA/ROPE@C 納米遞送系統(tǒng) (圖3)。點滴法測定結(jié)果表明，dsNlCHSA/ROPE@C 可以使CHSA的相對表達量降低54.3%，BPH 的死亡率為65.8%。

圖3 dsRNA/ROPE@C/APG 納米遞送系統(tǒng)示意圖[98]Fig.3 Schematic diagram of dsRNA/ROPE@C/APG nano-formulation[98]

總的來說，CNPs 及其衍生物價格低廉、可生物降解、含量豐富、可大規(guī)模生產(chǎn)，是遞送核酸農(nóng)藥的理想材料之一。然而，CNPs 及其衍生物提高RNAi 效率的能力似乎是特異性的，因此在納入基于RNAi 的控制策略之前，需要對目標物種進行有效性測試[117]。

3.5.2.2 樹枝狀陽離子聚合物 樹枝狀陽離子聚合物是一類由重復(fù)單元組成超分支球狀結(jié)構(gòu)的陽離子聚合物。樹枝狀陽離子聚合物的內(nèi)部也有大量叔胺基，這些叔胺基可以在酸性細胞內(nèi)體中被質(zhì)子化，從而啟動“質(zhì)子海綿效應(yīng)”[63]。因此樹枝狀陽離子聚合物具有高負載率和高轉(zhuǎn)染效率的特點。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)沈杰團隊在該領(lǐng)域做了許多工作，他們構(gòu)建了一系列以酰亞胺衍生物為內(nèi)核的核殼結(jié)構(gòu)熒光陽離子納米顆粒 (fluorescent nanoparticles，F(xiàn)NPs)，作為dsRNA 遞送載體，表現(xiàn)出良好的靶標生物防治效果[99,118-120]。采用飼喂的方式，通過FNPs 遞送幾丁質(zhì)酶基因CHT10的dsRNA 可以顯著降低亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis的體重，并導(dǎo)致幼蟲脫皮缺陷和死亡[99]。為了更貼合實際應(yīng)用，該團隊后續(xù)開發(fā)了一種dsRNA/FNPs/表面活性劑的配方，只需要點滴在大豆蚜Aphis glycines4 齡幼蟲的背板處，即可在1h 內(nèi)穿透蚜蟲角質(zhì)層進入血腔，具有較高的基因沉默效應(yīng) (95.4%) 和良好的控制效果 (80.5%)[12]。然而，合成FNPs 的經(jīng)濟成本過高，這限制了其作為核酸農(nóng)藥遞送載體走向田間大規(guī)模應(yīng)用。基于此，該團隊設(shè)計了一種低成本、低細胞毒性、高基因轉(zhuǎn)染效果的星形陽離子聚合物 (SPc) 納米材料(100.5 nm，+20.9 mV) (圖4)[121]。該材料以商業(yè)化成本低廉的季戊四醇為原材料，不僅簡化了合成步驟，而且減少了有機溶劑的使用，在核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。Yang等[100]利用SPc 與可以抑制植物側(cè)根發(fā)育基因的雙鏈微小RNA (microRNA，miRNA) 組裝形成納米復(fù)合物 (253.6 nm ± 5.0 nm，+14.03 mV) ds-miRNA/SPc，處理擬南芥Arabidopsis thaliana幼苗后的表型與過表達miRNA 的轉(zhuǎn)基因擬南芥相似。Yan 等[11]將針對ATP 酶 (V-ATPaseD) 和幾丁質(zhì)合酶 (CHS1)基因的dsRNA/SPc 制劑 (沉默效率為86.86%～58.87%) 直接噴灑在大豆幼苗上，大豆蚜取食后其死亡率可達78.5%。最近的研究發(fā)現(xiàn)，采用CNP/SPc 復(fù)合物 (CNP/SPc complex，CSC) 作為dsRNA納米載體，以真核RNAi 機制的核心組件Argonaute蛋白 (AGO) 為靶基因，在水稻表面噴灑dsAGO/CSC復(fù)合物，能夠?qū)⑺救~片上立枯絲核菌Rhizoctonia solani的病變面積減少92%，且持效期長達20 d[101]。然而，最近Yan 等[122]研究表明，SPc 材料本身對模式生物黑腹果蠅具有生物毒性，除對成蟲具有急性毒性外，SPc 對新生幼蟲的壽命、生育能力、攀爬能力和抗逆性也產(chǎn)生了不利影響。

圖4 基于SPc 的核酸農(nóng)藥遞送系統(tǒng)用于害蟲防治[121]Fig.4 SPc as a highly efficient gene vector in pest management[121]

總的來說，SPc 材料作為核酸農(nóng)藥載體具有巨大的應(yīng)用潛力，但應(yīng)繼續(xù)優(yōu)化和開發(fā)新的配方，提高對非靶標生物的特異性，以降低環(huán)境安全與人類健康的風險[117]。

3.5.2.3 胍類聚合物 胍類聚合物 (guanidinecontaining polymers，GCPs) 是一類分子鏈中存在胍基基團的聚合物?？茖W(xué)研究表明，dsRNA/siRNA對堿性環(huán)境非常敏感，在強堿性環(huán)境下易被水解[53]，而鱗翅目害蟲的腸道微環(huán)境為堿性，pH 值甚至可以達到12.0，這可能是鱗翅目昆蟲RNAi技術(shù)的最大挑戰(zhàn)[123]。胍基是堿性最強的有機堿[124]，可以在高范圍堿性pH 環(huán)境中保持正電性，含有胍基的GCPs 可以與dsRNA/siRNA 結(jié)合并在強堿環(huán)境中保持穩(wěn)定。基于此，GCPs 材料或許可以為鱗翅目害蟲的RNAi 提供新的途徑。例如，Christiaens等[58]合成了一種含有胍基的陽離子聚甲基丙烯酸酯聚合物 (PAG87L)，研究表明，PAG87L 可以保護dsRNA 在甜菜夜蛾Spodoptera exigua腸液 (pH =11.0) 中避免降解超過30 h，而裸dsRNA 僅10 min就完全降解；以幾丁質(zhì)合酶B 基因 (ChSB) 為靶標基因，飼喂dsChSB/PAG8L7 復(fù)合物的甜菜夜蛾死亡率約為53.3%，飼喂對照裸dsChSB的死亡率僅為16.7%。Parsons 等[102]合成了另一種GCPs 材料——聚-N-(3-胍基丙基) 甲基丙烯酰胺 (poly-[N-(3-guanidinopropyl) methacrylamide]，PGPMA) 負載斜紋夜蛾CDC27基因的dsRNA，與Sf9 細胞體外孵育48 h 后，Sf9 細胞中該基因的mRNA 水平減少了92%。用dsCDC27/PGPMA 復(fù)合物連續(xù)飼喂斜紋夜蛾3 齡幼蟲7 d，29 d 后死亡率約為30%。

3.5.3 多肽納米材料 多肽是一類由多個氨基酸通過肽鍵共價連接的化合物?；谔烊欢嚯牡募{米載體通常具有安全無毒、可生物降解等特點，已成為核酸農(nóng)藥載體材料的研究熱點之一。

3.5.3.1 支鏈兩親性肽膠囊 支鏈兩親性肽膠囊(branched amphiphilic peptide capsules，BAPCs) 是由兩親性氨基酸自組裝成雙層分隔的超分子納米囊泡，具有與脂質(zhì)體類似但更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。Avila等[56]在赤擬谷盜和豌豆蚜的飼料中分別加入靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)信號通路基因 (BiP和Armet)的dsRNA/BAPCs 復(fù)合物，可以顯著抑制靶標基因的表達，從而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊，若同時飼喂BiP-dsRNA 和Armet-dsRNA 與BAPCs 的復(fù)合物可導(dǎo)致赤擬谷盜3 齡幼蟲75%的死亡率。此外，與單獨喂食裸BiP-dsRNA 相比，喂食BiP-dsRNA/BAPCs 復(fù)合物的豌豆蚜可提前6～9 d 死亡。該項研究表明，BAPCs 納米材料增強了口服dsRNA 的給藥效果并改善了RNAi 效應(yīng)。Wessel 等[125]最近的一項研究證明了BAPCs 可被一種常見的土壤真菌構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans降解，從而減少了這些納米顆粒對環(huán)境的潛在影響。目前，口服BAPCs 對其他害蟲中產(chǎn)生RNAi 效應(yīng)的潛力仍需進一步的研究證明[117]。

3.5.3.2 細胞膜穿透肽 細胞膜穿透肽 (cellmembrane penetrating peptides，CPPs) 是一種具有穿透生物膜系統(tǒng)功能的短肽的統(tǒng)稱。CPPs 可以作為siRNA、蛋白質(zhì)、附加肽和其他生物小分子的載體，增加細胞對dsRNA 的攝取并協(xié)助其在細胞內(nèi)的內(nèi)體逃逸[126-127]。在CPP 家族中，富含精氨酸的Tat 肽 (AYGRKKRRQRRR) 已被證明可以在昆蟲細胞中成功地內(nèi)化質(zhì)粒DNA 和激素[128-129]。肽蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 (peptide transduction domain，PTD) 是Tat 肽的一個改進型小分子多肽。該結(jié)構(gòu)域包括血凝素肽的脂質(zhì)融合特性，它可以在胞吞作用后破壞囊泡膜，將裝載的生物分子分散到細胞質(zhì)中[130]。通過將PTD 與dsRNA 結(jié)合域 (dsRNA binding domain，DRBD) 配對結(jié)合，可以形成核糖核蛋白顆粒 (ribonucleoprotein particles，RNPs) 來攜帶dsRNA 穿過細胞膜，逃離內(nèi)體，并誘導(dǎo)沉默[103]。Gillet 等[103]發(fā)現(xiàn)，RNPs 可以增強dsRNA在酸性條件下的耐受性和提高dsRNA 在Sf21 細胞中的體外轉(zhuǎn)染效率。飼喂棉鈴象甲Anthonomus grandis靶向幾丁質(zhì)合酶II (Ag-ChSII) 基因的RNPs可以降低Ag-ChSII基因80%的轉(zhuǎn)錄水平，顯著高于裸dsRNA 處理 (30%) (圖5)。該研究證明了CPPs遞送dsRNA 到昆蟲細胞的細胞質(zhì)方面的實用性，但目前未見有關(guān)CPPs 介導(dǎo)的核酸農(nóng)藥遞送系統(tǒng)在其他害蟲中應(yīng)用的報道。

圖5 dsRNA 與PTD-DRBD 聯(lián)合口服傳遞的機制模型[103]Fig.5 Model for the mechanism of oral delivery of dsRNA combined with PTD-DRBD[103]

3.5.4 碳基納米材料 碳基納米材料是指具有獨特結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的碳材料。已有研究表明，碳基納米材料在遞送核酸分子方面表現(xiàn)出良好的基因轉(zhuǎn)染效率，與商業(yè)脂質(zhì)體2000 相比具有較低的細胞毒性[131]。此外，碳基納米材料的合成成本廉價且技術(shù)成熟，易被多功能化修飾[132]。這些特性使得碳基納米材料成為一種新興的核酸傳遞工具，在核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。

3.5.4.1 碳納米管 碳納米管 (carbon nanotubes，CNTs) 是一種由碳原子組成的管狀中空納米材料，主要包括單壁碳納米管 (single wall carbon nanotubes，SWNTs) 和多壁碳納米管 (multiwalled carbon nanotubes，MWNTs)。由于其疏水性的特點，CNTs 的生物相容性較差，實際應(yīng)用中通常需要對其進行功能化或表面修飾。2009 年，CNTs首次被報道用作植物基因傳遞載體，該研究將氧化的SWNTs 與單鏈DNA 結(jié)合，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物可以在不使用基因槍的情況下穿透細胞壁和細胞膜[133]。雖然該研究證明了CNTs 可以遞送DNA 進入有壁細胞，但SWNTs 在植物細胞中的內(nèi)化機制尚未得到詳細研究。除了SWNTs 外，MWNTs 也被證明具有穿透植物細胞的能力。Serag 等[134]利用透射電鏡和共聚焦成像技術(shù)闡明了MWNTs 進入植物原生質(zhì)體的內(nèi)化機制，研究結(jié)果表明，植物原生質(zhì)體對MWNTs 的攝取是通過胞吞-內(nèi)體逃逸模式完成的。隨后的研究也報道了CNTs 攜帶其他核酸分子進入植物細胞的能力，例如質(zhì)粒DNA[135]、dsRNA[104]和siRNA[136]。Demirer 等[136]研究表明，SWNTs 介導(dǎo)的siRNA 傳遞可以在mRNA水平上達到95%的基因沉默效率，顯著減少核酸酶對siRNA 的降解作用。Edwards 等[104]采用聚酰胺樹狀分子 (PAMAM) 對CNTs 進行表面修飾得到PAMAM-CNTs 顆粒，相較于注射裸dsRNA，向赤擬谷盜幼蟲體內(nèi)注射PAMAM-CNTs-dsRNA復(fù)合物可以顯著提高對靶標基因的沉默效率；然而，注射高劑量的 PAMAM-CNTs 顆粒(200 μg/mL)在60 h 后對赤擬谷盜4 齡幼蟲產(chǎn)生了明顯的生物毒性。因此，對于未來的研究，需要對CNTs 本身的毒性和在生物體內(nèi)的降解進行長期評估，以充分證明CNTs作為核酸農(nóng)藥載體在農(nóng)業(yè)中的安全使用。

3.5.4.2 碳量子點 碳量子點也稱碳點 (carbon dots，CDs)，通常被定義為具有顯著熒光性能，粒徑小于10 nm 的球形碳顆粒，是一種新興的碳納米功能材料。CDs 具有可光致發(fā)光性、高分散性、低毒性、生物相容性、生物降解性、原材料來源廣泛和低成本等優(yōu)點，目前被廣泛應(yīng)用在生物成像、癌癥治療、光電子器件、催化、功能材料和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[137]。與CNTs 相似，運用CDs 遞送核酸分子時通常需要對其進行表面修飾。Schwartz等[105]采用PEI 修飾的CD 材料 (CD-PEI，～3.9 nm)裝載編碼鎂螯合酶 (一種植物葉綠素合成必需酶)兩個亞基 (CHLH和CHLI) 基因的siRNA，通過噴灑的方式處理模式生物本氏煙草Nicotiana benthamiana的葉面，發(fā)現(xiàn)siRNA/CD-PEI 復(fù)合物表現(xiàn)出良好的沉默效率，可以抑制CHLH基因79%的轉(zhuǎn)錄水平。Das 等[138]通過飼喂法評估了CNP、CDPEI 和胺功能化二氧化硅3 種納米材料遞送埃及伊蚊關(guān)鍵生長發(fā)育基因 (SNF7和SRC) dsRNA 后觸發(fā)的沉默效率，結(jié)果表明，CD-PEI 是保護和傳遞dsRNA 最有效的載體，具有更高的沉默效率和死亡率。最近，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉西莉團隊制備了一種聚乙二醇異丙烯酸酯 (poly (ethylene glycol)diamine，PEGDA) 修飾的CDs (CDs 平均粒徑為2.6 nm) (圖6)，裝載靶向卵菌保守并且是兩類殺菌劑靶標蛋白的纖維素合酶基因 (CesA3) 和氧化固醇結(jié)合蛋白基因 (OSBP1) 的dsRNA，生物活性測定發(fā)現(xiàn)，核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)CesA3-/OSBP1-dsRNA-CDs 對致病疫霉Phytophthora infestans、大豆疫霉Phytophthora sojae和辣椒疫霉Phytophthora capsici均表現(xiàn)出良好的防治效果[106]。此外，同時噴灑dsRNA-CDs 與作用靶標相同的化學(xué)殺菌劑，在保證防效的同時可以減少90%化學(xué)藥劑的使用，這對農(nóng)藥的減施增效具有重要意義[106]。

圖6 基于碳量子點遞送dsRNA 來控制植物疫霉菌的可噴灑核酸農(nóng)藥模型[106]Fig.6 Working model of SIGS dependent on carbon dot delivered dsRNAs to control Phytophthora diseases[106]

3.5.5 層狀雙氫氧化物 層狀雙氫氧化物 (layered double hydroxides，LDHs) 是一種類似天然水滑石的二維離子層狀納米顆粒，由帶正電荷的層板與層間陰離子組成。LDHs 的一般組成公式為[M2+(1-x)M3+x(OH)2]x+An-x/n·zH2O，其中M2+和M3+為二價和三價金屬離子，An-為層間電荷平衡陰離子。大量研究表明，LDHs 具有多用途特性，可以作為一種生物相容性、低毒性的基因和藥物載體[139]。LDHs 進入植物細胞的方式包括自由擴散和胞吞兩種[140]。由于存在植物細胞壁孔徑大小的限制，粒徑成為LDHs 納米顆粒在植物細胞中成功內(nèi)化的關(guān)鍵因素。例如，Yong 等[107]發(fā)現(xiàn)，在50～120 nm 的粒徑范圍內(nèi)，粒徑為50 nm 的LDH納米顆粒在番茄Solanum lycopersicum花粉細胞中表現(xiàn)出最快的內(nèi)化速率，遞送dsRNA 至轉(zhuǎn)基因番茄10512i 的花粉細胞中可以造成GUS (β-glucuronidase) 報告基因的mRNA 水平下降89%，顯著高于相同劑量的單獨dsRNA 處理 (37%)。

澳大利亞昆士蘭大學(xué)Neena Mitter 與許志平合作開發(fā)了一種基于LDHs 的RNA 農(nóng)藥噴霧制劑——LDH-dsRNA (BioClay)，以辣椒輕斑駁病毒和黃瓜花葉病毒 (cucumber mosaic virus，CMV) 特異性基因為靶基因，僅葉面噴灑一次BioClay 就可以為豇豆Vigna unguiculata提供長達20 d 的有效病毒防護，30 d 后仍可以檢測到葉片表面的dsRNA[25]。近年來，該團隊利用高通量RNAi 手段篩選到煙粉虱Bemisia tabaci的致死基因，葉面噴施BioClay 在煙粉虱整個生命階段 (卵、若蟲、成蟲) 都有良好的控制效果 (圖7)[24]。此外，LDH納米顆粒在濕潤的CO2環(huán)境下就可以降解，并且在哺乳動物中無毒性[25,139]。綜上所述，LDHs 納米材料在核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景，其在進入植物細胞后的系統(tǒng)保護機制仍需進一步研究。

圖7 葉面噴施BioClay 可防治整個生命階段煙粉虱 (卵、若蟲、成蟲) [24]Fig.7 Foliar-applied dsRNA-LDH (BioClay) provides safe and effective planta protection from whitefly eggs, nymphs, and adults[24]

4 核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的安全風險

農(nóng)藥的使用與食品安全和人類健康息息相關(guān)。核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)作為一項新技術(shù)，其在實際應(yīng)用中的安全性問題受到普遍關(guān)注。

RNAi 的脫靶效應(yīng)是核酸農(nóng)藥應(yīng)用中備受關(guān)注的問題，這種效應(yīng)可能是由于dsRNA 序列和脫靶基因的mRNA 序列之間存在足夠的相似性引起的[46,141]。對于確保核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)未來順利進入市場，解決可能出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)風險尤為重要。因此，在設(shè)計RNAi 靶序列時，應(yīng)該具有高度特異性，與脫靶轉(zhuǎn)錄本沒有同源性和序列相似性，以減少或避免脫靶效應(yīng)的發(fā)生。生物信息學(xué)工具和模型在設(shè)計RNAi 靶序列和預(yù)測潛在的脫靶效應(yīng)方面具有十分重要的作用。隨著眾多物種基因組數(shù)據(jù)庫的完善和各種生物信息學(xué)軟件模型的開發(fā)，使得精確搜索、預(yù)測和設(shè)計特異性的dsRNA/siRNA 成為可能。例如，果蠅RNAi 篩選中心數(shù)據(jù)庫 (http://www.flyrnai.org)、基因組RNAi數(shù)據(jù)庫 (http://www.genomernai.org)、dsCheck 在線設(shè)計軟件 (http://dscheck.rnai.jp)、Offtarget-Finder 在線工具 (https://www.specifly.org)、以及算法模型siRNA-Finder (https://github.com/snowformatics/siFi21)、pssRNAit SVM (https://www.zhaolab.org/pssRNAit) 和PFRED (https://github.com/pfred)。對于生物信息學(xué)預(yù)測設(shè)計的dsRNA/siRNA，仍需進一步對選定的試驗物種類群進行飼養(yǎng)試驗，以驗證脫靶效應(yīng)[142]。

納米載體因其“納米”特性可能會對環(huán)境安全和人類健康帶來新的威脅。例如，碳納米管具有致癌性，也會引起生殖和發(fā)育毒理學(xué)效應(yīng)，同時在環(huán)境中難以降解[143]。肌凝蛋白作為真核生物的關(guān)鍵組成部分，殼聚糖納米載體負載dsGFP或單獨使用均可以顯著抑制秀麗隱桿線蟲蟲體肌凝蛋白的表達[94]。SPc 納米載體自身對非靶標生物黑腹果蠅具有急性毒性，且對其初孵幼蟲的壽命、生育能力、攀爬能力和抗逆性均產(chǎn)生了不利影響[122]。因此，需要對納米載體材料進行嚴格的安全性評估，分析其潛在風險。

5 總結(jié)與展望

基于RNAi 技術(shù)的核酸農(nóng)藥在有害生物防治領(lǐng)域具有巨大的潛力，使用核酸農(nóng)藥控制病蟲害將為有害生物綜合治理增加新的維度。核酸農(nóng)藥目前已經(jīng)有產(chǎn)業(yè)化的案例。相對于轉(zhuǎn)基因植物核酸農(nóng)藥，可噴灑核酸農(nóng)藥不需要通過轉(zhuǎn)基因植物就可以提供針對有害生物的基因控制，因而更具吸引力，其商業(yè)化更易被接受。納米科技的發(fā)展為可噴灑核酸農(nóng)藥的發(fā)展提供了新的思路，各種具有特殊物化性質(zhì)和生物學(xué)功能的納米材料已成功應(yīng)用于核酸農(nóng)藥的遞送。基于納米材料為載體的核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)可以提高核酸農(nóng)藥在環(huán)境中的穩(wěn)定性和有效促進其在目標生物細胞內(nèi)的擴散、攝取和內(nèi)體逃逸，對于核酸農(nóng)藥的高效應(yīng)用和有害生物綠色防控具有重要意義。

然而，核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用仍受部分因素限制：

1) 靶標基因。如何獲得高效、特異致死的靶標基因dsRNA 序列是核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的首要因素[144]。理想的靶標基因可以利用低劑量的dsRNA 引起高效的RNAi 效應(yīng)，靶基因的篩選和挖掘是一項費時費力的工作，需要更多的研發(fā)投入。

2) 生產(chǎn)成本。開發(fā)一類合成簡單、價格低廉的納米載體以及研發(fā)一種可大量、低成本、高效合成dsRNA 的技術(shù)，是核酸農(nóng)藥走向田間大規(guī)模應(yīng)用的前提。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)沈杰研究團隊和美國RNAGri 公司在這方面已有創(chuàng)新性技術(shù)[121,145-146]，未來仍需繼續(xù)開發(fā)多元的技術(shù)手段，降低生產(chǎn)成本，促進核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的大規(guī)模生產(chǎn)。

3) 潛在環(huán)境、健康風險。目前基于納米材料遞送核酸農(nóng)藥的新型核酸遞送系統(tǒng)重點關(guān)注在納米遞送系統(tǒng)的制備、物理表征、生物活性等方面，缺乏關(guān)于潛在的脫靶效應(yīng)以及納米材料在環(huán)境中的命運以及沿食物鏈的潛在生物積累等信息。因此，必須對未來的研究建立一個可靠檢驗?zāi)Ｐ?，以確定在農(nóng)業(yè)中使用納米材料及核酸農(nóng)藥相關(guān)產(chǎn)品的風險。

近年來，隨著RNAi 醫(yī)藥研發(fā)的蓬勃發(fā)展和相關(guān)技術(shù)的不斷突破，基于RNAi 技術(shù)的核酸農(nóng)藥研發(fā)也進入了快速發(fā)展的時期[6]。核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)在核酸農(nóng)藥遞送領(lǐng)域展現(xiàn)出很多獨特的優(yōu)勢，特別是能夠?qū)sRNA 提供高效保護以及大幅提升核酸農(nóng)藥的RNAi 效率，關(guān)注和推動新型核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的研發(fā)將對我國綠色農(nóng)業(yè)和生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。此外，未來多學(xué)科的研究者應(yīng)加強交流合作，闡明植物和納米材料之間相互作用的問題，加強納米載體的生物安全性評估研究，優(yōu)化載體設(shè)計以減少潛在毒性，這對促進核酸農(nóng)藥納米遞送系統(tǒng)的大規(guī)模應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。