Tim-3及其配體CEACAM1與特發(fā)性膜性腎病患者腎功能進展的相關(guān)性研究*

趙 寶,黃 偉,蘇斌濤,熊 飛,崔天盆△

武漢市第一醫(yī)院:1.中心實驗室;2.檢驗科;3.腎內(nèi)科,湖北武漢 430022

特發(fā)性膜性腎病(IMN)是一種嚴重的自身免疫性疾病,也是成人原發(fā)性腎病綜合征最常見的病理亞型。其發(fā)病機制主要是由于抗磷脂酶A2受體(PLA2R)等自身抗體與相應的靶抗原結(jié)合后形成免疫復合物沉積于腎小球基底膜,導致腎組織發(fā)生損傷。近年來,IMN發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。研究表明,IMN患者的疾病活動度與腎功能進展密切相關(guān),評估IMN患者的腎功能對監(jiān)測疾病活動度具有重要意義。然而,由于IMN的復雜性,對IMN疾病活動度的評估是一項非常具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。因此,探索與IMN患者腎功能相關(guān)的生物標志物不僅為預測疾病活動提供了更多有效信息,還可能增加對潛在致病機制的理解。

T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)是一種與配體結(jié)合后可抑制Th1細胞活化的T細胞表面抑制性分子,其在調(diào)節(jié)免疫應答和誘導免疫耐受中發(fā)揮著重要而復雜的作用[2]。癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子1(CEACAM1)是另一種參與T細胞抑制的跨膜糖蛋白,其在活化T細胞上表達并廣泛分布在粒細胞、淋巴細胞、上皮細胞和腫瘤細胞中[3]。CEACAM1是Tim-3的一種配體,CEACAM1通過介導Tim-3在細胞毒性T細胞上的信號傳導導致T細胞衰竭[4]。研究發(fā)現(xiàn),異常的Tim-3及CEACAM1表達與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、類風濕關(guān)節(jié)炎和抗中性粒細胞質(zhì)抗體相關(guān)性血管炎等多種自身免疫疾病發(fā)展密切相關(guān)[5-8]。而其在IMN患者中的表達情況尚不明確,本文旨在研究IMN患者血清Tim-3及其配體CEACAM1的表達,并進一步探討其與IMN腎功能進展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年7月至2022年8月于本院腎內(nèi)科住院并經(jīng)腎組織活檢確診為IMN的80例患者為IMN組,其中男52例、女28例,平均年齡(56.36±11.22)歲。納入標準:(1)年齡>18歲;(2)首次確診且就診前未接受過激素或免疫抑制劑相關(guān)治療;(3)病歷資料完整。排除標準:(1)非IMN及其他自身免疫性疾病者;(2)腫瘤、心臟病及嚴重感染者;(3)病歷資料不全者。選擇同期77例體檢健康者作為對照組,其中男40例、女37例,平均年齡(53.48±7.26)歲。納入標準:(1)年齡>18歲;(2)血尿常規(guī)及肝腎功能相關(guān)指標均正常。IMN組與對照組年齡、性別比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得所有研究者知情同意。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集 查閱IMN患者腎組織活檢住院時的臨床資料。(1)基礎(chǔ)資料:如年齡,性別等。(2)生化指標:如白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)、24 h尿蛋白定量(24 h UmTp)。(3)免疫指標:抗PLA2R抗體。估算腎小球濾過率(eGFR)計算參考文獻[9]。

1.2.2標本采集與試劑 收集患者促凝血標本室溫放置30 min后,1 000×g離心10 min,收集上層血清并分裝凍存于-80 ℃冰箱備用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IMN患者血清Tim-3、CEACAM1水平。人Tim-3(編號:DY2365)及人CEACAM1(編號:DY2244)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自美國R&D公司。

1.2.3Tim-3、CEACAM1檢測 (1)使用Tim-3、CEACAM1包被抗體室溫孵育過夜,0.05%TBST洗滌液洗滌3次;(2)加5%牛血清的磷酸鹽緩沖液封閉2 h,洗滌3次;(3)加標準品及血清標本孵育2 h(Tim-3檢測使用1%牛血清的磷酸鹽緩沖液10倍稀釋標本,CEACAM1檢測無需稀釋標本),洗滌3次;(4)加Tim-3、CEACAM1檢測抗體孵育2 h,洗滌3次;(5)加辣根過氧化物酶避光孵育20 min,洗滌3次;(5)先加入A液(過氧化氫)后加入B液(四甲基聯(lián)苯胺)孵育10 min,加終止液終止反應。(6)酶標儀于450、630 nm處檢測吸光度值,根據(jù)標準曲線計算Tim-3、CEACAM1水平。

1.2.4觀察指標 比較IMN組與對照組ALB、TP、BUN、CREA、UA等一般臨床指標及血清Tim-3、CEACAM1水平;根據(jù)eGFR水平將IMN組分為腎功能正常組[eGFR>90 mL/(min·1.73 m2)],腎功能下降組[eGFR≤90 mL/(min·1.73 m2)],比較不同腎功能水平IMN患者一般臨床指標及血清Tim-3、CEACAM1水平,分析IMN患者血清Tim-3、CEACAM1水平與一般臨床指標相關(guān)性,分析影響IMN患者腎功能下降的危險因素。

2 結(jié) 果

2.1IMN組與對照組一般臨床指標比較 與對照組比較,IMN組Tim-3、CEACAM1、BUN、CREA、UA水平升高,ALB、TP、eGFR水平降低(P<0.05),見表1。

表1 IMN組與對照組一般臨床指標比較或n/n或M(P25,P75)]

2.2腎功能正常組與腎功能下降組一般臨床指標比較 根據(jù)eGFR水平將IMN組分為腎功能正常組43例,腎功能下降組37例。與腎功能正常組比較,腎功能下降組Tim-3、BUN、CREA、24 h UmTp水平升高,ALB、eGFR水平降低(P<0.05),兩組血清CEACAM1、TP、UA、抗PLA2R抗體水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

表2 腎功能正常組與腎功能下降組一般臨床指標比較或n/n或M(P25,P75)]

2.3IMN組血清Tim-3、CEACAM1水平與一般臨床指標相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示,IMN患者血清Tim-3水平與ALB、TP、eGFR呈負相關(guān)(r=-0.266、-0.229、-0.374,P<0.05),與CREA呈正相關(guān)(r=0.289,P<0.05)。血清CEACAM1水平與各指標均無相關(guān)性(P>0.05),見表3。

表3 IMN組血清Tim-3、CEACAM1水平與一般臨床指標相關(guān)性分析

2.4多因素Logistic回歸分析IMN患者腎功能下降的影響因素 以腎功能狀態(tài)為因變量,以表1、2中差異有統(tǒng)計學意義的變量為自變量,進行單因素Logistic回歸分析(由于eGFR是由年齡、CREA計算而來,因此Logistic回歸分析將其排除在外)。結(jié)果顯示,Tim-3、BUN是IMN患者腎功能下降的影響因素(P<0.05),以P<0.1納入多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,Tim-3、BUN水平升高是IMN患者腎功能下降的獨立危險因素(P<0.05),見表4。

表4 IMN患者腎功能下降的影響因素logistic回歸分析

3 討 論

IMN是一種器官特異性的自身免疫性疾病,其發(fā)病機制主要是由于補體激活和上皮細胞中的免疫復合物沉積導致基底膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變和腎小球濾過屏障的損傷,最終導致大量蛋白尿。IMN的臨床特征主要是低白蛋白血癥、高脂血癥及大量蛋白尿。本研究結(jié)果顯示,與對照組比較,IMN組BUN、CREA、UA水平升高,ALB、TP水平降低。據(jù)報道,約1/3的IMN患者會發(fā)展成終末期腎病,給患者及家屬帶來沉重負擔[10]。因此,探討與IMN患者腎功能進展相關(guān)的危險因素對于預測IMN患者的疾病活動度尤為重要。

Tim-3是一種最初在活化的Th1細胞上被鑒定為負調(diào)節(jié)先天性和適應性炎癥反應的跨膜分子,進一步的研究發(fā)現(xiàn)其在自然殺傷細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等不同免疫細胞上均廣泛表達,并與高遷移率族蛋白1、半乳糖凝集素-9和CEACAM1等多種配體結(jié)合發(fā)揮作用[11]。在腎臟疾病中,Tim-3是患者急性腎損傷期間腎臟免疫細胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,Tim-3表達激活Toll樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號,并加劇腎臟對急性缺血/再灌注損傷的炎癥反應[12]。Tim-3也可通過激活NF-κB信號傳導促進腎巨噬細胞的炎癥表型,從而導致糖尿病腎病進展中的足細胞損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn)IMN組血清Tim-3水平高于對照組,提示Tim-3很可能也是通過某種信號通路促進IMN的發(fā)生發(fā)展。在一些腫瘤模型中,阻斷Tim-3和其他檢查點抑制劑可以增強抗腫瘤相關(guān)免疫反應,達到抑制腫瘤生長的作用[14]。提示Tim-3很可能對IMN疾病治療及預后也存在潛在作用,進一步研究Tim-3與IMN的關(guān)系具有重要意義。

研究表明,eGFR、24 h UmTp和抗PLA2R抗體是評價IMN患者疾病活動度的良好指標,約70%的IMN患者存在抗PLA2R抗體,且該抗體具有高度特異性,其水平不受性別和年齡差異的影響[15]。24 h UmTp是評價IMN患者預后的良好指標,對于檢測疾病療效具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn),不同腎功能水平的IMN患者血清Tim-3、24 h UmTp水平差異明顯,而抗PLA2R抗體水平差異不大,這可能是由于IMN患者個體間抗PLA2R抗體水平差異較大,且并非所有的IMN患者都存在該抗體,有一小部分IMN患者抗體水平呈陰性。進一步研究發(fā)現(xiàn),IMN患者24 h UmTp及抗PL2R抗體與Tim-3及其配體CEACAM1無明顯關(guān)系,多因素Logistic回歸分析也顯示其不是影響腎功能下降的危險因素,與CHEN等[16]研究結(jié)果不一致,CHEN等[16]研究表明,血清Tim-3水平與膜性腎病患者抗PLA2R抗體相關(guān),可能原因是本研究僅納入IMN患者,未考慮一部分繼發(fā)性膜性腎病患者,納入的IMN患者人群具有一定的個體差異性,患者的腎功能損傷程度不同,與腎功能相關(guān)的指標對腎功能損傷的敏感性也可能存在差異。本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),IMN患者血清Tim-3水平與ALB、TP、eGFR呈負相關(guān),與CREA呈正相關(guān)。與CHEN等[16]研究結(jié)果一致,膜性腎病患者Tim-3水平與eGFR相關(guān),提示Tim-3可作為檢測IMN患者腎功能的潛在生物學標志物。單因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,Tim-3是IMN患者腎功能下降的影響因素,通過調(diào)整混雜因素后進一步行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,Tim-3水平升高是IMN患者腎功能下降的獨立危險因素,這表明血清Tim-3水平與IMN患者腎功能進展存在一定的關(guān)聯(lián)性,可作為評價IMN患者腎功能進展的潛在血清學指標。

CEACAM1是癌胚抗原家族成員之一,其在細胞膜上表達,并與受體、整合素和細胞外基質(zhì)蛋白相互作用以調(diào)節(jié)血管生成和免疫反應。研究發(fā)現(xiàn),CEACAM1和Tim-3之間的順式和反式作用決定了Tim-3的耐受誘導功能,通過順式結(jié)合CEACAM1能夠促進Tim-3的成熟并增強表達[17]。目前,國內(nèi)外研究學者對Tim-3及其配體CEACAM1進行了廣泛的研究和探討。在國內(nèi),許多研究人員認為Tim-3及其配體CEACAM1是腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵因素,并提出了與Tim-3相關(guān)的新型癌癥治療策略[18-19]。在國外,研究人員發(fā)現(xiàn)Tim-3及其配體CEACAM1對于肝炎病毒感染和自身免疫性疾病等領(lǐng)域也具有一定的臨床意義[20-22]。這些研究表明Tim-3和CEACAM1在免疫調(diào)節(jié)和疾病治療中發(fā)揮著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)IMN組血清CEACAM1水平高于對照組,CEACAM1很可能與Tim-3一同參與了IMN的發(fā)生發(fā)展。YU等[23]研究發(fā)現(xiàn),Tim-3/CEACAM1通路參與CD8+T細胞衰竭,并可能激活NF-κB/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3/胱天蛋白酶-1通路,增加促炎細胞因子分泌。在本研究中,不同腎功能水平的IMN患者血清CEACAM1水平并無明顯差異,且血清CEACAM1與臨床指標間的相關(guān)性也并不明顯,因此,血清CEACAM1水平可能不是有效檢測IMN腎功能進展的標志物。關(guān)于Tim-3/CEACAM1在IMN疾病中的具體作用機制還有待進一步的探討。

綜上所述,IMN患者血清Tim-3、CEACAM1水平升高,Tim-3/CEACAM1很可能在IMN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。由于IMN病情復雜,且本研究屬于單中心回顧性研究,納入的IMN病例數(shù)較少,研究結(jié)果可能存在部分偏倚,后續(xù)需納入更多的病例樣本進一步研究。探討Tim-3及其配體CEACAM1在IMN患者中的表達情況,有助于進一步研究其在疾病中的具體作用機制,為IMN的深入研究提供更多的依據(jù)。