血清ADA、IL-10及TLR9與EBV相關(guān)傳染性單核細胞增多癥患兒EBV-DNA載量的相關(guān)性*

李 萍,安莉莉,韓 冰

日照市婦幼保健院兒科,山東日照 276800

傳染性單核細胞增多癥(IM)是一種單核-巨噬細胞系統(tǒng)急性增生性疾病,多由EB病毒(EBV)、支原體、腺病毒、巨細胞病毒等諸多病原菌感染所致[1-2]。其中EBV屬于嗜B淋巴細胞DNA病毒,EBV進入宿主體內(nèi)后多附著于B淋巴細胞,是引起IM最主要的病原體之一[3]。EBV相關(guān)IM患兒典型癥狀為頸淋巴結(jié)腫大、發(fā)熱、咽峽炎三聯(lián)征,多發(fā)于學(xué)齡前與學(xué)齡期兒童。本病多呈良性、自限性,雖大部分預(yù)后良好,但仍有少數(shù)患兒會伴有噬血綜合征、周圍神經(jīng)炎、肝損傷等嚴重并發(fā)癥,加之因部分患兒早期無特異性血液學(xué)表現(xiàn),常與其他感染性疾病混淆[4]。因此,積極探討一種靈敏度高、特異度高的血清生物學(xué)標(biāo)志物,在早期識別EBV相關(guān)IM的高危人群、評估病情程度中尤為關(guān)鍵。EBV抗體檢測是臨床診斷IM的主要方式,但存在反應(yīng)弱等不足。研究發(fā)現(xiàn),多種抗原提呈細胞(如樹突狀細胞、單核細胞等)表面的Toll樣受體(TLRs)于EBV感染早期可識別病毒蛋白,TLRs是機體免疫應(yīng)答的主要啟動因子[5-6]。而免疫失調(diào)與炎癥反應(yīng)協(xié)同作用可能是促使EBV從潛伏狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋碃顟B(tài),致使IM患者預(yù)后不良的重要原因[7]?；诖?本研究分析血清腺苷脫氨酶(ADA)、白細胞介素(IL)-10、Toll樣受體9(TLR9)水平與EBV相關(guān)IM患兒EBV-DNA載量的相關(guān)性,旨在為EBV相關(guān)IM的臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 前瞻性選擇2021年2月至2022年12月就診于本院的98例EBV相關(guān)IM患兒作為IM組,其中男55例,女43例;年齡1～10歲,平均(4.02±1.53)歲;體重指數(shù)(20.85±1.32)kg/m2。另選同期于本院體檢的50例健康兒童(近6個月未發(fā)生病毒感染)作為對照組,其中男27例,女23例;年齡1～10歲,平均(4.18±1.65)歲;體重指數(shù)(20.57±1.28)kg/m2。IM組、對照組上述資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),有可比性。本研究已獲院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(20210013)。

1.2IM組入選標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):符合EBV相關(guān)IM診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];EBV特異性抗體陽性;發(fā)病時間<1周;初診;入組前未接受免疫抑制劑、抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素等治療;患兒家屬自愿簽署知情同意書。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):因支原體、腺病毒、巨細胞病毒等其他病原菌誘發(fā)的IM;合并扁桃體炎、肺炎等其他類型感染;生長緩慢且發(fā)育異常;伴有器質(zhì)性損傷、血液系統(tǒng)疾病、遺傳性疾病;先天畸形。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集與處理 采集對照組體檢當(dāng)日、IM組入院24 h內(nèi)的空腹靜脈血3 mL,注入離心管,置入SCILOGEX SCI506型低速離心機(蘇州瑞諾德生物科技有限公司)上離心15 min,溫度為4 ℃,轉(zhuǎn)速為3 000 r/min,離心半徑為10 cm,取血清置于Thermo Scientific HERAfreezeTM-80 ℃超低溫冰箱(上海輔澤商貿(mào)有限公司)中待測。

1.3.2血清ADA、IL-10、TLR9水平檢測 從冰箱中取出血清標(biāo)本,室溫下解凍,取血清標(biāo)本放置AU640型全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司),利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(試劑盒購自上海羽哚生物科技有限公司,貨號:YDLC-4577)測定血清IL-10、TLR9水平,采用酶比色法(試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司,貨號:SNM220-NDR)測定ADA水平。

1.3.3EBV-DNA載量 利用cobas z480型全自動熒光定量PCR分析儀(瑞士羅氏公司)與配套試劑盒測定血清中EBV-DNA載量,反應(yīng)總體系為20 μL,擴增條件:93 ℃ 2 min,93 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,共30個循環(huán),EBV-DNA>500 copy/mL則為EBV-DNA陽性。參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9]將IM組患兒分為低載量組(<6 000 copy/mL,18例)、低-中載量組(6 000～<30 000 copy/mL,25例)、中-高載量組(30 000～<300 000 copy/mL,49例)、高載量組(≥300 000 copy/mL,6例)4個亞組。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清ADA、IL-10及TLR9水平比較 與對照組比較,IM組血清ADA、IL-10、TLR9水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清ADA、IL-10及TLR9水平比較

2.2血清ADA、IL-10及TLR9水平與IM發(fā)生的關(guān)系 線性回歸分析結(jié)果顯示,ADA、IL-10、TLR9水平均與EBV相關(guān)IM的發(fā)生有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 血清ADA、IL-10及TLR9水平與IM發(fā)生的關(guān)系

2.3血清ADA、IL-10、TLR9水平單獨及聯(lián)合預(yù)測EBV相關(guān)IM發(fā)生的價值 將IM發(fā)生狀態(tài)(0為發(fā)生,1為未發(fā)生)作為狀態(tài)變量,將血清ADA、IL-10、TLR9水平作為檢驗變量,ROC曲線結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清ADA、IL-10、TLR9水平單獨及聯(lián)合預(yù)測EBV相關(guān)IM發(fā)生的曲線下面積(AUC)為0.850(95%CI0.791～0.910)、0.867(95%CI0.811～0.924)、0.891(95%CI0.840～0.943)、0.912(95%CI0.843～0.956)。見表3。

表3 血清ADA、IL-10、TLR9水平及聯(lián)合預(yù)測EBV相關(guān)IM發(fā)生的價值

2.4IM組不同EBV-DNA載量患兒血清ADA、IL-10、TLR9水平比較 血清ADA、IL-10、TLR9水平及EBV-DNA載量從高到低為高載量組、中-高載量組、低-中載量組、低載量組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 IM組不同EBV-DNA載量患兒血清ADA、IL-10、TLR9水平比較

2.5血清ADA、IL-10、TLR9水平與EBV相關(guān)IM患兒EBV-DNA載量的相關(guān)性分析 Spearman等級相關(guān)結(jié)果顯示,血清ADA、IL-10、TLR9水平與EBV相關(guān)IM患兒EBV-DNA載量呈正相關(guān)(r>0,P<0.05)。見表5。

表5 血清ADA、IL-10、TLR9水平與EBV相關(guān)IM患兒EBV-DNA載量的相關(guān)性分析

3 討 論

EBV-DNA是來自于淋巴細胞中釋放的病毒顆粒,EBV-DNA載量可動態(tài)反映機體感染EBV后的病毒水平,故常用于原發(fā)性IM的早期診斷中。但研究發(fā)現(xiàn),雖部分患兒從發(fā)病第2周后開始出現(xiàn)EBV-DNA轉(zhuǎn)陰,但仍有小部分患兒從發(fā)病至痊愈一直呈陰性,存在一定的漏檢率,故臨床仍需聯(lián)合其他指標(biāo)進行診斷[10]。

現(xiàn)有研究認為,EBV進入機體后與B淋巴細胞表面受體CD21結(jié)合感染成熟B淋巴細胞,并在B淋巴細胞中建立終生潛伏感染,激活自然殺傷細胞與樹突狀細胞,進一步促進EBV增殖與細胞轉(zhuǎn)化[11-12]。且機體在受到免疫刺激、免疫抑制或慢性炎癥等因素刺激時,潛伏于B淋巴細胞中的EBV被重新活化并大量傳播、繁殖[13]。由此可見,免疫機制與EBV所致的相關(guān)疾病有關(guān),而諸多與免疫機制相關(guān)的免疫因子、炎癥因子可能在EBV相關(guān)IM發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。B淋巴細胞表面的潛伏膜蛋白LMP1是TLR9轉(zhuǎn)錄的強抑制劑,EBV-DNA基序可激活TLR9,而漿樹突細胞可通過TLR9分子識別EBV顆粒中的線性病毒DNA。因此,干擾漿樹突細胞TLR9信號通路可通過抑制TLR9啟動子活化,活化自然殺傷細胞,抑制TLR介導(dǎo)的核因子-κB信號通路活化等途徑,從而削弱機體固有免疫反應(yīng),促進EBV病毒長期生存[14]。VALENTE等[15]研究發(fā)現(xiàn),TLR9表達上調(diào)可促進干擾素調(diào)節(jié)因子7產(chǎn)生,刺激EB病毒潛伏膜蛋白1基因表達,從而促進病情進展。NOOR等[16]研究報道,TLR9主要表達于B淋巴細胞表面,EBV感染激活淋巴細胞上TLR9表達,并借助細胞因子逃避宿主的免疫殺傷作用。IL-10屬于一種抗炎因子,可抑制健康者樹突狀細胞的生長速度及向成熟活化的樹突狀細胞轉(zhuǎn)化,誘導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞對抗原產(chǎn)生耐受,限制機體對抗原的過度免疫反應(yīng),從而保護機體免受免疫損傷。目前已有研究證實,IL-10基因多態(tài)性與兒童EBV感染易感性、肝功能損傷有關(guān)[17-18],但關(guān)于EBV相關(guān)IM患兒血清IL-10表達及意義的報道較少。本研究中,IM組血清TLR9、IL-10水平比對照組高,TLR9、IL-10水平均與EBV相關(guān)IM患兒EBV-DNA載量呈正相關(guān),與SKOVBJERG等[19]研究結(jié)果相似,進一步證實TLR9、IL-10水平與EBV相關(guān)IM的發(fā)生,病情程度有關(guān),推測原因可能在于:(1)EBV感染可通過TLRs信號通路誘導(dǎo)機體炎癥反應(yīng),使機體識別抗原,激活免疫反應(yīng),并協(xié)助EBV的免疫逃逸,降低機體抗病毒能力;(2)TLRs可識別EBV膜蛋白,并將信號傳遞至細胞內(nèi)各類接頭分子,刺激自然殺傷細胞活化,并經(jīng)諸多途徑來刺激下游炎癥因子釋放,從而啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答。線性回歸分析結(jié)果顯示,TLR9、IL-10水平與EBV相關(guān)IM的發(fā)生有關(guān)(t=3.875、2.210),且進一步繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn),血清TLR9、IL-10水平預(yù)測EBV相關(guān)IM發(fā)生的AUC為0.891、0.867,當(dāng)TLR9、IL-10最佳臨界值分別取2.987 ng/mL、10.521 pg/mL時,其診斷效能最高,提示臨床應(yīng)高度警惕血清TLR9、IL-10水平異常升高的EBV患兒,并采取針對性治療措施,以預(yù)防IM的發(fā)生。

ADA是核酸代謝期間的關(guān)鍵酶,主要存在于淋巴細胞、胸腺、脾等組織中,不僅參與嘌呤核苷代謝過程,且與細胞免疫活性及淋巴細胞增殖密切相關(guān)。沈偉等[20]研究報道,血清ADA活性變化與異型淋巴細胞有關(guān),EBV相關(guān)IM患兒異型淋巴細胞水平上升會釋放大量ADA。SHI等[21]在一項回顧性、大樣本量研究中共收集6 868例患兒的臨床資料,多因素Logistic回歸分析顯示,EBV感染是導(dǎo)致血清ADA水平升高的危險因素(OR=8.486,95%CI6.753～10.663),且ADA水平與EBV-ADA載量呈正相關(guān)(r=0.501)。本研究發(fā)現(xiàn),IM組血清ADA呈高表達,且血清ADA水平與EBV-ADA載量呈正相關(guān),與上述研究結(jié)果報道一致,推測原因可能在于:(1)細胞毒性T淋巴細胞靶向攻擊受感染的B淋巴細胞,進一步損傷B淋巴細胞功能,從而致使大量ADA被釋放入血;(2)EBV感染后會啟動T淋巴細胞對病毒抗原刺激的細胞免疫應(yīng)答,激活單核巨噬細胞與淋巴細胞,造成淋巴細胞中ADA水平升高;(3)此外,EBV入侵血液系統(tǒng)后會形成病毒血癥,并與自然殺傷細胞、B淋巴細胞及T淋巴細胞的EBV受體結(jié)合,激活T淋巴細胞并使其變形,從而產(chǎn)生異型淋巴細胞。而異型淋巴細胞凋亡后會促使大量ADA被釋放,形成惡性循環(huán)。進一步繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn),血清ADA、IL-10、TLR9水平單獨及聯(lián)合預(yù)測EBV相關(guān)IM發(fā)生的AUC為0.850、0.867、0.891、0.912,提示針對臨床特征不典型,但血清ADA、IL-10、TLR9水平升高的EBV感染患兒,其罹患IM的風(fēng)險較高。

綜上所述,EBV相關(guān)IM患兒血清ADA、IL-10及TLR9水平異常升高,上述指標(biāo)水平與EBV-DNA載量密切相關(guān),且三者聯(lián)合可有效預(yù)測EBV相關(guān)IM的發(fā)生。