SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑性能驗(yàn)證

李欽麗,張繼偉

1.武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北武漢 430040;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院病理科,湖北武漢 430022

結(jié)直腸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率呈逐年遞增的趨勢(shì)[1-2]。結(jié)直腸癌的早診篩查可以有效地降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率[3]。目前結(jié)直腸癌早期篩查技術(shù)主要包括結(jié)腸鏡檢查、糞便免疫化學(xué)測(cè)試(FIT)和多靶點(diǎn)糞便DNA檢測(cè)等,其中結(jié)腸鏡檢查是結(jié)直腸癌篩查的金標(biāo)準(zhǔn),但由于檢查具有侵入性且需要充分的腸道準(zhǔn)備,從而限制了該方法的普遍應(yīng)用。其他無(wú)創(chuàng)篩查方法如多靶點(diǎn)糞便DNA檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌及進(jìn)展期腺瘤的靈敏度均高于FIT,在臨床上顯示出較好的應(yīng)用潛力[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)黏結(jié)蛋白聚糖2(SDC2)和組織因子途徑抑制劑2(TFPI2)基因在結(jié)直腸癌組織中呈現(xiàn)出高度甲基化,將SDC2和TFPI2基因甲基化水平作為結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物,基于SDC2和TFPI2基因的糞便DNA檢測(cè)可以更靈敏、特異的檢測(cè)出結(jié)直腸癌[6-7]。

根據(jù)中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明:CNAS-CL02-A009》[8]文件的相關(guān)要求,臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展新的分子檢測(cè)項(xiàng)目時(shí)必須對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證,以保證分子檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)流程的可靠性及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究參照CNAS發(fā)布并實(shí)施的《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南:CNAS-GL039》[9]對(duì)SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)分別進(jìn)行方法符合率、檢出限、精密度和抗干擾能力的性能驗(yàn)證,以期為各檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展新的分子檢測(cè)項(xiàng)目制訂性能驗(yàn)證方案時(shí)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 選取武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院的30例糞便標(biāo)本(結(jié)直腸癌標(biāo)本25例和非結(jié)直腸癌標(biāo)本5例),3份含1%甲基化目的基因的檢測(cè)限參考品(核酸濃度為10 000 copy/mL)來(lái)自于武漢艾米森生命科技有限公司。

1.2儀器與試劑 SLAN-96P全自動(dòng)熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司),SDC2 和 TFPI2 基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法,武漢艾米森生命科技有限公司),核酸提取試劑和核酸純化試劑(武漢艾米森生命科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1糞便標(biāo)本DNA提取和純化 根據(jù)DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟要求提取糞便標(biāo)本的DNA,按照核酸純化試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化。

1.3.2熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè) 按照SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系25 μL,包括14 μL 反應(yīng)液Ⅰ(buffer和dNTP),5.7 μL PCR 反應(yīng)液Ⅱ(引物和探針),0.3 μL熱啟動(dòng)Taq酶,陰性對(duì)照NC、標(biāo)本核酸轉(zhuǎn)化液、陽(yáng)性對(duì)照PC各5 μL。加樣后,確定蓋好管蓋或封膜后,短暫離心30 s(避免有氣泡,如果有氣泡,用手指輕彈,重新瞬時(shí)離心),立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min,1個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán),60 ℃時(shí)收集ROX、FAM和VIC信號(hào)。

1.3.3結(jié)果判讀 按照SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行結(jié)果判讀:甲基化的SDC2基因DNA片段(ROX信號(hào)通道)和TFPI2基因DNA片段(FAM信號(hào)通道)及內(nèi)控基因ACTB(VIC信號(hào)通道)。ACTB基因即為β-actin,是常用管家基因,用于評(píng)估檢測(cè)中標(biāo)本DNA水平和質(zhì)量,避免由于標(biāo)本DNA水平和質(zhì)量的問(wèn)題導(dǎo)致假陰性結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照ROX、FAM和VIC通道均應(yīng)有擴(kuò)增曲線升起,并且循環(huán)閾值(Ct值)在26～30;陰性對(duì)照ROX、FAM和VIC通道均應(yīng)無(wú)擴(kuò)增曲線升起或Ct值>40;待測(cè)標(biāo)本在VIC通道有擴(kuò)增曲線升起且Ct值≤36的條件下,如果ROX和(或)FAM通道有擴(kuò)增曲線升起且Ct值≤38,則判斷標(biāo)本甲基化陽(yáng)性,如果ROX和FAM通道均無(wú)擴(kuò)增曲線升起或Ct值>38,則判斷標(biāo)本甲基化陰性。

1.3.4方法符合率 采用腸鏡檢查和(或)與病理診斷結(jié)果結(jié)合的金標(biāo)準(zhǔn)方法為對(duì)照方法,用候選方法檢測(cè)30例糞便標(biāo)本,其中包括結(jié)直腸癌標(biāo)本25例和非結(jié)直腸癌標(biāo)本5例。

1.3.5檢出限 通過(guò)對(duì)3份含1%甲基化目的基因的檢測(cè)限參考品L1、L2和L3使用本檢測(cè)試劑重復(fù)檢測(cè)3次。L1為含1%甲基化TFPI2基因的參考品,L2為同時(shí)含1%甲基化SDC2和1%甲基化TFPI2基因的參考品,L3為含1%甲基化SDC2基因的參考品。所有參考品均為用甲基化目的基因質(zhì)粒與從組織細(xì)胞內(nèi)提取的基因組核酸,按照一定比例混合,最終得到含1%甲基化目的基因參考品。

1.3.6精密度 取1份陽(yáng)性參考品,分5批次,每天檢測(cè)一批次,每批次重復(fù)檢測(cè)5次,記錄結(jié)果。最后計(jì)算批內(nèi)和批間Ct值的變異系數(shù)(CV),CV≤5%為合格。

1.3.7抗干擾能力 選取2例陽(yáng)性糞便標(biāo)本和1例陰性糞便標(biāo)本,按照試劑廠商提供的每1 mL糞便標(biāo)本加入6 μL的比例最高抗干擾水平,分別加入干擾物質(zhì)新鮮乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血/甘油,每例標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)3次。

2 結(jié) 果

2.1方法符合率驗(yàn)證結(jié)果 收集的30例標(biāo)本中,陽(yáng)性標(biāo)本與腸鏡檢查和(或)病理診斷結(jié)果符合率為96.0%,陰性標(biāo)本符合率為100.0%,總符合率為96.7%,驗(yàn)證通過(guò)。見(jiàn)表1。

表1 方法符合率結(jié)果比對(duì)(n)

2.2檢出限驗(yàn)證結(jié)果 含1%甲基化目的基因濃度為10 000 copy/mL的檢測(cè)限參考品L1的TFPI2 3次重復(fù)檢測(cè)Ct值均≤38;參考品L2的SDC2和TFPI2 3次重復(fù)檢測(cè)Ct值均≤38;參考品L3的SDC2 3次重復(fù)檢測(cè)Ct值均≤38,3個(gè)檢測(cè)限參考品均為陽(yáng)性,驗(yàn)證通過(guò)。見(jiàn)圖1。

注:A為參考品L1 TFPI2基因(藍(lán)色),ACTB基因(綠色);B為參考品L2 TFPI2基因(藍(lán)色),SDC2基因(黃色),ACTB基因(綠色);C為參考品L3 SDC2基因(黃色),ACTB基因(綠色)。

2.3精密度驗(yàn)證結(jié)果 1份陽(yáng)性精密度參考品檢測(cè)的批內(nèi)、批間精密度CV均≤5%,驗(yàn)證通過(guò)。見(jiàn)表2、3。

表2 批內(nèi)精密度驗(yàn)證結(jié)果(Ct值)

2.4抗干擾能力驗(yàn)證結(jié)果 通過(guò)對(duì)3例加入干擾物質(zhì)的有效糞便標(biāo)本(其中2例陽(yáng)性,1例陰性),重復(fù)檢測(cè)3次,干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)明顯影響,驗(yàn)證通過(guò)。見(jiàn)圖2。

注:A為陽(yáng)性標(biāo)本1 TFPI2基因(藍(lán)色),SDC2基因(黃色),ACTB基因(綠色);B為陽(yáng)性標(biāo)本2 SDC2基因(黃色),ACTB基因(綠色);C為陰性標(biāo)本3 ACTB基因(綠色)。

3 討 論

研究表明成人每天都會(huì)有大量的腸上皮細(xì)胞從腸壁脫落,并通過(guò)大腸蠕動(dòng)隨糞便排出體外,而腫瘤細(xì)胞由于增生異常更容易從腸道脫落,因此結(jié)直腸癌患者的糞便中往往有大量的病變細(xì)胞及異常的細(xì)胞組分,這是多靶點(diǎn)糞便DNA檢測(cè)穩(wěn)定的物質(zhì)基礎(chǔ)[10]?；虻募谆揎検悄[瘤發(fā)生的早期事件,從結(jié)直腸癌患者排遺物中獲得的遺傳物質(zhì)可以更早地反映腸道是否存在癌變情況[11]。SDC2是一種細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,參與調(diào)節(jié)許多生理過(guò)程和病理過(guò)程,生理過(guò)程包括細(xì)胞增殖、分化、黏附、遷移、傷口愈合、血管生成;病理過(guò)程包括炎癥和癌癥[6]。TFPI2是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑,已被鑒定為一種腫瘤抑制基因。TFPI2在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及血管生成等方面也發(fā)揮重要作用,TFPI2在維持腫瘤微環(huán)境的穩(wěn)定性,抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮重要作用[7]。SDC2和TFPI2基因在結(jié)直腸癌組織中呈現(xiàn)出高度甲基化,將SDC2和TFPI2基因甲基化狀態(tài)作為結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物,可以更靈敏、特異地檢測(cè)出結(jié)直腸癌。

本檢測(cè)試劑基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)糞便標(biāo)本中SDC2和TFPI2基因甲基化的檢測(cè),在SDC2和TFPI2基因啟動(dòng)子與結(jié)直腸癌發(fā)生高度相關(guān)的CpG區(qū)域,針對(duì)經(jīng)過(guò)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的序列分別設(shè)計(jì)了特異性引物和特異性熒光探針,可以在PCR中專一地檢測(cè)出甲基化的序列。從人糞便標(biāo)本中獲得腸道脫落細(xì)胞基因組DNA,然后用重亞硫酸鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化,并通過(guò)三重PCR擴(kuò)增來(lái)測(cè)定亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA,從而檢測(cè)發(fā)生甲基化的SDC2基因DNA片段和TFPI2基因DNA片段,其中內(nèi)控基因ACTB(β-Actin)為管家基因,用于評(píng)估檢測(cè)中標(biāo)本DNA水平和質(zhì)量。

性能驗(yàn)證具體是指分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室按照檢測(cè)系統(tǒng)或試劑盒說(shuō)明書(shū)使用某種特定檢測(cè)系統(tǒng)或試劑時(shí),能夠復(fù)現(xiàn)生產(chǎn)廠家聲明的檢測(cè)性能過(guò)程。性能驗(yàn)證不僅能夠提高分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)新的檢測(cè)系統(tǒng)、新的檢測(cè)試劑或新的檢測(cè)方法相關(guān)性能指標(biāo)的全面認(rèn)識(shí)和理解,更重要的是對(duì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)質(zhì)量管理水平的提升具有重要作用[12]。因此,在臨床檢測(cè)過(guò)程中,從保證檢測(cè)質(zhì)量的角度出發(fā),任何一種用于分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的新的檢測(cè)系統(tǒng)、新的檢測(cè)試劑或新的檢測(cè)方法,在正式應(yīng)用于臨床檢測(cè)前,均需要做性能驗(yàn)證[13-15]。本研究參照《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明:CNAS-CL02-A009》[8]對(duì)開(kāi)展新的分子診斷項(xiàng)目需進(jìn)行檢測(cè)程序性能驗(yàn)證的要求,分別從方法符合率、檢出限、精密度和抗干擾能力4個(gè)方面對(duì)SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)進(jìn)行性能驗(yàn)證評(píng)價(jià)。

在方法符合率驗(yàn)證中,參照《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南:CNAS-GL039》[9]要求,選取陰性標(biāo)本至少5例、陽(yáng)性標(biāo)本(宜包含弱陽(yáng)性/低擴(kuò)增的標(biāo)本),一般不少于10例。在對(duì)試劑進(jìn)行性能驗(yàn)證時(shí),為排除和避免由于檢測(cè)標(biāo)本帶來(lái)的誤差,通常可以采用在指南要求的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加檢測(cè)標(biāo)本量的方法,進(jìn)而提高和保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。為盡可能保證方法符合率驗(yàn)證的準(zhǔn)確性,本研究選取30例糞便標(biāo)本,包括經(jīng)臨床腸鏡檢查和(或)病理診斷確診為結(jié)直腸癌的標(biāo)本25例和非結(jié)直腸癌的標(biāo)本5例。25例結(jié)直腸癌標(biāo)本中有24例經(jīng)本試劑檢測(cè)為陽(yáng)性,則陽(yáng)性標(biāo)本與腸鏡檢查和(或)病理診斷結(jié)果符合率為96.0%,高于臨床試驗(yàn)確認(rèn)的臨床靈敏度(95.3%);5例非結(jié)直腸癌標(biāo)本經(jīng)本試劑檢測(cè)全為陰性,陰性標(biāo)本符合率為100.0%。以上檢測(cè)結(jié)果表明,30例糞便標(biāo)本通過(guò)本檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照方法(腸鏡檢查和(或)病理診斷)相比僅有1例標(biāo)本不一致,即總符合率為96.7%(29/30)。

檢出限又稱為檢測(cè)下限,是指能以適當(dāng)?shù)闹眯鸥怕蕶z出待測(cè)物質(zhì)的最低濃度或最小質(zhì)量。檢出限既與檢測(cè)器對(duì)待測(cè)物質(zhì)的響應(yīng)信號(hào)有關(guān),又與空白值的波動(dòng)程度有關(guān)。本研究選用試劑廠家提供的檢出限參考品進(jìn)行試劑盒檢出限的驗(yàn)證,共選用3個(gè)濃度為10 000 copy/mL檢出限參考品,每個(gè)參考品重復(fù)檢測(cè)3次,依據(jù)檢測(cè)試劑盒的判讀標(biāo)準(zhǔn)所有檢測(cè)結(jié)果均為明確陽(yáng)性,符合試劑盒檢出限的要求。

精密度通常是指對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)所得到的結(jié)果的一致程度,通常以CV表示。本研究選用試劑廠家提供的陽(yáng)性參考品進(jìn)行試劑盒精密度的驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFPI2、SDC2和ACTB的批內(nèi)與批間檢測(cè)結(jié)果Ct值的CV值均≤5%,符合試劑說(shuō)明書(shū)要求標(biāo)準(zhǔn),精密度驗(yàn)證合格。一般來(lái)說(shuō),檢測(cè)方法或檢測(cè)試劑的精密度高,可以更好地保障檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定。

在臨床檢測(cè)過(guò)程中,為避免臨床標(biāo)本可能存在的內(nèi)源性或外源性干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響,造成假陰性結(jié)果的出現(xiàn),通常建議選用抗干擾能力好的檢測(cè)試劑。為確認(rèn)及避免干擾物質(zhì)對(duì)本試劑盒檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響,本研究通過(guò)用本試劑盒檢測(cè)分別加入新鮮 EDTA 抗凝血/甘油干擾物質(zhì)的陽(yáng)性標(biāo)本和陰性標(biāo)本,對(duì)本試劑盒進(jìn)行抗干擾能力的驗(yàn)證,檢測(cè)結(jié)果表明干擾物質(zhì)未對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響,符合試劑說(shuō)明書(shū)要求標(biāo)準(zhǔn),說(shuō)明本檢測(cè)試劑抗干擾能力好。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)針對(duì)方法符合率、檢出限、精密度和抗干擾能力4個(gè)方面驗(yàn)證了SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)的效果,所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合要求,表明本試劑可用于臨床檢測(cè)。