上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因水平評(píng)估肝癌免疫治療療效的應(yīng)用價(jià)值*

韓 雪,李 帥,徐 蓉,馬文靜,黃國虹△

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2.腫瘤科,新疆烏魯木齊 830001;3.新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科,新疆烏魯木齊 830002

肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的致命性惡性腫瘤,肝細(xì)胞癌約占所有肝癌90%,具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn),中國是全球肝癌高負(fù)擔(dān)國家之一,患者確診時(shí)往往進(jìn)展為癌癥晚期,預(yù)后不良[1-3]。手術(shù)切除仍是治療早期肝細(xì)胞癌最有效的方法,但大多數(shù)患者在就診時(shí)已為晚期,無法切除,此外,由于手術(shù)切除后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率較高,患者預(yù)后仍不理想,早期識(shí)別可有效預(yù)測肝癌的生物標(biāo)志物對(duì)準(zhǔn)確評(píng)估患者預(yù)后具有重要意義[4-5]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)常發(fā)生在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的開始,是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的早期征象,表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞特征,轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂星忠u能力的間充質(zhì)表型,從而獲得遷移行為[6]。研究顯示,EMT可作為癌癥干預(yù)的潛在靶點(diǎn),并提供了初步抗腫瘤治療方向[7],但目前關(guān)于EMT相關(guān)基因評(píng)估預(yù)后的特征研究較少?；诖?本研究分析EMT相關(guān)基因水平在評(píng)估肝癌免疫治療效果方面的應(yīng)用價(jià)值,以便為臨床早期干預(yù)提供理論支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年1月至2021年1月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院行免疫治療的113例肝癌患者納入研究,納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理診斷符合原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者;(2)行手術(shù)切除治療者;(3)術(shù)后接受免疫治療者;(4)年齡18～75歲者;(5)預(yù)期生存期≥1年者;(6)臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并心、腦、腎等器官嚴(yán)重功能障礙者;(2)合并其他部位惡性腫瘤者;(3)合并自身免疫、血液系統(tǒng)疾病者;(4)對(duì)治療藥物過敏或不耐受者;(5)合并嚴(yán)重精神-神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙,不能配合者。所有患者及家屬均對(duì)本研究知情,并簽署知情同意書,本研究通過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(批號(hào):K20191218294)。經(jīng)過1年隨訪,共有6例患者失聯(lián),按脫落處理,最終納入患者107例。

1.2儀器與試劑 儀器:4 ℃離心機(jī)、移液槍、微量紫外分光光度儀、酶標(biāo)儀(主波長450 nm,參考波長630 nm),37 ℃孵育箱等。試劑:Trizol,三氯甲烷,E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)免疫組化試劑等,全部試劑均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3方法 采用電子病歷系統(tǒng)收集患者年齡、性別等一般臨床資料。于術(shù)中留取生長活躍且無出血、壞死的腫瘤組織,置于-70 ℃內(nèi)冰箱內(nèi)保存。采用Trizol一步法提取肝癌組織塊中的總RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA,取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)患者肝癌組織中Snail及Twist水平進(jìn)行檢測。留取部分腫瘤組織,采用PBS緩沖液清洗2～3遍后加入適量蛋白裂解液,充分研磨后提取組織中的蛋白質(zhì),采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定E-cadherin、N-cadherin水平。所有患者術(shù)后均給予免疫治療,并于患者出院后進(jìn)行為期1年的隨訪,前3個(gè)月每個(gè)月于門診隨診,后每3個(gè)月于門診隨診,在隨訪終點(diǎn)記錄患者是否出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及死亡等,并根據(jù)隨訪結(jié)果將患者分為預(yù)后良好組及預(yù)后不良組,比較兩組患者一般臨床資料及EMT相關(guān)基因水平,分析EMT相關(guān)基因水平在評(píng)估患者免疫治療預(yù)后方面的診斷價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者一般資料比較 隨訪結(jié)束,預(yù)后良好組75例,預(yù)后不良組32例。預(yù)后不良組患者腫瘤最大徑大于預(yù)后良好組(t=2.183,P=0.031),而兩組患者年齡、性別等一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表1。

表1 兩組患者一般資料比較或n(%)]

2.2EMT相關(guān)基因水平比較 預(yù)后良好組患者的Snail、Twist及N-cadherin水平低于預(yù)后不良組(均P<0.05),E-cadherin水平高于預(yù)后不良組(P=0.001),見表2。

表2 EMT相關(guān)基因水平比較

2.3影響患者預(yù)后危險(xiǎn)因素的Cox回歸分析 將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)帶入Cox回歸方程進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,Snail、Twist及N-cadherin水平是患者免疫治療效果不佳的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,E-cadherin水平則是獨(dú)立保護(hù)因素(均P<0.05),見表3。

表3 影響患者預(yù)后危險(xiǎn)因素的Cox回歸分析

2.4列線圖模型及校正曲線 列線圖模型顯示,隨著Snail、Twist、N-cadherin水平升高及E-cadherin水平降低列線圖模型評(píng)分隨之增加,隨著列線圖模型評(píng)分升高,患者免疫治療預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)升高,見圖1。列線圖模型預(yù)測患者免疫治療預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的C-index為0.923(95%CI0.876～0.943),區(qū)分度良好,經(jīng)內(nèi)部驗(yàn)證,獲得校正曲線,結(jié)果顯示列線圖模型預(yù)測患者免疫治療預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的絕對(duì)誤差為0.016,一致性良好,見圖2。

圖1 影響患者免疫治療效果的相關(guān)因素列線圖

圖2 影響患者免疫治療效果列線圖的校正曲線

2.5影響患者免疫治療效果不佳因素的預(yù)測價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示,Snail、Twist、E-cadherin、N-cadherin及4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測患者免疫治療效果不佳的曲線下面積(AUC)分別為0.701、0.758、0.651、0.742及0.879,4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測效能優(yōu)于各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測(Z=3.402,2.522,3.894,2.987,P<0.05)。見表4。

表4 影響患者免疫治療效果不佳因素的預(yù)測價(jià)值

3 討 論

肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)惡性程度最高的癌癥之一,因其具有高度異質(zhì)性及高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移率,導(dǎo)致肝細(xì)胞癌患者生存期較短,盡管外科和藥物治療已取得快速進(jìn)展,但肝細(xì)胞癌的死亡率仍居高不下[8]。近年來免疫檢查點(diǎn)抑制劑的引入極大地改變了包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的腫瘤治療方案[9-10]。但低免疫應(yīng)答率可嚴(yán)重影響免疫治療療效,故在免疫治療前對(duì)患者免疫應(yīng)答情況進(jìn)行評(píng)估,對(duì)免疫治療的選擇及方案制訂至關(guān)重要[11]。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展,越來越多的基因生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)是疾病診斷、治療評(píng)估及預(yù)后的關(guān)鍵調(diào)控因子[12-14]。

EMT在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及耐藥性中發(fā)揮關(guān)鍵作用,EMT期間,細(xì)胞失去細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的黏附,獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型,使得細(xì)胞從原發(fā)腫瘤分離[15],也有研究證實(shí)了EMT與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系[16],EMT參與胚胎發(fā)生和惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移,促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲并向遠(yuǎn)處組織擴(kuò)散,從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移,既往研究證實(shí)EMT參與了肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[17-18]。而癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致90%以上的癌癥相關(guān)死亡,在EMT過程中,上皮細(xì)胞失去極性并獲得侵襲性,成為間充質(zhì)干細(xì)胞[19]。Snail是著名的EMT激活轉(zhuǎn)錄因子,在腫瘤核組織、鄰近間質(zhì)和瘤周炎癥中高度表達(dá),可直接結(jié)合并抑制近端CDH1啟動(dòng)子上的E-cadherin,并重塑細(xì)胞間黏附,還可抑制其他上皮標(biāo)志物,并激活間充質(zhì)基因。此外,EMT還能重組上皮極性分子,阻礙基底膜形成,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲[20]。本研究結(jié)果顯示,對(duì)于免疫治療預(yù)后不良的患者,其體內(nèi)Snail水平升高,E-cadherin水平降低,提示肝癌可能發(fā)生轉(zhuǎn)移或進(jìn)一步惡化,對(duì)免疫治療應(yīng)答不良,從而導(dǎo)致患者預(yù)后欠佳。

E-cadherin主要表達(dá)于上皮細(xì)胞,E-cadherin丟失是EMT程序中最基本事件,通過Snail、Twist等EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子抑制E-cadherin等上皮樣細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá),同時(shí)上調(diào)N-cadherin等間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá),促進(jìn)EMT進(jìn)程,從而促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[21]。Snail在EMT中作為E-cadherin表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制因子,賦予腫瘤細(xì)胞癌癥干細(xì)胞樣特征,并促進(jìn)耐藥、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[19,22]。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,Snail表達(dá)對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞中Zeb1的誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)移播散至關(guān)重要,而Twist則是其他EMT轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)所必需的,可誘導(dǎo)部分EMT和轉(zhuǎn)移[23]。本研究結(jié)果顯示,Snail、Twist、N-cadherin為患者免疫治療預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,E-cadherin為獨(dú)立保護(hù)因素,提示對(duì)于免疫治療療效不佳的患者,其腫瘤細(xì)胞可能發(fā)生EMT改變,而EMT相關(guān)基因高表達(dá)的患者,對(duì)免疫治療不敏感,預(yù)后不良。這與CHANG等[24]對(duì)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后分析一致,CHANG等[24]研究表明,E-cadherin低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后不良有關(guān),可用于預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后。此外,MASUDA等[25]對(duì)乳腺癌患者血液中的N-cadherin的mRNA水平進(jìn)行分析,結(jié)果顯示N-cadherin可作為預(yù)測乳腺癌患者轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的新型預(yù)后生物標(biāo)志物。盡管針對(duì)上述指標(biāo)研究的腫瘤患者群體不盡相同,但對(duì)腫瘤的預(yù)測、分析結(jié)果卻大同小異,提示Snail、Twist、N-cadherin及E-cadherin在預(yù)測腫瘤患者預(yù)后、治療療效方面具有一致性。

此外,本研究基于上述指標(biāo)繪制ROC曲線,結(jié)果顯示,Snail、Twist、N-cadherin及E-cadherin聯(lián)合預(yù)測患者免疫治療效果不佳的預(yù)測效能優(yōu)于各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測,能對(duì)患者免疫治療的療效進(jìn)行有效預(yù)測,對(duì)于免疫應(yīng)答率低的患者應(yīng)考慮給予其他干預(yù)以改善患者預(yù)后。列線圖模型結(jié)果顯示,根據(jù)Snail、Twist、N-cadherin及E-cadherin構(gòu)建的預(yù)測模型具有較好的C-index,并與實(shí)際發(fā)生的相關(guān)性較好,經(jīng)內(nèi)部驗(yàn)證的校正曲線也表明列線圖模型可有效預(yù)測患者免疫治療療效,具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述,免疫治療療效不佳的患者其Snail、Twist、N-cadherin水平升高,而E-cadherin水平降低,4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合可有效預(yù)測患者對(duì)免疫治療的敏感性。但本研究仍存在一定不足,受限于納入樣本量,導(dǎo)致分析因素較少,且并未對(duì)患者進(jìn)行長期隨訪,亦未對(duì)患者生存期及無進(jìn)展生存期變化作進(jìn)一步探究。故應(yīng)進(jìn)一步行多中心、大樣本、前瞻性臨床試驗(yàn),以便對(duì)患者免疫應(yīng)答情況進(jìn)行預(yù)測,積極給予其他干預(yù),以延長患者生存期,改善患者預(yù)后。