金黃色葡萄球菌在人工關節(jié)感染中的分子型別與耐藥基因特征*

梁玉龍,程 翔,魏 瑩,劉 穎,郭 宇

首都醫(yī)科大學附屬北京積水潭醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心,北京 100035

人工關節(jié)置換術是治療髖膝關節(jié)退行性病變、關節(jié)畸形等晚期骨關節(jié)疾病的有效手段,然而人工關節(jié)假體周圍感染(PJI)是置換術后的最嚴重并發(fā)癥,造成患者產(chǎn)生極大痛苦和生活質(zhì)量的降低。盡管髖關節(jié)置換術后PJI發(fā)生率僅為1%,膝關節(jié)置換術后發(fā)生率在1%～2%,但由于人工關節(jié)置換術的基數(shù)較大,PJI患者總數(shù)仍較大[1-3]。PJI一旦發(fā)生,診斷與治療過程復雜,給患者和臨床醫(yī)師都帶來重大挑戰(zhàn),且研究顯示PJI復發(fā)率在15%～30%,因感染而進行的翻修手術失敗率高達40%[4],這進一步凸顯出PJI帶來的災難性后果。導致PJI的主要病原體包括葡萄球菌、腸桿菌和鏈球菌等[5],其中金黃色葡萄球菌是最常見的致病菌[6-7]。目前關于PJI中金黃色葡萄球菌的分子病原學研究較少。因此了解PJI中金黃色葡萄球菌的藥物敏感性和分子病原學特征對臨床預防和控制感染具有重要意義。本研究對2017年1月至2022年1月首都醫(yī)科大學附屬北京積水潭醫(yī)院矯形骨科人工關節(jié)置換術后金黃色葡萄球菌的分離情況、耐藥性和分子分型進行了分析調(diào)查,旨在為臨床預防和治療PJI提供更多參考信息。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究所用菌株來源于2017年1月至2022年1月首都醫(yī)科大學附屬北京積水潭醫(yī)院矯形骨科收治的80例髖膝關節(jié)PJI患者的關節(jié)液標本。在兩個或更多標本中檢出同一菌株時視為病原菌。對80例患者病歷資料進行了回顧性分析,包括48例男性和32例女性,平均年齡(53±16)歲。所有患者均符合肌肉與骨骼感染協(xié)會關于PJI的診斷標準[8],其中34例為髖關節(jié)PJI,56例為膝關節(jié)PJI。本研究排除了重復菌株,對于同一患者多次分離出相同菌株的情況,選擇首次分離的菌株作為研究對象。參考菌株采用金黃色葡萄球菌ATCC29213。

1.2方法

1.2.1細菌培養(yǎng)及鑒定 在無菌條件下,抽取PJI患者關節(jié)穿刺液并注入血培養(yǎng)瓶中(美國BD公司)。將血培養(yǎng)瓶置于全自動體液及血液培養(yǎng)儀(BACTEC FX100,美國BD公司)進行培養(yǎng)。當培養(yǎng)儀檢測到陽性血培養(yǎng)瓶時,取1 mL培養(yǎng)液接種于哥倫比亞血瓊脂平皿(中國鄭州安圖公司),并將平皿放入35 ℃溫箱中進行培養(yǎng)。對分純后的菌落使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS,德國布魯克公司)進行鑒定,結(jié)果為金黃色葡萄球菌。通過觀察菌落形態(tài)篩選金黃色葡萄球菌小菌落變異體(SCVs)[9]。具體方法為在24、48 h分別觀察菌落形態(tài),挑選直徑明顯小于正常菌落的菌株(直徑約為金黃色葡萄球菌ATCC25923的1/10),并通過質(zhì)譜鑒定為金黃色葡萄球菌。所有菌株均存儲于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2抗菌藥敏試驗 利用全自動微生物藥敏分析系統(tǒng)(VITEK 2 Compact,法國生物梅里埃公司)和梅里埃革蘭陽性菌藥敏卡(GP-67,法國生物梅里埃公司)對菌株進行抗菌藥敏試驗,以測定抗菌藥物對細菌的最低抑菌濃度(MIC)。依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會2021版M100-31折點判讀標準[10],將藥敏結(jié)果分為耐藥、中介和敏感,以金黃色葡萄球菌ATCC29213、銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922作為藥敏試驗質(zhì)控菌株。

1.2.3全基因組測序 (1)菌株DNA提取:單個菌落接種于10 mL TSB培養(yǎng)液,24 h振蕩培養(yǎng)后以10 000 r/min離心5 min,收集菌體沉淀。采用TIANamp DNA提取試劑盒(中國天根生化科技有限公司)進行DNA提取,利用Qubit 4熒光定量儀(美國ThermoFisher公司)對DNA進行定量和質(zhì)量檢測。滿足要求的DNA(A260/A280為1.8～2.0,DNA總量≥1 μg,濃度≥20 ng/μL)用于文庫構(gòu)建及測序。(2)文庫構(gòu)建及測序:取至少1 μg基因組DNA,使用Covaris對其進行片段化處理,應用NEXTflex Rapid DNA-Seq試劑盒制備文庫,通過Illumina HiSeq X Ten儀器(美國Illumina公司)進行雙端測序。利用https://github.com/OpenGene/fastp對原始測序數(shù)據(jù)進行剪切,使用SOAP denovo2進行拼接,通過比對工具和美吉生物云平臺進行基因功能預測和注釋。(3)抗菌藥物耐藥基因注釋:通過Resistance Gene Identifier(https://card.mcmaster.ca)及ResFinder4.1(https://cge.cbs.dtu.dk)對細菌基因組序列進行抗菌藥物耐藥基因的注釋和統(tǒng)計。(4)多點位序列分型(MLST):利用金黃色葡萄球菌7個等位基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqiL)編碼與MLST數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org)進行比對,以確定其序列分型及克隆復合物型別(CCs)[11]。使用goeBURST(http://goeburst.phyloviz.net)構(gòu)建最小生成樹,比較不同分子型別間的耐藥率差異。

1.2.4統(tǒng)計學處理 使用WHONET5.6軟件對細菌耐藥率和MIC90進行分析。采用SPSS25.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。藥敏結(jié)果采用Wilcoxon秩和檢驗,不同分子分型組間比較采用χ2檢驗。當頻數(shù)小于5時,則采用Fisher精確檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果表明,在80株金黃色葡萄球菌中,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)檢出率為26.25%(21/80),而甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)檢出率為73.75%(59/80)。對于常用抗菌藥物,MRSA的耐藥率從高到低分別為青霉素、甲氧西林和頭孢西丁均為100.00%(21/21)、紅霉素66.7%(14/21)、克林霉素57.1%(12/21)、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和四環(huán)素均為38.1%(8/21)、慶大霉素為23.8%(5/21)、利福平為14.3%(3/21)、復方磺胺甲噁唑為9.5%(2/21)。相較之下,MSSA對抗菌藥物的耐藥率普遍較低,除對青霉素G的耐藥率為88.1%(52/59),其他抗菌藥物的耐藥率均低于62.0%。值得注意的是,本研究未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、利奈唑胺和替加環(huán)素耐藥的菌株。對比MRSA和MSSA的耐藥情況,MRSA對氟喹諾酮類藥物如環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星及四環(huán)素的耐藥率高于MSSA(P<0.05);然而MSSA分離菌株對復方磺胺甲噁唑的耐藥率明顯高于MRSA菌株(P<0.05)。見表1。

表1 MRSA與MSSA對不同抗菌藥物的耐藥情況

2.2耐藥基因檢出情況 通過對細菌基因組拼接序列與耐藥基因數(shù)據(jù)庫比對,研究發(fā)現(xiàn)95%的菌株攜帶耐藥基因。這些耐藥基因包括6種氨基糖苷類、5種大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺-鏈陽菌素B類(MLSB類)、2種β-內(nèi)酰胺類、2種四環(huán)素類,以及各1種甲氧芐啶類、磷霉素類、氯霉素類、消毒劑和夫西地酸相關耐藥基因。本研究中β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢出率最高,為92.50%,其次是MLSB類耐藥基因(65.00%)、氨基糖苷類耐藥基因(42.50%)、四環(huán)素類耐藥基因(15.00%)、甲氧芐啶類耐藥基因(10.00%)、磷霉素類、氯霉素類和消毒劑耐藥基因各占2.50%。所有菌株的耐藥基因平均攜帶數(shù)量為2.7種,MSSA平均攜帶2.2種耐藥基因,而MRSA平均攜帶4.3種。blaZ-mecA是MRSA菌株的主要耐藥基因表型,檢出率為28.57%(6/21)。其次是blaZ-mecA-erm(B)-tet(K)-ant(6)-Ⅰa - aph(3′)-Ⅲ耐藥基因表型,檢出率為14.29%(3/21)。在MSSA菌株中,blaZ是主要耐藥基因表型,檢出率為28.81%(17/59)。其次是blaZ-erm(B)-aph(2″)-Ⅰa耐藥基因表型,檢出率為25.42%(15/59)。見表2、3。

表2 金黃色葡萄球菌中各類耐藥基因的檢出情況

表3 金黃色葡萄球菌耐藥基因譜和檢出率

2.3SCVs檢出情況 本研究中共檢測出19株金黃色葡萄球菌SCVs,占總菌株的23.75%(19/80)。在MRSA和MSSA菌株中,SCVs的檢出率分別為28.57%(6/21)和22.03%(13/59),差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。然而,與正常菌落形態(tài)的金黃色葡萄球菌菌株(NP)比較,SCVs對利福平的耐藥率升高(P<0.05),而對其他抗菌藥物的耐藥率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 SCVs和NP藥敏結(jié)果比較

2.4菌株分子型別及分析 在本研究中,檢出金黃色葡萄球菌的8種CCs,包括CC1、CC22、CC30、CC398、CC45、CC5、CC59和CC8,另有12株菌株未分型。通過MLST方法,共鑒定出22個ST型別,其中ST-398型占主導地位,檢出率為22.50%(18/80),其次為ST-5型(13.75%,11/80)和ST-59型(11.25%,9/80)。在對主要流行的ST耐藥性進行比較后發(fā)現(xiàn),ST-59型的MRSA檢出率最高,為77.8%(7/9),而ST-5型和ST-398型的MRSA檢出率分別為18.2%(2/11)和16.7%(3/18)。見圖1。

圖1 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹及不同ST型別中MRSA檢出情況

在ST-59型金黃色葡萄球菌中,紅霉素和克林霉素的耐藥率較高(77.8%),同時ST-59型對四環(huán)素的耐藥率高于ST-398、ST-5型(P<0.05)。然而ST-59型對慶大霉素和復方磺胺甲噁唑的耐藥率相對較低(P<0.05),見表5。ST-398、ST-5、ST-59型金黃色葡萄球菌SCVs的檢出率分別為11.11%、18.18%和44.44%,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。值得關注的是,盡管ST-398、ST-5、ST-59型金黃色葡萄球菌對萬古霉素均敏感,但ST-59型金黃色葡萄球菌的萬古霉素MIC值相對較高,其MIC值為1的比例為66.7%,高于其他類型(P<0.05),見表6。

表5 ST-398、ST-5、ST-59型金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果

表6 ST-398、ST-5、ST-59型金黃色葡萄球菌SCVs檢出率、萬古霉素MIC值的比較(%)

3 討 論

PJI作為關節(jié)置換術后的嚴重并發(fā)癥之一,是導致患者進行關節(jié)翻修的主要原因[12],也是關節(jié)外科醫(yī)師無法回避的難題。人工關節(jié)感染常需進行多次手術和持續(xù)抗菌藥物治療,臨床表現(xiàn)為并發(fā)癥多、病程長、治療費用高[13]。盡管現(xiàn)代關節(jié)置換術中已嚴格執(zhí)行無菌操作,但仍難以完全避免感染,且PJI發(fā)生與多種危險因素相關,如美國麻醉醫(yī)師協(xié)會評分、體重指數(shù)(BMI)、肺部疾病、糖尿病等[14]。有研究表明,金黃色葡萄球菌是PJI的主要致病菌,具有較強的毒力和侵襲性,常導致急性PJI發(fā)生,該菌也可在感染部位形成生物膜,導致感染反復發(fā)作和慢性化[15]。此外金黃色葡萄球菌耐藥性已引起廣泛關注,由MRSA引起的PJI,會進一步增加治療難度。因此研究金黃色葡萄球菌在PJI中的分子型別和耐藥基因分布,有助于精準抗感染治療。

近年來隨著抗菌藥物規(guī)范化管理與應用,MRSA檢出率呈下降趨勢,中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示,2022年我國MRSA總檢出率為28.70%。本研究中MRSA和MSSA檢出率分別為26.25%和73.75%。MRSA檢出率與其他類型感染大致相同[16]。MRSA對多種骨科常用抗菌藥物均表現(xiàn)出較高耐藥率,尤其是紅霉素、克林霉素和氟喹諾酮類藥物,這與此類藥物廣泛使用形成的抗菌藥物選擇性壓力有關。MRSA對抗菌藥物耐藥率普遍高于MSSA,但對復方磺胺甲噁唑的耐藥率明顯低于后者(P<0.05),可能與某些耐藥基因的分布特點或耐藥機制差異有關[17],提示復方磺胺甲噁唑?qū)RSA 具有良好抗菌活性,或可作為備選用藥。本研究未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、利奈唑胺和替加環(huán)素耐藥的菌株,表明這些藥物仍是為抗MRSA感染的主要選擇。

在本研究中發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌菌株攜帶的耐藥基因種類繁多,其中β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢出率最高,這與其他研究的結(jié)果較一致[18]。此外MLSB類和氨基糖苷類耐藥基因的檢出率也較高,分別為65.00%和42.50%,可能與這些抗菌藥物在治療金黃色葡萄球菌感染中的廣泛應用有關[19]。值得關注的是MRSA菌株與MSSA菌株在耐藥基因的攜帶數(shù)量和種類上存在明顯差異,MRSA平均攜帶4.3種耐藥基因,而MSSA僅攜帶2.2種,這可能是由于MRSA菌株在面臨抗菌藥物壓力時更容易獲得和傳播耐藥基因[20]。在MRSA和MSSA菌株中,blaZ、mecA和erm等耐藥基因較為常見,這與以往的研究結(jié)果一致[21]?？傊?金黃色葡萄球菌的耐藥性和耐藥基因檢出具有一致性,了解耐藥基因的分布特點有助于指導臨床選擇抗菌藥物。

本研究中檢出19株金黃色葡萄球菌SCVs,檢出率為23.75%,高于其他感染類型[22]。SCVs自1910年首次在傷寒沙門菌中被發(fā)現(xiàn)以來,已在多種細菌中觀察到,如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌等,其顯著特點包括生長緩慢和形成小型菌落,特殊環(huán)境條件和長期抗菌藥物治療可能導致病原菌生活方式的改變[9,23]。值得注意的是金黃色葡萄球菌SCVs與慢性感染密切相關,它們能通過多種策略實現(xiàn)免疫逃逸,并定植骨骼和人工關節(jié)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)SCVs菌株對利福平的耐藥率高于NP菌株,利福平作為骨科常用抗菌藥物,在細胞內(nèi)可持續(xù)降低細菌活性,常用于抗生物膜感染。為防止其耐藥性出現(xiàn),建議與其他抗菌藥物聯(lián)合使用[25]。

為進一步了解金黃色葡萄球菌在PJI中的流行特征、耐藥性及演化情況,本研究對實驗菌株進行了MLST和系統(tǒng)發(fā)育研究。MLST是作為一種高分辨率分型技術,有助于了解病原菌親緣關系和種群進化過程[26]。本研究中MRSA菌株中共檢出10種ST型別,其中ST-59型為優(yōu)勢型,有流行病學調(diào)查顯示ST-59型是金黃色葡萄球菌PJI中的常見表型[27],本研究結(jié)果與此相符。ST-59型與MRSA密切相關,作為一種主要的金黃色葡萄球菌克隆類型,其具有較高的耐藥性和傳播能力[28]。MSSA菌株中共檢出19種ST型別,其中ST-398型為優(yōu)勢型?？傊甈JI中金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)出多樣化的分子型別,ST-398、ST-5和ST-59型是主要流行克隆株。進一步分析以上3種主要流行克隆株的特征,發(fā)現(xiàn)ST-398、ST-5、ST-59型金黃色葡萄球菌在PJI中具有不同的SCVs檢出率,盡管差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但ST-59型具有較高的SCVs檢出率,可能與其獨特的耐藥和生物學特性有關,有待進一步研究。值得注意的是,雖然這3種類型的金黃色葡萄球菌對萬古霉素均敏感,但ST-59型的萬古霉素MIC值相對較高,提示監(jiān)測這些類型金黃色葡萄球菌的萬古霉素敏感性和MIC值變化具有實際意義[29],在PJI治療中,針對不同的金黃色葡萄球菌克隆型,可能需要采取更加個性化的抗感染治療策略。本研究也存在一些局限性,如研究樣本量偏小、儀器法測定金黃色葡萄球菌SCVs藥物敏感性可能存在偏差,并未進行藥敏紙片法復核等。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)MRSA與MSSA在PJI中的檢出率分別為26.25%和73.75%,MRSA菌株對抗菌藥物耐藥率普遍較高,MRSA菌株中耐藥基因攜帶數(shù)量和種類也多于MSSA。萬古霉素、利奈唑胺仍可作為抗MRSA感染的主要選擇。PJI中金黃色葡萄球菌SCVs檢出率較高,造成此類感染診療困難。金黃色葡萄球菌在PJI中的分子分型呈現(xiàn)多樣化,ST-398、ST-5、ST-59型為主要流行克隆株,其中ST-59型金黃色葡萄球菌的SCVs檢出率較高,且萬古霉素MIC值相對較高,提示對不同金黃色葡萄球菌克隆類型應采取個性化的抗感染治療策略。