3種方法對(duì)曲霉菌鑒定結(jié)果對(duì)比研究*

張春華,胡明冬,蔣 敏,吳 倩

1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院健康管理科,重慶 400037;2.重慶新橋社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心,重慶 400037;3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶 400010

侵襲性肺曲霉病(IPA)是指由曲霉菌所致的肺部感染疾病。隨著器官移植廣泛開(kāi)展,免疫抑制劑和廣譜抗菌藥物的大量使用,使得IPA感染率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。IPA臨床癥狀不典型,與病毒性肺炎難以鑒別。對(duì)IPA的診斷,主要根據(jù)臨床表現(xiàn)、體征、影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)組織病理中發(fā)現(xiàn)45°角分枝的菌絲或曲霉頭為金標(biāo)準(zhǔn)[2]。而在實(shí)際工作中,對(duì)曲霉菌的鑒定形態(tài)學(xué)傳統(tǒng)手工法準(zhǔn)確率低且耗時(shí)長(zhǎng),特別是少見(jiàn)曲霉菌,需依賴經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)科工作人員。而基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)鑒定時(shí)間短,準(zhǔn)確率高,結(jié)合血清學(xué)方法,能極大提高曲霉病診斷的準(zhǔn)確率。本研究對(duì)2020年1月至2021年3月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢出的56株曲霉菌株,采用傳統(tǒng)手工法、分子測(cè)序、MALDI-TOF MS 3種鑒定方法進(jìn)行比較。由醫(yī)學(xué)真菌中心(南京皮膚病研究所)對(duì)菌株進(jìn)行分子測(cè)序,評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)手工法對(duì)曲霉菌的鑒定狀況。針對(duì)MALDI-TOF MS方法,探討適合于曲霉菌質(zhì)譜鑒定的最佳前處理方式,實(shí)現(xiàn)曲霉菌質(zhì)譜的快速鑒定,并建立一套適合實(shí)驗(yàn)室絲狀真菌鑒定標(biāo)準(zhǔn)操作流程。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2020年1月至2021年3月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院患者確診或臨床診斷為慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、中耳炎、腫瘤患者的菌株,同一患者多次分離出同一絲狀真菌以1株計(jì)算,共分離培養(yǎng)出曲霉菌56株,收集并保存菌種。其中肺泡灌洗液標(biāo)本分離出12株,痰液標(biāo)本分離出35株,纖支鏡刷取物標(biāo)本分離出3株,耳分泌物標(biāo)本分離出4株,鼻竇分泌物標(biāo)本分離出2株。

1.2儀器與試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA,OXID有限公司,培養(yǎng)基為粉劑,需配制成固體培養(yǎng)基),OMEGA FUNGAL DNA KIT1000(廣州飛揚(yáng)生化科技有限公司代理),PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó) BIO-RED S1000),DL2000 DNA Marker、2×TSINGKE Master Mix、通用引物β-tubulin(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司),Bruker BioTyper系統(tǒng)(德國(guó)Bruker公司),甲酸和乙腈溶液(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

1.3方法

1.3.1傳統(tǒng)手工法 按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》真菌培養(yǎng)鑒定程序進(jìn)行[3]。

1.3.2分子測(cè)序 提取模板DNA:按OMEGA FUNGAL DNA KIT1000試劑盒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作。目的基因擴(kuò)增:按照以上步驟提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增真菌ITS區(qū)域,本研究通用引物β-tubulinF:AATTGGTGGTGAAGATTTCTGG;R:AGTTGTCGGACGGAATAG[4]。PCR反應(yīng)總體積50 μL:DNA模板4 μL,引物各1 μL,2×TSINGKE Master Mix 12.5 μL,蒸餾水6.5 μL。PCR反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行,設(shè)置PCR反應(yīng)程序:95 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,共35個(gè)循環(huán),72 ℃保持延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送安徽通用生物系統(tǒng)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將每一株絲狀真菌的測(cè)序結(jié)果在Pubmed網(wǎng)站上通過(guò)BLAST檢索,與數(shù)據(jù)庫(kù)中條目進(jìn)行比對(duì),選擇同源性最大的結(jié)果作為分子測(cè)序鑒定的結(jié)果。

1.3.3MALDI-TOF MS鑒定 (1)甲酸乙腈萃取法[5-6]:用接種環(huán)刮取PDA培養(yǎng)3 d的菌落,挑取邊緣菌絲,加入300 μL純水+900 μL無(wú)水乙醇,以13 000 r/min震蕩離心2 min,棄去上清液,干燥。加入70%甲酸50 μL,4 000 r/min破壁震蕩20 s,重復(fù)兩次,放置5 min。加入乙腈50 μL,放置5 min。以13 000 r/min離心2 min,取上清液為真菌蛋白模板。(2)鋯珠碾磨甲酸乙腈萃取改良法:用接種環(huán)刮取PDA培養(yǎng)2 d的幼齡菌絲,挑入1 mL土豆肉湯中于搖床水平搖動(dòng)28°增菌24 h,形成肉眼細(xì)密菌落,加入兩粒鋯珠,余下操作同甲酸乙腈萃取法。見(jiàn)圖1。(3)取1 μL真菌蛋白點(diǎn)靶,自然干燥后覆蓋基質(zhì)1 μL,自然干燥后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。(4)鑒定評(píng)分:每株菌點(diǎn)靶兩次進(jìn)行鑒定,結(jié)果一致時(shí)的菌名和鑒定得分,將鑒定標(biāo)準(zhǔn)定為:鑒定到種得分≥2.0分;低于2.0分但所有鑒定結(jié)果前5位為同一種菌,得分在1.7～2.0分為鑒定到屬,低于1.7分或鑒定結(jié)果為多種菌為無(wú)鑒定結(jié)果。

注:A為水平振搖形成的細(xì)密菌落圖;B為垂直振搖的細(xì)密菌落圖;水平振搖獲得菌絲更為均勻和細(xì)致。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0和WHONET5.6軟件對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)匯總分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.156株曲霉菌采用3種方法進(jìn)行鑒定的結(jié)果比較 以分子鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),質(zhì)譜鑒定種屬52株,準(zhǔn)確率為92.9%(52/56),手工鑒定32株,準(zhǔn)確率為57.1%(32/56)。質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確率明顯高于手工鑒定(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 56株曲霉菌采用3種方法進(jìn)行鑒定的結(jié)果比較(n)

2.2兩種絲狀真菌蛋白提取法質(zhì)譜結(jié)果比較 56株曲霉菌采譜方式有兩種:一種為PDA固體培養(yǎng)72 h取菌絲,按照鋯珠碾磨甲酸乙腈萃取改良法提取蛋白液采譜,質(zhì)譜鑒定到曲霉菌種屬準(zhǔn)確率為73.2%(41/56);第二種為用PDA液體水平振搖24 h取菌絲采譜,再以鋯珠碾磨甲酸乙腈萃取獲得菌絲蛋白液,質(zhì)譜鑒定到曲霉菌種屬準(zhǔn)確率為92.9%(52/56)。兩種采譜方法比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。曲霉菌采用PDA液體水平振搖培養(yǎng)24 h取得的質(zhì)譜圖更優(yōu)。見(jiàn)表2。

表2 兩種絲狀真菌蛋白提取法質(zhì)譜結(jié)果比較(n)

2.3PDA培養(yǎng)天數(shù)對(duì)質(zhì)譜鑒定曲霉菌能力的影響 本研究選用PDA對(duì)56株曲霉菌株進(jìn)行培養(yǎng),并分別在2、3、5、7、9 d提取真菌蛋白,運(yùn)用BRUKER MALDI-TOF MS進(jìn)行采譜,PDA培養(yǎng)2 d質(zhì)譜鑒定到種的準(zhǔn)確率為25.0%,3 d為37.5%,5 d為33.9%,7 d為8.9%,9 d為1.7%。培養(yǎng)3、5 d質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率分別為73.2%(41/56)和75.0%(42/56),其質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率優(yōu)于培養(yǎng)2、7、9 d的質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 PDA培養(yǎng)天數(shù)對(duì)質(zhì)譜鑒定曲霉菌能力的影響(n)

3 討 論

在治療曲霉菌感染的患者時(shí),獲取準(zhǔn)確的病原菌信息至關(guān)重要,因?yàn)椴煌那咕鷮?duì)藥物的靈敏度不同,有的甚至存在天然耐藥。如大部分曲霉菌對(duì)兩性霉素B敏感,而土曲霉菌對(duì)兩性霉素B天然耐藥,黃曲霉菌可以出現(xiàn)獲得性耐藥[7-8]。因此指導(dǎo)臨床合理使用抗真菌藥物,必須準(zhǔn)確快速地鑒定曲霉菌到種。曲霉菌現(xiàn)有鑒定方法包括傳統(tǒng)手工法、分子測(cè)序、MALDI-TOF MS技術(shù)等。分子測(cè)序?yàn)榻z狀真菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn),但是它對(duì)操作人員技術(shù)要求高,操作復(fù)雜,費(fèi)用昂貴,不適合成為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的檢測(cè)方法[9];曲霉菌傳統(tǒng)手工法鑒定需要數(shù)天時(shí)間,對(duì)菌落的生長(zhǎng)速度、色素變化及鏡下菌絲和孢子結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,要求檢驗(yàn)人員有專業(yè)的技術(shù)和豐富的鑒定經(jīng)驗(yàn),易產(chǎn)生較大的人為誤差,本實(shí)驗(yàn)室對(duì)56株曲霉菌采用傳統(tǒng)手工法鑒定到種準(zhǔn)確率只能達(dá)到57.1%(32/56),與相關(guān)研究結(jié)果一致[10]。近年來(lái)MALDI-TOF MS技術(shù)已廣泛用于細(xì)菌的鑒定[10-11],操作簡(jiǎn)便、快速、高通量、且準(zhǔn)確性高,臨床應(yīng)用取得良好效果。

MALDI-TOF MS是臨床微生物病原菌鑒定的新型軟電離質(zhì)譜技術(shù),其通過(guò)檢測(cè)微生物蛋白質(zhì)指紋圖譜,根據(jù)不同菌種特有的質(zhì)譜峰與質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),進(jìn)而快速得出微生物鑒定結(jié)果,在細(xì)菌同源性分析、病原菌分型、毒力因子鑒定及耐藥檢測(cè)等方面表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)[12-13]。在真菌的快速鑒定中,近年張霄霄等[14]發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS技術(shù)可將酵母樣真菌的鑒定準(zhǔn)確率從傳統(tǒng)手工法的79.6%提高到95.1%。SLEIMAN等[15]結(jié)合德國(guó)布魯克MALDI-TOF MS絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(kù)和實(shí)驗(yàn)室自建18種曲霉菌譜圖,將曲霉菌種鑒定準(zhǔn)確率提高了24.0%,對(duì)傳統(tǒng)手工法僅鑒定到屬的曲霉菌株均實(shí)現(xiàn)了種鑒定。上述研究表明,MALDI-TOF-MS技術(shù)在臨床真菌鑒定中的作用日益顯著,然而質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用缺少實(shí)踐和經(jīng)驗(yàn)積累,尤其絲狀真菌結(jié)構(gòu)復(fù)雜,鑒定過(guò)程復(fù)雜,目前仍處于探索階段。本研究從臨床分離出56株曲霉菌,對(duì)比傳統(tǒng)手工法和MALDI-TOF MS技術(shù),結(jié)果顯示,以分子測(cè)序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定絲狀真菌到種的準(zhǔn)確率為92.9%,明顯高于傳統(tǒng)手工法鑒定的57.1%(P<0.05)。

在MALDI-TOF MS技術(shù)運(yùn)用中,布魯克公司絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(kù)基于液體法建立,認(rèn)為曲霉菌在液體培養(yǎng)法中采譜能得到更高鑒定準(zhǔn)確率。本研究首先比較了PDA液體培養(yǎng)水平和豎直兩種振搖方式得到的菌絲結(jié)果,發(fā)現(xiàn)水平振搖獲得菌絲更為均勻和細(xì)致;再比較了PDA固體培養(yǎng)72 h和PDA液體培養(yǎng)水平振搖24 h兩種方式,得到的菌絲質(zhì)譜鑒定到種屬的鑒定準(zhǔn)確率分別為73.2%和92.9%,兩種采譜方法比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),采用PDA液體水平振搖培養(yǎng)24 h取得的質(zhì)譜圖更優(yōu)。曲霉菌質(zhì)譜蛋白的提取法分為完整細(xì)胞法和細(xì)胞裂解法。甲酸萃取法為完整細(xì)胞法,郜珠研磨法屬于細(xì)胞裂解法,VITEK MS質(zhì)譜儀推薦的絲狀真菌質(zhì)譜分析前處理的蛋白質(zhì)提取方法為甲酸乙腈法[16]。宗來(lái)斌等[17]采用甲酸乙腈萃取法對(duì)47株曲霉菌進(jìn)行前處理后,質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率為79.8%;本研究采用郜珠研磨法加上甲酸乙腈萃取法,質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率達(dá)92.8%,且本法獲得的質(zhì)譜圖特征峰數(shù)量更多,強(qiáng)度更高。分析原因可能是:(1)提取過(guò)程中加入一定量郜珠,可與菌絲相互碰撞、剪切,使蛋白質(zhì)釋放更為充分,一定程度上提高了難破碎菌株的蛋白圖譜質(zhì)量與鑒定效果;(2)PDA水平振搖培養(yǎng)24 h得到的真菌絲的壁較薄且均勻,郜珠震蕩更容易破壁,因而甲酸乙腈萃取到的核酸蛋白更多。

絲狀真菌的胞壁堅(jiān)韌、難以破碎,常規(guī)方法難以獲得足量蛋白質(zhì)。影響真菌蛋白質(zhì)獲取的因素除提取方法外,還包括培養(yǎng)基選擇、提取蛋白時(shí)間等[18]。真菌常用的培養(yǎng)基有沙堡弱葡萄糖瓊脂(SDA)、察氏培養(yǎng)基(CA)和PDA。DE CAROLIS等[19]的研究表明不同培養(yǎng)基(SDA、MA或PDA)對(duì)MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果無(wú)影響。因此本研究選用PDA對(duì)56株曲霉菌進(jìn)行培養(yǎng),并分別在2、3、5、7、9 d提取真菌蛋白,運(yùn)用MALDI-TOF MS進(jìn)行采譜,結(jié)果培養(yǎng)3 d和5 d的質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率分別為73.2%和75.0%,優(yōu)于培養(yǎng)2、7、9 d的鑒定準(zhǔn)確率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此將PDA平板培養(yǎng)絲狀真菌提取蛋白時(shí)間定于3～5 d。

綜上所述,本著絲狀真菌鑒定準(zhǔn)確、快速和安全的原則,本研究摸索出一套適合本實(shí)驗(yàn)室的操作方法:呼吸道或耳鼻竇分泌物標(biāo)本培養(yǎng)3～5 d,期間發(fā)現(xiàn)曲霉菌菌落可以挑取菌絲于PDA液體培養(yǎng)基中水平振搖培養(yǎng)24 h,所得菌絲采取郜珠研磨,甲酸乙腈萃取蛋白,MALDI-TOF MS采譜鑒定。此方法操作簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果準(zhǔn)確且重復(fù)性好,完全可以滿足臨床需要,已在本實(shí)驗(yàn)室得以應(yīng)用,并適于在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中推廣。相信將來(lái)MALDI-TOF MS技術(shù)在各臨床實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛,并逐漸取代傳統(tǒng)手工形態(tài)學(xué)鑒定方法。