miR-335-5p過表達(dá)對胃癌基因表達(dá)譜的影響及篩選基因的驗(yàn)證研究*

王宏偉,趙雪靈,王 蒙,高夏青,陳鳳琴,寧 月,李海龍△

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,甘肅蘭州 730020;2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730101;3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院功能科,甘肅蘭州 730020

微小RNA(miR)-335位于染色體7q32.2,在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[1]。有報道指出,miR-335-5p在胃癌組織中表達(dá)下調(diào),與其啟動子甲基化有關(guān)[2]。miR-335-5p抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,把胃癌細(xì)胞周期阻滯在G1/S期[1]。臨床病理分析顯示,miR-335低表達(dá)可能與胃癌發(fā)生發(fā)展有關(guān),可一定程度評估患者預(yù)后[3]。為深入探明其調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制,本研究構(gòu)建了miR-335-5p過表達(dá)慢病毒載體并感染胃癌細(xì)胞,然后選擇人類全基因組表達(dá)譜芯片篩選過表達(dá)miR-335-5p的胃癌細(xì)胞與對照細(xì)胞之間差異表達(dá)的mRNA,并采用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1材料來源 胃癌細(xì)胞MGC-803購自中科院上海細(xì)胞庫。靶基因環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(CREB1)、蘇氨酸激酶3(AKT3)、外被體包被蛋白β2亞基(COPB2)、芳香烴受體核易位蛋白2(ARNT2)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β2、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、血小板源性生長因子-β(PDGF-β)、GAPDH、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)購自Immunoway生物科技有限公司。

1.2儀器與試劑 電泳和濕轉(zhuǎn)儀(美國Bio-rad公司、DYCZ-24D),酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司、SpectraMax i3X),凝膠成像儀(廣州博鷺騰生物科技有限公司、GelView 6300Plus),PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司、ABI7500)。BCA試劑、配膠試劑購自北京索萊寶科技有限公司;增強(qiáng)型ECL發(fā)光試劑購自上海熠圣生物科技股份有限公司;miR-335-5p的過表達(dá)和陰性對照慢病毒載體由上海吉凱基因技術(shù)有限公司采用GV369載體合成,克隆位點(diǎn)為BamHNheⅠ;miDETECTA Track miRNA qRT-PCR starter kit購自廣州銳博生物有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司;高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司),胎牛血清(杭州四季青公司),青鏈霉素雙抗(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中加入青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 U/mL),在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每隔2～3 d換完全培養(yǎng)基,待細(xì)胞密度達(dá)90%左右時按1∶2比例傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2慢病毒載體感染胃癌細(xì)胞 培養(yǎng)胃癌MGC-803細(xì)胞至對數(shù)生長期,消化細(xì)胞后用含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù),調(diào)成單細(xì)胞懸液,接種在6孔板中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中備用。待過夜后的細(xì)胞生長至40%～50%時,用感染增強(qiáng)液稀釋配備1×108TU/mL的病毒液。取10 mg/mL polybrene以DMEM培養(yǎng)基稀釋至終濃度為5 μg/mL(指1 mL感染時體積),備用。在6孔板中采用1×108TU/ mL的病毒液感染胃癌細(xì)胞,將培養(yǎng)體系混勻后繼續(xù)培養(yǎng)8～12 h后,觀察細(xì)胞狀態(tài),并更換為新鮮的培養(yǎng)基。感染72 h后,觀察熒光表達(dá)情況并拍照,消化細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至70%～80%時,消化傳代培養(yǎng),收集部分細(xì)胞,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄后,擴(kuò)增并計(jì)算miR-335-5p水平,以確定感染后細(xì)胞內(nèi)miR-335-5p水平。

1.3.3MTT法檢測過表達(dá)miR-335-5p對胃癌細(xì)胞增殖的影響 將穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-335-5p和陰性對照的MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,收集細(xì)胞后用不含有胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù),調(diào)成單細(xì)胞懸液,以200 μL體積加入96孔板,使細(xì)胞數(shù)為5 000個/每孔,置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜備用。待24、48、72、96 h后每組每孔加入MTT 20 μL,繼續(xù)孵育4 h,吸去上清液,每孔加入二甲基亞砜150 μL,振蕩10 min,用酶標(biāo)儀以570 nm波長檢測各孔吸光度(A)。按A值計(jì)算各組的平均值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4Transwell小室檢測過表達(dá)miR-335-5p對胃癌細(xì)胞的遷移能力的影響 將成功轉(zhuǎn)染miR-335-5p的胃癌細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)液制成5×104/mL的懸液,取200 μL加入Transwell上室中,在下室中加入500 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞在37 ℃下培養(yǎng)48 h。將小室內(nèi)的培養(yǎng)基丟棄,加適量預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)胞洗滌2次,添加足夠的4%細(xì)胞固定液將小室下側(cè)細(xì)胞固定2 min,將固定液倒掉并用PBS洗滌2次,隨后用100%甲醇固定,25 min后將甲醇倒掉并用適量的PBS將細(xì)胞洗滌2次,加0.1%的結(jié)晶紫在避光條件下進(jìn)行20 min染色,結(jié)晶紫染液倒掉并用足量PBS洗滌細(xì)胞2次,隨后用棉簽小心將小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞拭去,常溫下放置30 min,待其風(fēng)干后于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。隨機(jī)選取3個視野進(jìn)行拍照,以穿過小室細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞數(shù)量的遷移能力。

1.3.5表達(dá)譜芯片篩選過表達(dá)miR-335-5p后胃癌細(xì)胞差異表達(dá)的基因 將穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-335-5p和陰性對照細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,收集細(xì)胞后提取總RNA,采用Agilent mRNA表達(dá)譜芯片雜交分析,使用晶芯?cRNA擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒進(jìn)行樣品RNA的熒光標(biāo)記,逆轉(zhuǎn)錄合成1st-strand cDNA和2nd-strand cDNA?；蛐酒s交反應(yīng)在42 ℃溫度下16～20 h完成,洗滌后,應(yīng)用芯片掃描儀進(jìn)行掃描。雜交芯片在掃描后,使用Agilent G2565CA Microarray Scanner軟件掃描圖像(TIFF格式),掃描后的TIFF格式圖片數(shù)據(jù)采用Feature Extraction提數(shù)軟件進(jìn)行預(yù)處理分析,然后采用GeneSpring GX軟件,寫入分組等參數(shù)信息。進(jìn)行每個樣品的數(shù)據(jù)歸一化和QC分析,然后計(jì)算基因表達(dá)差異和P值。

1.3.6miRNA靶基因預(yù)測和靶基因富集信號通路分析 使用miRSystem網(wǎng)站(http://mirsystem.cgm.ntu.edu.tw/index.php)中集成的DIANA、miRanda、miRDB、miRWalk、PICTAR、PITA、RNA22、Targetscan軟件對miR-335-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測,采用京都基因與基因組百科全書進(jìn)行信號通路富集分析,選取至少3個軟件支持的靶基因作為下一步分析的候選基因。并與1.3.5所述表達(dá)譜芯片篩選基因取得交集基因,然后將交集基因開展靶基因富集信號通路分析。

1.3.7篩選基因PCR擴(kuò)增檢測 采用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA,檢測RNA濃度和純度(A260/A280在1.8～2.0),以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性(28 S和18 S RNA條帶比值≥2.0)。提取完成后,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)條件如下:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。然后進(jìn)行qRT-PCR,反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 10 s,變性95 ℃ 15 s,退火60 ℃ 20 s,40個循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析,判斷產(chǎn)物是否有非特異性擴(kuò)增;分析擴(kuò)增曲線,計(jì)算Ct值,以β-actin作為內(nèi)參基因,通過2-ΔΔCt法計(jì)算各組間mRNA水平差異(模型組基因水平設(shè)為1)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,引物合成由大連寶生物工程有限公司合成,引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.3.8Western blot 收集各組處理的細(xì)胞,提取總蛋白,加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF為100∶1)提取總蛋白,將蛋白煮沸變性后,以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離,濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上,以5%脫脂奶粉封閉1.5 h,一抗孵育過夜(CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGFB、GAPDH 1∶500～1∶1 000稀釋),TBST洗膜3次,二抗孵育2 h(羊抗兔,1∶2 000稀釋),TBST洗膜3次,加入ECL于Bio-rad凝膠成像儀中進(jìn)行反應(yīng),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5次,采用Image J軟件對Western blot結(jié)果進(jìn)行定量分析,灰度值以累積吸光度值表示,結(jié)果以目的蛋白與GAPDH的累積吸光度的比值表示。

2 結(jié) 果

2.1慢病毒感染效果的觀察及檢測 慢病毒miR-335-5p感染MGC-803細(xì)胞72 h后在倒置熒光顯微鏡鏡下觀察,結(jié)果顯示綠色熒光細(xì)胞占全視野細(xì)胞在80%以上,見圖1。qRT-PCR結(jié)果顯示,慢病毒miR-335-5p感染MGC-803細(xì)胞72 h后,MGC-803細(xì)胞中miR-335-5p水平(130.74±2.67)較陰性對照組(1.00±0.11)明顯升高(P<0.05),見圖2。

注:A為明場下細(xì)胞(×100);B為暗場下細(xì)胞(×100)。

圖2 各組miR-335-5p水平比較

2.2過表達(dá)miR-335-5p對胃癌細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示,與陰性對照組比較,miR-335-5p組細(xì)胞的48、72、96 h 的A值均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明miR-335-5p可降低胃癌細(xì)胞活力、抑制其增殖,見圖3。

注:與同時段陰性對照組比較,aP<0.05。

2.3過表達(dá) miR-335-5p 對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell結(jié)果顯示,與陰性對照組比較,miR-335-5p組細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明過表達(dá)miR-335-5p可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力。見圖4。

注:A為陰性對照組;B為miR-335-5p組。

2.4表達(dá)譜芯片篩選差異基因和富集信號通路分析 表達(dá)譜芯片研究發(fā)現(xiàn),miR-335-5p穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞之間差異表達(dá)的基因(FC大于2.0倍)有1 713個。生物信息學(xué)研究表明,經(jīng)DIANA、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22和Targetscan軟件共同預(yù)測miR-335-5p的靶基因,其中至少3個軟件支持的靶基因有3 013個,將所得基因與表達(dá)譜芯片篩選的差異基因取交集,獲得交集基因212個,并將獲得的交集基因運(yùn)用DAVID 6.8軟件進(jìn)行富集分析,共富集到20條信號通路,其中絕大部分為與腫瘤生物學(xué)有關(guān)的信號通路,如TGF-β通路、mTOR 通路、凋亡通路、p53信號通路等均為調(diào)控腫瘤生物學(xué)表型的重要通路。見圖5。

圖5 富集在與腫瘤密切相關(guān)的信號通路中的交集基因

2.5靶基因CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β的mRNA表達(dá)情況 為驗(yàn)證感染慢病毒miR-335-5p和陰性對照的MGC-803后胃癌細(xì)胞中篩選靶基因在蛋白水平上的表達(dá)情況,選擇表達(dá)譜芯片篩選后差異表達(dá)的核心基因進(jìn)行驗(yàn)證。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明,相對于陰性對照組,相關(guān)靶基因CREB1(0.53±0.08)、AKT3(0.60±0.05)、COPB2(0.43±0.05)、ARNT2(0.57±0.07)、TGF-β2(0.73±0.09)、KRAS(0.14±0.03)、PDGF-β(0.42±0.07)的mRNA水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

注:與陰性對照組比較,aP<0.05。

2.6靶基因CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β的蛋白表達(dá)情況 Western blot結(jié)果表明,與陰性對照組比較,相關(guān)靶基因CREB1(0.20±0.01)、COPB2(0.40±0.02)、AKT3(0.30±0.01)、ARNT2(0.49±0.01)、TGF-β2(0.21±0.00)、KRAS(0.19±0.01)、PDGF-β(0.21±0.01)的蛋白水平明顯降低(P<0.05)。見圖7。

注:A為Western blot蛋白效果圖;B為Western blot蛋白定量圖;與陰性對照組比較,aP<0.05。

3 討 論

胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一,也是全球常見癌癥相關(guān)死亡原因中排第2位的惡性腫瘤。目前胃癌治療主要通過手術(shù)切除,但絕大多數(shù)胃癌在確診時已屬于進(jìn)展期,已失去手術(shù)根治機(jī)會。因此,尋找早期診斷標(biāo)志物是腫瘤研究的重大方向。目前,miRNA已成為胃癌診斷中的重要標(biāo)志物。為進(jìn)一步研究其生物學(xué)表型和功能意義,本研究通過慢病毒miR-335-5p過表達(dá)載體感染胃癌細(xì)胞的方式在胃癌細(xì)胞中上調(diào)其表達(dá),從而觀察對胃癌細(xì)胞生物學(xué)增殖、侵襲方面的影響,并通過表達(dá)譜芯片與預(yù)測靶基因取交集的方式研究部分靶基因和富集的信號通路。

本研究結(jié)果表明,所篩選的靶基因所富集的信號通路如TGF-β信號通路、mTOR信號通路、凋亡通路、p53信號通路等均為調(diào)控腫瘤生物學(xué)表型的重要通路。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),以上通路均是與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的通路,這些通路的改變?yōu)樯钊胩接憁iR-335-5p的功能提供了依據(jù)。Western blot驗(yàn)證結(jié)果表明,過表達(dá)miR-335-5p可以下調(diào)胃癌細(xì)胞中CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β的表達(dá)。

AKT3是一種與細(xì)胞周期有關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AKT激酶是響應(yīng)胰島素和生長因子的細(xì)胞信號的調(diào)節(jié)器,它們參與多種生物學(xué)過程,包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生及糖原合成和葡萄糖攝取。該激酶已被證實(shí)可被PDGF、胰島素和胰島素樣生長因子1(IGF1)刺激。HU等[4]研究表明,AKT3在胃癌組織中高表達(dá)。LIU等[5]研究發(fā)現(xiàn),原發(fā)性胃炎是癌癥的一種獨(dú)特表型,生存率低,3個PI3K/AKT通路相關(guān)基因(PIK3R2、AKT3和IGF1)在原發(fā)性胃炎中表達(dá)上調(diào)。TAKAHASHI等[6]發(fā)現(xiàn),AKT3表達(dá)是預(yù)測頭頸部鱗狀細(xì)胞癌免疫反應(yīng)性和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。此外,AKT3的異構(gòu)體特異性抑制可作為一種新型的癌癥治療方法,有效抑制PI3K/AKT/mTOR通路[5-6]。

ARNT2是堿性螺旋-環(huán)-螺旋-PAS轉(zhuǎn)錄因子超家族的重要成員之一。編碼的蛋白作為堿性螺旋-環(huán)-螺旋-PAS家族的幾個傳感器蛋白的伴侶,與傳感器蛋白形成異二聚體,該異二聚體結(jié)合響應(yīng)發(fā)育和環(huán)境刺激的基因中的調(diào)節(jié)性DNA序列。在缺氧條件下,編碼的蛋白與細(xì)胞核中的缺氧誘導(dǎo)因子-1α組成復(fù)合物,該復(fù)合物與氧反應(yīng)基因增強(qiáng)子和啟動子中的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合。小鼠中高度相似的蛋白質(zhì)與芳基烴受體和單一蛋白質(zhì)形成功能復(fù)合物,表明編碼的蛋白質(zhì)在異源化合物的代謝和神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)中具有額外的作用。JIA等[7]研究發(fā)現(xiàn),ARNT2在胃癌組織中低表達(dá),且與腫瘤的浸潤深度、分化程度和較差的生存率呈負(fù)相關(guān)。過表達(dá)ARNT2可抑制細(xì)胞增殖。LI等[8]研究發(fā)現(xiàn),ARNT2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織,并與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。LI等[9]研究發(fā)現(xiàn),ARNT2是乳腺癌中與侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的7個核心基因之一。以上研究表明,ARNT2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用,其在腫瘤中的表達(dá)具有組織特異性。

CREB1編碼一種轉(zhuǎn)錄因子,是DNA結(jié)合蛋白亮氨酸拉鏈家族的成員。該蛋白以同型二聚體的形式與cAMP反應(yīng)元件(八聚體回文組)結(jié)合。該蛋白被多個蛋白激酶磷酸化,并誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄以響應(yīng)對cAMP途徑的激素刺激。CREB1作為一種重要的原癌基因,作為蛋白激酶A(PKA)的下游效應(yīng)器,參與組成cAMP/PKA/CREB信號通路,可以調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞的生長、遷移、侵襲和代謝[10]。有研究表明,CREB在許多生長信號通路下游的位置暗示了其在腫瘤細(xì)胞中的致癌潛力[11]。腫瘤生長與CREB表達(dá)和活化增加有關(guān),沉默CREB1可抑制腫瘤的生長[12-13]。

TGF-β2編碼TGF-β蛋白超家族的分泌配體。該家族的配體結(jié)合各種TGF-β受體,導(dǎo)致調(diào)節(jié)基因表達(dá)的SMAD家族轉(zhuǎn)錄因子的募集和激活。編碼的前蛋白被蛋白水解處理以產(chǎn)生潛伏相關(guān)肽(LAP)和成熟肽,并且以由成熟肽同二聚體、LAP同二聚體和潛在TGF-β結(jié)合蛋白組成的潛伏形式存在,或者以僅由成熟肽同二聚體組成的活性形式存在。成熟肽也可以與其他TGF-β家族成員形成異二聚體。TGF-β/SMAD途徑的破壞與多種人類癌癥有關(guān)。YANG等[14]研究表明,TGF-β2在胃癌中高表達(dá),并與腫瘤的組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、免疫細(xì)胞浸潤和預(yù)后不良相關(guān)。

KRAS是哺乳動物ras基因家族的Kirsten-ras癌基因同源物,編碼一種屬于小GTPase超家族的蛋白質(zhì)。一個單一的氨基酸取代是激活突變的原因。轉(zhuǎn)化蛋白與多種惡性腫瘤有關(guān),包括肺腺癌、黏液腺瘤、胰腺導(dǎo)管癌和結(jié)直腸癌。KRAS被認(rèn)為是人類癌癥中最常見的突變致癌基因[15]。研究證明,使用KRAS誘導(dǎo)系統(tǒng)可建立許多小鼠模型[16]。YOON等[17]研究表明,17%的胃腺癌發(fā)生KRAS的擴(kuò)增和突變,敲低KRAS可抑制人胃腺癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。

PDGF-β是由PDGF和血管內(nèi)皮生長因子組成的蛋白家族成員。編碼的前蛋白被蛋白水解處理以產(chǎn)生血小板衍生生長因子亞單位β,其可與相關(guān)的血小板衍生生長因子亞單位α同聚或異聚。這些蛋白結(jié)合并激活PDGF受體酪氨酸激酶,在廣泛的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。該基因突變與腦膜瘤相關(guān)。22號和17號染色體之間的相互易位,位于該基因和Ⅰ型膠原α1基因所在的位點(diǎn),與皮膚纖維肉瘤(一種罕見的皮膚腫瘤)有關(guān)。有研究表明,PDGF-β在胃癌組織中高表達(dá),并與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān),檢測PDGF-β水平可作為判斷胃癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的指標(biāo)之一[18],PDGF/PDGFR信號通路的激活通過調(diào)節(jié)多種下游通路,包括磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路和絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路,與癌癥增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成相關(guān)。因此,靶向PDGF/PDGFR信號通路已被證明是癌癥治療的有效策略[19]。

COPB2是典型的細(xì)胞質(zhì)蛋白復(fù)合體的1個亞基,其與雙賴氨酸基序結(jié)合,并與高爾基衍生的非網(wǎng)格蛋白包被的囊泡結(jié)合。在蛋白質(zhì)生物合成過程中,COPB2以囊泡的形式將其他蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)送至高爾基體[20]。COPB2參與調(diào)節(jié)多種腫瘤的生物學(xué)行為,可在肺癌[20]、乳腺癌[21]等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)。AN等[22]研究表明,COPB2在胃癌中過表達(dá),沉默COPB2可抑制細(xì)胞增殖,減少細(xì)胞集落的形成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示,miR-335-5p上調(diào)表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力,表達(dá)譜芯片篩選結(jié)合生物信息學(xué)靶基因預(yù)測分析取得交集,共獲得212個miR-335-5p的靶基因,并富集在20個腫瘤相關(guān)的信號通路中。mRNA和Western blot驗(yàn)證結(jié)果表明,靶基因CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β是miR-335-5p調(diào)控胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的重要癌基因。檢索文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫均顯示,CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β廣泛參與胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移表型。本研究發(fā)現(xiàn),miR-335-5p上調(diào)表達(dá)可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力,所篩選的212個靶基因,包括CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β均富集于20個與腫瘤相關(guān)的信號通路中,CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β是經(jīng)生物信息學(xué)方法表達(dá)譜芯片篩選的交集基因,并經(jīng)PCR實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,由此說明miR-335-5p作為胃癌中的抑癌基因,其抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力是由靶向調(diào)控CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β所介導(dǎo)的。miR-335-5p上調(diào)表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力與抑制靶基因CREB1、AKT3、COPB2、ARNT2、TGF-β2、KRAS、PDGF-β的表達(dá)有關(guān)。此外,表達(dá)譜芯片結(jié)合生物信息學(xué)手段是重要的組學(xué)篩選的方法,本研究中所發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因所富集的信號通路和篩選的核心基因均能說明miR-335-5p在胃癌中是影響表型的關(guān)鍵分子,是調(diào)控胃癌生物學(xué)表型的觀察窗口。另外,通過表達(dá)譜芯片結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)的具有高度相關(guān)性的癌基因和信號通路為探討miR-335-5p調(diào)控胃癌的機(jī)制提供了線索和依據(jù)。