lncRNA SNHG15通過調(diào)控miR-942-5p表達(dá)減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的研究*

張文娟,戴婷麗,李 沛

青海省人民醫(yī)院:1.健康管理部;2.病理科;3.神經(jīng)內(nèi)科,青海西寧 810000

阿爾茨海默病(AD)是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,與β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、tau蛋白神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激等密切相關(guān),AD患者腦中神經(jīng)元丟失的機(jī)制可能是凋亡引起的;目前藥物治療只能改善一些癥狀,還有部分患者治療不佳[1-3]。研究表明長鏈非編碼RNA(lncRNA)參與了AD相關(guān)的病理生理學(xué)進(jìn)展,確定lncRNA相關(guān)的競爭性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)可以有助于AD診斷和未來治療策略[4]。小核仁RNA宿主基因15(SNHG15)是一種lncRNA,研究報(bào)道lncRNA SNHG15可通過調(diào)節(jié)微小RNA(miR)-455-3p/腫瘤蛋白P53誘導(dǎo)性核蛋白1軸促進(jìn)氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡、炎癥和氧化損傷[5]。抑制lncRNA SNHG15通過靶向miR-183-5p/叉頭轉(zhuǎn)錄因子1軸防止腦缺血再灌注損傷[6]。StarBase在線分析軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG15與miR-942-5p有結(jié)合位點(diǎn)。研究報(bào)道m(xù)iR-942-5p在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),circ_0003204通過調(diào)節(jié)miR-942-5p/組蛋白去乙酰化酶9調(diào)控氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞生長、氧化應(yīng)激和炎癥[7]。但尚未有報(bào)道明確lncRNA SNHG15和miR-942-5p在AD中的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在探討miR-942-5p參與的AD細(xì)胞模型中,lncRNA SNHG15對β淀粉樣蛋白25-35(Aβ25-35)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 源自大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的PC12細(xì)胞購自美國ATCC公司,DMEM培養(yǎng)基、Aβ25-35購自美國Sigma公司,lncRNA SNHG15小干擾RNA(si-SNHG15)、miR-942-5p模擬物(miR-942-5p)、miR-942-5p抑制劑(anti-miR-942-5p)及相應(yīng)的陰性對照si-NC、miR-NC、anti-miR-NC購自上海生工生物公司,Trizol試劑、熒光定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司,miRNA提取試劑盒購自上海翌圣生物公司,miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海博爾森公司,超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒購自上海碧云天生物公司,蛋白提取試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司,抗體B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、羊抗兔二抗購自英國abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞處理、分組 采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞,以40 μg/L的Aβ25-35處理PC12細(xì)胞建立損傷模型,記為Aβ25-35組,正常培養(yǎng)的細(xì)胞記為Con組;將si-SNHG15、si-NC、miR-942-5p及miR-NC轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后用40 μg/L的Aβ25-35處理,記為Aβ25-35+si-SNHG15組、Aβ25-35+si-NC組、Aβ25-35+miR-942-5p組、Aβ25-35+miR-NC組;將lncRNA SNHG15干擾表達(dá)載體分別與miR-942-5p抑制劑、陰性對照轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后用40 μg/L的Aβ25-35處理,記為Aβ25-35+si-SNHG15+anti-miR-942-5p組、Aβ25-35+si-SNHG15+anti-miR-NC組。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測lncRNA SNHG15、miR-942-5p相對表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR,以GAPDH、U6為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA SNHG15、miR-942-5p相對表達(dá)水平,其中miR-942-5p通過使用特定的RNA提取試劑盒并通過莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。lncRNA SNHG15上游引物序列:5′-CACAAGAGTGCCTGCCATC-3′,下游引物序列:5′-GGCAGCCACTGAAGGTATC-3′; miR-942-5p上游引物序列:5′-AGGGTCTTCTCTGTTTTGGC-3′,下游引物序列:5′-GTTGTGGTTGGTTGGTTTGT-3′。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測SOD活性、MDA表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞,胰酶消化后,離心,收集上清液,通過使用相應(yīng)的試劑盒檢測細(xì)胞SOD活性和MDA表達(dá)水平,具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。采用酶標(biāo)儀檢測各組指標(biāo)吸光度,最后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,分析其表達(dá)水平變化。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞,使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入500 μL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,然后加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,避光孵育10 min,快速使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞,加入含蛋白酶抑制劑的裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白,參照BCA蛋白定量試劑盒操作步驟檢測蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)變性后使用10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜,加入5%脫脂牛奶在室溫下將膜封閉1 h,然后加入Bax、Bcl-2、GAPDH一抗(1∶1 000),在4 ℃孵育過夜,加二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h后采用ECL法顯影,采用凝膠成像分析儀掃描條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,分析Bax、Bcl-2蛋白條帶的灰度值。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建lncRNA SNHG15野生型、突變型熒光素酶載體(WT-SNHG15和MUT-SNHG15)。將PC12細(xì)胞接種到6孔板中,使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將WT-SNHG15和MUT-SNHG15分別與miR-NC或miR-942-5p mimics共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,24 h后按照說明書檢測熒光素酶活性。

將pcDNA、pcDNA-SNHG15、si-NC、si-SNHG15轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞,用1.2.2中方法檢測miR-942-5p表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA SNHG15、miR-942-5p在Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中的表達(dá) 與Con組比較,Aβ25-35組PC12細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG15表達(dá)水平升高,miR-942-5p表達(dá)水平降低(P<0.05),見表1。

表1 lncRNA SNHG15和miR-942-5p在Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中的表達(dá)

2.2抑制lncRNA SNHG15表達(dá)對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響 Aβ25-35組PC12細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG15、MDA、Bax表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率較Con組高,SOD活性、Bcl-2表達(dá)水平較Con組低(P<0.05);Aβ25-35+si-SNHG15組PC12細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG15、MDA、Bax表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率較Aβ25-35+si-NC組低,SOD活性、Bcl-2表達(dá)水平較Aβ25-35+si-NC組高(P<0.05)。見圖1、表2。

注:A為凋亡相關(guān)蛋白Western blot效果圖;B為細(xì)胞凋亡流式圖。

表2 抑制lncRNA SNHG15表達(dá)對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響

2.3lncRNA SNHG15靶向調(diào)控miR-942-5p StarBase在線分析軟件預(yù)測lncRNA SNHG15與miR-942-5p有互補(bǔ)的核苷酸序列,見圖2。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示,與miR-NC+WT-SNHG15比較,miR-942-5p+WT-SNHG15相對熒光素酶活性下降(P<0.05),與miR-NC+MUT-SNHG15比較,miR-942-5p+MUT-SNHG15相對熒光素酶活性基本不變(P>0.05),見表3。pcDNA-SNHG15組miR-942-5p表達(dá)水平(0.42±0.04)低于pcDNA組(1.00±0.06),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),si-SNHG15組miR-942-5p表達(dá)水平(3.23±0.33)高于si-NC組(1.01±0.06),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 lncRNA SNHG15與miR-942-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4miR-942-5p過表達(dá)對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響 Aβ25-35+miR-942-5p組SOD活性、miR-942-5p、Bcl-2表達(dá)水平較Aβ25-35+miR-NC組高,MDA、Bax表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率較Aβ25-35+miR-NC組低(P<0.05),見圖3、表4。

注:A為凋亡相關(guān)蛋白Western blot效果圖;B為細(xì)胞凋亡流式圖。

表4 miR-942-5p過表達(dá)對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響

2.5下調(diào)miR-942-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA SNHG15表達(dá)對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用 與Aβ25-35+si-SNHG15+anti-miR-NC組比較,Aβ25-35+si-SNHG15+anti-miR-942-5p組SOD活性、miR-942-5p、Bcl-2表達(dá)水平降低,細(xì)胞凋亡率及MDA、Bax表達(dá)水平升高(P<0.05),見圖4、表5。

表5 下調(diào)miR-942-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA SNHG15表達(dá)對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用

3 討 論

AD是一種起病隱匿的退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,在AD早期病理改變發(fā)生時(shí),氧化應(yīng)激發(fā)揮重要作用,Aβ可能為氧化應(yīng)激作用下的適應(yīng)性產(chǎn)物;抗氧化應(yīng)激能力喪失和Aβ沉積,最終引起AD病理改變的發(fā)生與發(fā)展[8-10]。Aβ25-35通常用于誘導(dǎo)AD體外模型,Aβ25-35聚集在神經(jīng)元周圍,不僅對神經(jīng)元有直接的毒性作用,還會增強(qiáng)神經(jīng)元對氧化應(yīng)激和自由基的敏感性,導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[11]。SOD是抗氧化酶,MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,它們均是氧化應(yīng)激指標(biāo),已有研究發(fā)現(xiàn),AD患者血清中MDA表達(dá)水平升高,SOD活性降低[12]。本實(shí)驗(yàn)用Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型,結(jié)果顯示,PC-12細(xì)胞中SOD活性、Bcl-2表達(dá)水平降低,MDA、Bax表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率升高,表明Aβ25-35誘導(dǎo)了PC12細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生,提示AD細(xì)胞模型建立成功。

有研究發(fā)現(xiàn),lncRNA可以與各種RNA和蛋白質(zhì)相互作用調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生命過程,在維持細(xì)胞生理狀態(tài),以及一系列人類疾病中起著關(guān)鍵作用,包括神經(jīng)退行性疾病,一些lncRNA可以通過Aβ沉積、突出重塑和記憶形成參與AD的病理過程[13-14]。研究報(bào)道lncRNA SNHG15在心肌梗死患者和缺氧心肌細(xì)胞中高表達(dá),其可通過調(diào)控miR-188-5p/磷酸酶及張力蛋白同源基因軸調(diào)節(jié)缺氧/再灌注損傷后的心肌細(xì)胞凋亡[15]。缺血皮質(zhì)中l(wèi)ncRNA SNHG15表達(dá)水平升高,其過表達(dá)增強(qiáng)了氧糖剝奪/復(fù)氧介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡及小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥因子的表達(dá)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞后,lncRNA SNHG15表達(dá)上調(diào),與上述研究類似,提示lncRNA SNHG15可能參與AD疾病的發(fā)展過程。抑制lncRNA SNHG15表達(dá)可以抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡,降低氧化應(yīng)激反應(yīng),但lncRNA SNHG15在AD中的作用機(jī)制尚不清楚。

已發(fā)現(xiàn)lncRNA可通過靶向調(diào)節(jié)miRNA參與AD發(fā)生過程。例如,β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)增加,抑制β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1可通過靶向下調(diào)miR-374b-5p減輕神經(jīng)細(xì)胞炎癥,增強(qiáng)神經(jīng)元活力[17]。目前的研究發(fā)現(xiàn),脂多糖處理的HK-2細(xì)胞中miR-942-5p表達(dá)水平降低,miR-942-5p過表達(dá)通過靶向叉頭框蛋白O3A抑制脂多糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥和凋亡[18]。lncRNA SOX2-OT通過靶向miR-942-5p/DP5加重阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[19]。上述研究表明,miR-942-5p與細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān),但其在AD中的作用還不明確。本研究結(jié)果顯示,Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中miR-942-5p表達(dá)水平降低,且過表達(dá)miR-942-5p可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激,提示miR-942-5p參與AD的發(fā)生過程。此外,本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),lncRNA SNHG15可靶向下調(diào)miR-942-5p表達(dá),推測抑制lncRNA SNHG15可能通過上調(diào)miR-942-5p減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激,并抑制細(xì)胞凋亡,提示抑制lncRNA SNHG15可通過上調(diào)miR-942-5p來阻止AD的發(fā)展。深入研究后發(fā)現(xiàn),下調(diào)miR-942-5p能夠減弱lncRNA SNHG15低表達(dá)對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的阻礙作用,這也證實(shí)了筆者之前的推測。但本研究尚未證實(shí)lncRNA SNHG15和miR-942-5p在AD中的具體表達(dá)情況,后續(xù)將通過回顧性臨床研究探索lncRNA SNHG15和miR-942-5p在AD患者中的表達(dá)來驗(yàn)證本研究推測,為AD的治療提供分子靶點(diǎn)。

綜上所述,在AD細(xì)胞模型中,抑制lncRNA SNHG15表達(dá)通過上調(diào)miR-942-5p表達(dá)減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果為深入了解lncRNA SNHG15在AD進(jìn)展中的作用提供了希望,并可能為尋找新的AD治療方法和診斷標(biāo)志物提供了可能。