脂類和補體聯(lián)合檢測在肺結(jié)核鑒別診斷中的應用價值*

鄒 琛,張 潔,曹 蕓,張 泓,張舒林,徐潤灝△

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院檢驗科,上海 200062;2.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院檢驗科,上海 200001;3.上海交通大學醫(yī)學院免疫學與微生物學系,上海 200025;4.上海市公共衛(wèi)生臨床中心結(jié)核病研究中心,上海 201508

結(jié)核病是威脅人類健康的主要傳染病之一,據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2022年全球結(jié)核病報告》顯示,2021年約160萬人因結(jié)核病死亡[1]。我國的結(jié)核病發(fā)病總數(shù)位居全球第二,國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《2021年全國法定傳染病疫情概況》中指出,在我國的乙類傳染病中,肺結(jié)核發(fā)病人數(shù)、死亡人數(shù)均位居第2[2]。由此可見,結(jié)核病尤其是肺結(jié)核的早診早治仍是我國面臨的巨大挑戰(zhàn)。

肺結(jié)核患者臨床表現(xiàn)及影像學檢查缺乏特異性,早期不易與肺炎、肺癌等其他肺部疾病區(qū)分[3-4]。血液中各類成分眾多,其中不少蛋白、代謝物、微小RNA在肺結(jié)核發(fā)生過程中發(fā)生顯著變化[5-6],因此血液學檢查被認為在肺結(jié)核輔助診斷和鑒別診斷中有著巨大潛能。依托于前期進行的血漿蛋白組學分析,在本研究中,筆者進一步檢測了肺結(jié)核患者血漿中的載脂蛋白(Apo)A1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、脂蛋白a[Lp(a)]、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、小而密低密度脂蛋白膽固醇(sdLDL-C)、游離脂肪酸(NEFA)這12個脂類項目,以及補體C1q(C1q)、補體C3(C3)、補體C4(C4)、總補體活性(CH50)這4個補體項目,共16項臨床常用指標,以探索其在肺結(jié)核鑒別診斷中可能存在的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年5月至2021年10月在上海市公共衛(wèi)生臨床中心及上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院就診的肺部疾病患者252例為研究對象,其中肺結(jié)核初治患者85例(TB組),非小細胞肺癌(NSCLC)初治患者87例(NSCLC組),社區(qū)獲得性肺炎(CAP)初治患者80例(CAP組)。TB組中男48例、女37例,年齡25～80歲,平均(59.51±13.08)歲,納入標準:通過患者的臨床表現(xiàn)、影像學診斷、病原學診斷,根據(jù)《肺結(jié)核診斷》標準[7],確診為肺結(jié)核,并排除肺外結(jié)核、肺部惡性腫瘤、合并其他嚴重感染的可能。NSCLC組中男53例、女34例,年齡27～82歲,平均(62.76±10.59)歲,納入標準:經(jīng)影像學和組織病理學檢查確診為NSCLC,排除同時伴有肺結(jié)核的可能;CAP組中男44例、女36例,年齡25～83歲,平均(62.23±14.47)歲,納入標準:臨床診斷為肺部感染,排除同時伴有肺結(jié)核的可能。同時選取上海市公共衛(wèi)生臨床中心及上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院的90例體檢健康者作為對照組,其中男52例、女38例,年齡25～82歲,平均(60.48±12.74)歲,納入標準:排除肺部腫瘤及感染,且肝、腎功能等指標無明顯異常。各組均排除血脂異常者、并發(fā)其他部位腫瘤者、自身免疫疾病患者等。各組年齡和性別比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究通過上海市公共衛(wèi)生臨床中心倫理委員會批準(2019-S009-02)。

1.2方法

1.2.1樣本前處理 使用乙二胺四乙酸抗凝管收集各組患者的空腹全血標本3 mL,2 685×g離心10 min,分離得到血漿,置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待測,避免反復凍融。

1.2.2樣本檢測 采用H7600全自動生化分析儀(日本Hitachi公司)對ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、Lp(a)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、sdLDL-C、NEFA、C1q、CH50進行檢測。其中ApoA1、ApoB、Lp(a)試劑盒購于四川邁克生物股份有限公司;ApoA2、ApoC2、ApoC3試劑盒購于北京利德曼生化股份有限公司;C1q試劑盒購于寧波美康生物科技有限公司,檢測方法均為免疫比濁法。TC、TG、HDL-C、LDL-C、CH50試劑盒購于日本富士膠片和光純藥株式會社,TC的檢測方法為膽固醇氧化酶法,TG的檢測方法為去游離甘油法,HDL-C的檢測方法為抗體阻礙法,LDL-C的檢測方法為選擇保護法,CH50的檢測方法為脂質(zhì)體免疫測定法。sdLDL-C試劑盒購于北京柏定生物工程有限公司,檢測方法為過氧化氫酶法。NEFA試劑盒購于德賽診斷系統(tǒng)有限公司,檢測方法為酶比色法。采用BNII全自動特定蛋白分析儀(德國SIMENS公司)及其配套試劑盒對C3、C4進行檢測,檢測方法為免疫比濁法。

2 結(jié) 果

2.1各組不同指標水平比較 TB組血漿ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA水平低于對照組(P<0.05),Lp(a)、C3、C4水平高于對照組(P<0.05);TB組血漿ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、TC、TG、HDL-C、LDL-C、NEFA、C3水平低于NSCLC組和CAP組(P<0.05),此外sdLDL-C、C1q水平僅低于NSCLC組(P<0.05),CH50水平高于CAP組(P<0.05),見表1。

表1 各組不同指標水平比較或M(P25,P75)]

2.2各項指標鑒別診斷肺結(jié)核效能的評估 ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3、TC、TG、HDL-C、LDC-C、NEFA、C3這11項指標在TB組與NSCLC組,TB組與CAP組中的比較,差異均有統(tǒng)計學意義且變化趨勢一致,將NSCLC組、CAP組合并為非結(jié)核病組(NTB)組,采用ROC曲線分析其對肺結(jié)核的鑒別診斷效能。鑒別診斷效能最佳的指標是ApoB,其曲線下面積(AUC)為0.799,靈敏度為74.12%,特異度為77.84%。見表2。

表2 各項指標及模型鑒別診斷肺結(jié)核的效能分析

2.3肺結(jié)核鑒別診斷模型的構(gòu)建和驗證

2.3.1模型的建立 隨機抽取80%的標本,即TB組68例及NTB組133例(其中NSCLC組69例、CAP組64例),組成訓練標本。將上述11項指標納入逐步法二元Logistic回歸分析,最終得到了由ApoB、C3、HDL-C和NEFA構(gòu)成的鑒別診斷模型Y=1/[1+eLogit(P)],式中Logit(P)=-5.29×ApoB-1.954×C3-2.333×HDL-C-1.903NEFA+9.32,見表3。模型系數(shù)綜合檢驗(χ2=183.06,P<0.05)和Hosmer-Lemeshow檢驗(χ2=9.427,P<0.05)結(jié)果顯示,模型擬合度良好。見表3。

表3 逐步法二元logistic回歸分析結(jié)果

2.3.2模型的效能分析 以模型Y作為新變量進行ROC曲線分析,其鑒別診斷肺結(jié)核的AUC為0.868(95%CI0.813～0.911),靈敏度為70.59%,特異度為89.47%,符合率為83.08%,見表2。

2.3.3模型的驗證 將剩余標本(TB組17例、NTB組34例)作為驗證標本,代入模型Y進行驗證。驗證標本中,TB組13例和NTB組29例判斷正確,靈敏度為76.47%,特異度為85.29%,符合率為82.35%。與訓練樣本的診斷符合率基本相同。

2.4鑒別模型與部分現(xiàn)有檢測方法的比較 將TB組68例及NTB組133例(其中NSCLC組69例、CAP組64例)患者的痰涂片抗酸染色結(jié)果、結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)結(jié)果與本研究得到的4項指標鑒別模型(ApoB+HDL-C+NEFA+C3)結(jié)果進行比較,其中抗酸染色的特異度最高(100.00%),其次為鑒別模型(88.62%);T-SPOT.TB的靈敏度最高(89.41%),其次為鑒別模型(71.76%)。此外,鑒別模型有著最高的總符合率(82.94%)。見表4。

表4 鑒別模型與部分現(xiàn)有檢測方法的比較

3 討 論

目前,高誤診率仍是我國肺結(jié)核診治中的難點,尤其是在部分社區(qū)醫(yī)療單位中,肺結(jié)核易被誤診為肺癌及肺炎。這是由于越來越多肺結(jié)核患者的病灶形態(tài)不典型,在胸部CT和X光檢查時缺乏特異性征象所致,且其早期臨床表現(xiàn)多為咳痰、發(fā)熱、咯血等,與其他肺部疾病極為相似[8-9]。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)雖然是診斷結(jié)核病的金標準,但其靈敏度低,培養(yǎng)時間長,給疾病的診斷、治療帶來了較大難度[5]。血液學檢查有著簡便、快速、無創(chuàng)、高效的特點,T-SPOT.TB等γ-干擾素釋放試驗作為常用的肺結(jié)核血液學檢查手段,有著較高的靈敏度,但其診斷肺結(jié)核的特異度較低[10],而多項血液指標聯(lián)合檢測能夠提升診斷的靈敏度及特異度,可能成為肺結(jié)核輔助診斷與鑒別診斷的新方向。

本研究顯示,與對照組比較,TB組血漿TC、HDL-C、LDL-C水平均降低,與HAN等[11]的研究結(jié)果一致。膽固醇在血液中常以脂蛋白的形式存在,主要為HDL-C和LDL-C。目前的研究結(jié)果顯示,肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展與膽固醇代謝有著密切聯(lián)系[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細胞內(nèi)膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶水平會明顯升高,導致細胞內(nèi)有更多的游離膽固醇酯化,形成過多脂滴,這些脂質(zhì)在巨噬細胞內(nèi)大量堆積,打破了機體脂代謝的動態(tài)平衡,這被認為是肺結(jié)核患者血漿各類膽固醇水平降低的原因[12-13]。也有觀點認為膽固醇代表著個體免疫力水平,膽固醇水平低下導致感染肺結(jié)核的風險增加,而結(jié)核感染后機體免疫力的下降,會使得血液中膽固醇進一步減少[14],鄭秀麗等[15]的研究結(jié)果顯示,高膽固醇飲食輔助治療后,肺結(jié)核患者的血清白蛋白水平升高,痰液結(jié)核桿菌轉(zhuǎn)陰率和肺部病灶吸收率也升高,病情逐步好轉(zhuǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)TB組患者血漿ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoC2、ApoC3這5項Apo水平降低,與CHEGOU等[16]及LIU等[17]的部分研究結(jié)果一致。Apo的主要功能是運輸脂類到各組織進行代謝,具有水平穩(wěn)定、進食后變化小、個體變異性低的特點[18]。其中ApoA1和ApoA2等是HDL-C中蛋白質(zhì)的主要組成部分,ApoB則是LDL-C中蛋白質(zhì)的主要組成部分,由于HDL-C及LDL-C等膽固醇在TB組患者血漿中水平降低,各類Apo水平亦同步降低。另據(jù)研究報道,機體在營養(yǎng)不良時,血漿Apo水平降低明顯[19],可見肺結(jié)核繼發(fā)的營養(yǎng)不良也可能是各類Apo水平較低的原因。值得注意的是,與TB組相反,ApoB在NSCLC組和CAP組血漿中水平升高(P<0.05),因此其在本研究納入的所有指標中有著最大的AUC,據(jù)此筆者認為ApoB在鑒別診斷肺結(jié)核中有著較大的潛能。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn)TB組患者NEFA水平降低。脂肪酸是結(jié)核分枝桿菌的重要營養(yǎng)物質(zhì)之一,人體內(nèi)被結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細胞可以通過清道夫受體介導的Apo內(nèi)化作用攝取血液來源的脂肪酸,胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌借機利用這些脂肪酸維持其在細胞中的生存,而細胞外的結(jié)核分枝桿菌則很可能從血液中的各類Apo處獲得脂肪酸[20-22]。這被認為是宿主血漿中的NEFA水平降低的原因。

越來越多的補體因子被認為和肺結(jié)核的發(fā)生有著明顯聯(lián)系,有學者認為某些基因突變會導致C3等補體因子水平升高,從而增加結(jié)核易感性[23],同時隨著結(jié)核患者組織損傷、肉芽腫和空洞形成等疾病進程的出現(xiàn),血漿C3、C4等補體因子水平會進一步升高[24-25],這與本研究結(jié)果相符。需要指出的是,雖然本研究發(fā)現(xiàn)血漿C3、C4等補體因子在TB組血漿中水平升高,但這些補體因子在NSCLC組和CAP組中亦呈高表達,最終本研究發(fā)現(xiàn)只有C3對肺結(jié)核有一定的鑒別診斷價值。

本研究基于現(xiàn)有的標本,通過逐步法二元Logistic回歸建模并消除多重共線性,最終得到由ApoB、C3、HDL-C、NEFA組成的輔助鑒別診斷模型(AUC為0.868),相較于現(xiàn)有的肺結(jié)核血液學檢測方法T-SPOT.TB,上述4項指標組成的鑒別診斷模型有著更高的特異度和總符合率。目前,在肺結(jié)核與其他肺部疾病的鑒別診斷中,一些常見血液學指標的變化往往沒有引起人們的重視。就目前的診斷技術而言,單一的血液學指標確實難以對肺結(jié)核等疾病進行精確判斷,而最佳指標組合的概念彌補了這一缺陷,通過不同的算法將各類差異指標聯(lián)用,能夠得到由最佳指標組合構(gòu)成的診斷模型,納入的指標類型越全面,模型的診斷效能則越出色,這可能是肺結(jié)核等疾病未來診斷的趨勢。在脂類和補體方面,本研究納入了16項指標,發(fā)現(xiàn)脂類指標ApoB、HDL-C、NEFA及補體指標C3參與組成的模型有著輔助鑒別診斷肺結(jié)核的潛能,這4項指標的檢測有著成熟的試劑盒,在臨床較為普及,或許可以與影像學檢查、病原學檢查互補,提高診斷的準確性。不過,脂類、補體指標的類型較為單一,其診斷效能存在一定的上限,若期望在診斷效能上繼續(xù)突破,還可加入細胞因子類、氨基酸類、微小RNA類等已被證實在肺結(jié)核患者血液中異常表達的指標,筆者也將對此進行深入探索。另一方面,血液指標聯(lián)用對肺結(jié)核輔助鑒別診斷的價值在國內(nèi)外均處于探索階段,因此,本文結(jié)論還需大樣本、多中心研究加以驗證。