外周血miR-29b、miR-139水平與Th1/Th2的相關(guān)性及對(duì)銀屑病的診斷價(jià)值*

李媛媛,池麗俏,鐘文俊

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院皮膚科,上海 201799

銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病,最初被認(rèn)為是一種主要由表皮角質(zhì)形成細(xì)胞引起的疾病,現(xiàn)在被認(rèn)為是最常見(jiàn)的免疫介導(dǎo)性疾病[1]。其最常見(jiàn)的形式是鱗屑性紅斑或斑塊,與多基因遺傳控制有關(guān)[2]。銀屑病在任何年齡段均可發(fā)生,無(wú)性別差異,嚴(yán)重影響患者心理健康及生活質(zhì)量。目前相關(guān)研究認(rèn)為,腫瘤壞死因子-α、樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞都對(duì)銀屑病發(fā)病機(jī)制有重要作用[3-4]。其中輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)1/Th2細(xì)胞亞群表達(dá)與平衡失調(diào)是銀屑病發(fā)病機(jī)制研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。微小RNA(miRNA)是一種保守小分子非編碼RNA,有19～24個(gè)核苷酸,能夠調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,可通過(guò)各種形式的表觀遺傳修飾來(lái)參與不同免疫反應(yīng)和免疫疾病的發(fā)展[6]。研究表明,不少miRNA,如miR-155、miR-210、miR-20b均通過(guò)介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞免疫、Th1/Th2失調(diào)參與銀屑病發(fā)生發(fā)展過(guò)程[7]。但尚不清楚miR-29b、miR-139是否與銀屑病發(fā)病機(jī)制及Th1/Th2有關(guān)。因此,本研究初步探討外周血miR-29b、miR-139水平與銀屑病患者Th1/Th2的相關(guān)性及二者對(duì)銀屑病的診斷價(jià)值,旨在為銀屑病臨床診斷與治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年4月至2021年4月在本院入院治療的89例銀屑病患者為銀屑病組,其中男50例、女39例,年齡25～60歲,平均(34.67±4.95)歲,病程1～8年,平均(5.21±1.13)年。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)有典型銀屑病的皮疹表現(xiàn)且符合該病診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];(2)近期未接受過(guò)免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素治療;(3)患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)伴有其他皮膚炎癥性疾病者;(2)患有心血管疾病及肝腎功能障礙者;(3)合并免疫系統(tǒng)疾病及感染性疾病者;(4)凝血功能障礙者;(5)臨床一般資料不全者。根據(jù)銀屑病疾病分期將患者分為活動(dòng)期37例和靜止期52例,根據(jù)皮損嚴(yán)重程度[9]將銀屑病患者分為輕度組24例、中度組36例和重度組29例。另取同期來(lái)本院進(jìn)行體檢的體檢健康者60例作為對(duì)照組,其中男34例、女26例,年齡25～59歲,平均(35.01±4.98)歲。銀屑病組與對(duì)照組性別、年齡比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。該研究通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理編號(hào):2019-0427。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)外周血miR-29b、miR-139及T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(T-bet)、GATA結(jié)合蛋白3(GATA3)水平 采集所有研究對(duì)象入院后的外周血4 mL,加入抗凝劑。按照RNA提取試劑盒(無(wú)錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)操作說(shuō)明書,200 μL血清中加入700 μL Trizol試劑提取總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,采用PCR儀進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增,所涉及的PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系共25 μL:SYBR Green Master Mix(北京索萊寶科技有限公司)12.5 μL,cDNA(50 ng/μL)2 μL,PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,加ddH2O至25 μL。miR-29b、miR-139內(nèi)參基因?yàn)閁6,T-bet、GATA3內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-29b、miR-139、T-bet及GATA3的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Th1、Th2細(xì)胞比例 取加入抗凝劑的外周血,稀釋后加入刺激劑,一定條件下培養(yǎng)4 h,設(shè)置對(duì)照管與檢測(cè)管,分別加入CD3-PC5、CD8-FITC、干擾素(IFN)-γ-PE、白細(xì)胞介素(IL)-4-PE抗體。通過(guò)IFN-γ、IL-4陽(yáng)性表達(dá)率分析Th1/Th2淋巴細(xì)胞分布情況。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平 嚴(yán)格按照人IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)說(shuō)明書,采用酶標(biāo)儀(美谷分子儀器上海有限公司)檢測(cè)血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組miR-29b、miR-139、Th1/Th2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子水平比較 銀屑病組Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2及miR-139、T-bet、IL-2、IFN-γ水平均高于對(duì)照組(P<0.05),Th2細(xì)胞比例及miR-29b、GATA3、IL-4、IL-10均低于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 兩組miR-29b、miR-139、Th1/Th2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子水平比較

2.2不同病情患者miR-29b、miR-139、Th1/Th2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子水平比較 活動(dòng)期患者Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2及miR-139、T-bet、IL-2、IFN-γ水平高于靜止期患者(P<0.05),Th2細(xì)胞比例及miR-29b、GATA3、IL-4、IL-10水平低于靜止期患者(P<0.05);Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2及miR-139、T-bet、IL-2、IFN-γ水平隨著皮損嚴(yán)重程度增加呈上升趨勢(shì),Th2細(xì)胞比例及miR-29b、GATA3、IL-4、IL-10水平隨著皮損嚴(yán)重程度增加呈下降趨勢(shì),3組數(shù)據(jù)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3、4。

表3 不同疾病分期患者miR-29b、miR-139、Th1/Th2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子水平比較

表4 不同皮損嚴(yán)重程度患者miR-29b、miR-139、Th1/Th2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子水平比較

2.3銀屑病患者外周血miR-29b、miR-139水平與Th1/Th2、T-bet、GATA3的相關(guān)性 銀屑病患者外周血miR-139水平與Th1/Th2、T-bet呈正相關(guān)(P<0.05),與GATA3呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);miR-29b水平與Th1/Th2、T-bet呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與GATA3呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 銀屑病患者外周血miR-29b、miR-139水平與Th1/Th2、T-bet、GATA3的相關(guān)性

2.4外周血miR-139、miR-29b水平對(duì)重度銀屑病的診斷價(jià)值 外周血miR-139診斷重度銀屑病的AUC為0.781,靈敏度為68.97%,特異度為81.67%,最佳臨界值為7.51;miR-29b診斷重度銀屑病的AUC為0.851,靈敏度為89.66%,特異度為76.67%,最佳臨界值為0.44。聯(lián)合診斷的AUC為0.917,靈敏度為93.10%,特異度為81.64%,二者聯(lián)合診斷效能優(yōu)于miR-139、miR-29b單獨(dú)診斷(Z=2.882、1.993,P=0.004、0.043)。見(jiàn)圖1。

圖1 外周血miR-139、miR-29b水平診斷重度銀屑病的ROC曲線

3 討 論

銀屑病典型的表現(xiàn)是鱗屑性斑塊或紅斑,可累及全身癥狀,部分患者伴有關(guān)節(jié)炎、代謝綜合征、心血管疾病等,目前積極治療可改善皮損癥狀,避免并發(fā)癥發(fā)生,但無(wú)法達(dá)到避免復(fù)發(fā)[10]。已有研究證明,Th1/Th2平衡失調(diào)在尋常銀屑病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。但目前與Th1/Th2有關(guān)且參與銀屑病發(fā)病的生物標(biāo)志物極少,因此臨床上迫切需要尋找與Th1/Th2相關(guān)的標(biāo)志物揭示銀屑病的發(fā)病機(jī)制,為尋找避免銀屑病再次復(fù)發(fā)的治療方式提供參考依據(jù)。

miRNA參與多種信號(hào)通路的調(diào)控,與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的相關(guān)免疫反應(yīng)密切相關(guān),已有研究表明,許多miRNA可激活T淋巴細(xì)胞,通過(guò)調(diào)控Th1/Th2平衡介導(dǎo)銀屑病免疫應(yīng)答反應(yīng),參與銀屑病發(fā)生發(fā)展。馬媛媛等[12]發(fā)現(xiàn),miR-29b在哮喘患兒體內(nèi)低表達(dá),且與外周血Th1/Th2呈正相關(guān),可通過(guò)調(diào)控Th1/Th2比例失衡影響哮喘發(fā)生發(fā)展。有研究證明,miR-29b通過(guò)靶向誘導(dǎo)性刺激劑ICOS逆轉(zhuǎn)Th1/Th2細(xì)胞失衡,并減少卵清蛋白OVA誘導(dǎo)的鼠性哮喘中氣道嗜酸性粒細(xì)胞聚集[13]。相關(guān)報(bào)道稱,miR-29b在慢性阻塞性肺疾病中水平下降,相關(guān)炎癥水平及Th1/Th2升高,參與調(diào)節(jié)慢性阻塞性肺疾病病情進(jìn)展[14]。由此可見(jiàn),miR-29b在調(diào)節(jié)疾病發(fā)展過(guò)程中,與Th1/Th2表達(dá)紊亂密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,銀屑病組外周血miR-29b水平、Th2細(xì)胞比例低于對(duì)照組,處于活動(dòng)期的以上指標(biāo)水平低于靜止期,且隨著皮損嚴(yán)重程度增加呈降低趨勢(shì)。同時(shí)ROC曲線顯示,miR-29b對(duì)重度銀屑病具有一定的診斷價(jià)值。提示銀屑病患者T2細(xì)胞比例、miR-29b水平降低,參與銀屑病發(fā)生發(fā)展,有望成為診斷銀屑病的生物標(biāo)志物。相關(guān)報(bào)道顯示,miR-139水平在氣管灌注PM2.5的小鼠體內(nèi)升高,IL-4/IFN-γ傾向于Th1偏移,與Th1/Th2免疫失衡相關(guān)[15]。王坤等[16]發(fā)現(xiàn),miR-139在哮喘氣道炎癥小鼠體內(nèi)水平升高,與Th1/Th2呈正相關(guān)。因此,miR-139在調(diào)節(jié)疾病發(fā)展過(guò)程中,與Th1/Th2平衡失調(diào)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,銀屑病組外周血miR-139水平、Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2均高于對(duì)照組,處于活動(dòng)期的以上指標(biāo)水平高于靜止期,且隨著皮損嚴(yán)重程度增加呈上升趨勢(shì)。同時(shí)ROC曲線顯示,miR-139對(duì)重度銀屑病具有一定的診斷效能。提示,銀屑病患者miR-139、Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2水平升高,參與銀屑病發(fā)生發(fā)展,miR-139可作為生物標(biāo)志物用來(lái)診斷重度銀屑病。

T-bet是Th1的轉(zhuǎn)錄因子,選擇性的表達(dá)于Th1細(xì)胞,GATA3是Th2的轉(zhuǎn)錄因子,選擇性的表達(dá)于Th2細(xì)胞,促進(jìn)Th0向Th1、Th2分化[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn),銀屑病組外周血T-bet水平高于對(duì)照組,GATA3低于對(duì)照組,這與以上Th1、Th2細(xì)胞比例變化保持一致。相關(guān)研究表明,銀屑病是一種主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的疾病,其中先天免疫細(xì)胞和致病性T淋巴細(xì)胞的激活導(dǎo)致皮膚炎癥和角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖[19]。T淋巴細(xì)胞被激活后分化為CD4+亞群,Th1、Th2亞群由CD4+分化而來(lái),Th1、Th2屬于輔助性T淋巴細(xì)胞,具有完全不同的生物學(xué)功能[20]。Th1細(xì)胞成熟后可分泌IFN-γ、IL-2因子促進(jìn)細(xì)胞免疫,Th2細(xì)胞成熟后可分泌IL-4、IL-10因子,參與體液免疫[21]。本研究發(fā)現(xiàn),銀屑病組血清IFN-γ、IL-2水平高于對(duì)照組,處于活動(dòng)期的患者IFN-γ、IL-2水平高于靜止期,且隨著皮損嚴(yán)重程度增加呈上升趨勢(shì)。同時(shí),IL-4、IL-10水平低于對(duì)照組,處于活動(dòng)期的患者IL-4、IL-10水平低于靜止期,且隨著皮損嚴(yán)重程度增加呈下降趨勢(shì)。這說(shuō)明銀屑病患者體內(nèi)Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子的水平發(fā)生紊亂。另外,本研究還發(fā)現(xiàn),銀屑病患者外周血miR-139水平與Th1/Th2、T-bet呈正相關(guān),與GATA3呈負(fù)相關(guān);miR-29b水平與Th1/Th2、T-bet呈負(fù)相關(guān),與GATA3呈正相關(guān)。提示,miR-139、miR-29b在參與銀屑病發(fā)病過(guò)程中與Th1/Th2及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)。通過(guò)ROC曲線可知,miR-139、miR-29b聯(lián)合診斷重度銀屑病的效能優(yōu)于miR-139、miR-29b單獨(dú)診斷。

綜上所述,銀屑病患者外周血miR-139水平升高,miR-29b水平降低,參與銀屑病發(fā)生發(fā)展,且二者聯(lián)合診斷重度銀屑病具有較高效能。