絲狀真菌Podospora anserina AA11家族裂解多糖單加氧酶基因的鑒定和功能研究

杜文珍，李元敬，吳佳玲，陳思羽，姜亮，劉剛，謝寧

研究報(bào)告

絲狀真菌AA11家族裂解多糖單加氧酶基因的鑒定和功能研究

杜文珍1，李元敬2，吳佳玲1，陳思羽1，姜亮1，劉剛1，謝寧1

1. 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518060 2.華南師范大學(xué)材料與新能源學(xué)院，汕尾 516622

輔助活性蛋白家族(auxiliary activity family，AA family)中的裂解多糖單加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase, LPMO)能催化纖維素、幾丁質(zhì)和淀粉等多種難降解碳水化合物的氧化解聚。盡管目前對(duì)LPMO的酶學(xué)研究較多，但對(duì)基因失活的研究卻鮮有報(bào)道。本研究利用同源重組方法定點(diǎn)敲除絲狀真菌中AA11家族的5個(gè)基因()、()、()、()和()，分別構(gòu)建了單突變體ΔPaLPMO11A (ΔA)、ΔPaLPMO11B (ΔB)、ΔPaLPMO11C (ΔC)、ΔPaLPMO11D (ΔD)和ΔPaLPMO11E (ΔE)，然后通過(guò)遺傳雜交構(gòu)建所有多基因突變體。通過(guò)在不同碳源培養(yǎng)基上的表型分析、DAB和NBT染色以及纖維素酶活測(cè)定分析-野生型菌株與突變型菌株在生長(zhǎng)速率、有性生殖、氧化應(yīng)激和纖維素降解能力等方面的差異，揭示基因在菌株的生長(zhǎng)發(fā)育和木質(zhì)纖維素降解過(guò)程中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同纖維素碳源上，ΔBΔCΔE、ΔAΔBΔCΔE、ΔAΔCΔDΔE和ΔAΔBΔCΔDΔE突變型菌株的有性生殖能力降低，其余突變型菌株的孢子萌發(fā)效率、生長(zhǎng)速率和生殖能力幾乎沒(méi)有差異。PaLPMO11家族5個(gè)基因的同時(shí)缺失，會(huì)導(dǎo)致菌株利用各種碳源的能力明顯降低、生長(zhǎng)速率降低、孢子萌發(fā)率降低、子實(shí)體數(shù)減少、部分子實(shí)體發(fā)育異常、壽命縮短和降解纖維素的能力顯著下降，但仍有野生型45%以上的總纖維素酶活力。上述結(jié)果表明，基因可能參與的生長(zhǎng)發(fā)育、有性生殖、衰老和纖維素降解過(guò)程。本研究為系統(tǒng)闡述絲狀真菌中木質(zhì)纖維素降解的調(diào)控機(jī)制提供參考。

絲狀真菌；；；基因敲除；木質(zhì)纖維素降解

人類(lèi)使用的大多數(shù)燃料和化學(xué)品資源都來(lái)源于煤炭、石油和天然氣等不可再生的化石能源。隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和工業(yè)化規(guī)模的不斷擴(kuò)大，化石能源的過(guò)度消耗，引發(fā)了不可再生化石能源儲(chǔ)量枯竭、環(huán)境污染和全球變暖等一系列問(wèn)題，給全球環(huán)境保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。此外，不可再生化石燃料資源預(yù)計(jì)在未來(lái)40～50年內(nèi)耗盡[1]，因此，勘探和開(kāi)發(fā)可持續(xù)、生態(tài)友好和儲(chǔ)量大的可再生生物質(zhì)資源已成為近年來(lái)的熱點(diǎn)問(wèn)題，有望克服因消耗化石燃料帶來(lái)的環(huán)境污染和能源短缺等問(wèn)題。--木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源之一，它的年產(chǎn)量約為2×1011噸[2]，是獲得生物乙醇和替代化石燃料的理想可再生候選者之一。然而，迄今為止，大部分木質(zhì)纖維素資源尚未得到有效地利用，木質(zhì)纖維素資源的利用率甚至未能達(dá)到其總量的5%[3]。木質(zhì)纖維素主要由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素組成，其中纖維素含量占比通常最高[4]。纖維素是生物圈中含量最豐富的有機(jī)多糖，是獲取潔凈能源如基于乙醇的生物燃料和高附加值化學(xué)品的主要原料[5]。因而，提高纖維素的有效利用率是提高木質(zhì)纖維素資源利用率的重點(diǎn)。在自然界中，許多生物都能有效地降解利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，其中能分泌碳水化合物活性酶的絲狀真菌被認(rèn)為是關(guān)鍵的初級(jí)降解者[6]。

裂解多糖單加氧酶(lytic polysaccharide monoo-xy-genase，LPMO)是銅依賴(lài)的氧化還原酶，該酶通過(guò)氧化裂解頑固多糖鏈表面，使多糖易于處理以便進(jìn)一步酶促作用并最終降解[7]。LPMO廣泛存在于真菌、細(xì)菌、病毒和昆蟲(chóng)中，能催化纖維素、幾丁質(zhì)和淀粉等多種難降解頑固碳水化合物的氧化解聚。其在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)(carbohydrate-active enzymes database，CAZy) (http://www.cazy.org/)中被劃分到 AA9～AA11和AA13～AA16這7個(gè)不同的輔助活性家族(auxiliary activity family，AA family)中[8]。不同家族LPMO的氨基酸序列差異較大，但所有LPMO整體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，催化結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白樣的反向平行β-三明治核心結(jié)構(gòu)，活性位點(diǎn)位于該較為平坦的核心區(qū)域上，由兩個(gè)高度保守的組氨酸與金屬銅離子螯合形成的T型“組氨酸支架(histidine brace)”構(gòu)成，其中一個(gè)組氨酸是氨基末端殘基，另一個(gè)為側(cè)鏈組氨酸[9,10]。Hemsworth等[11]發(fā)現(xiàn)來(lái)自米曲霉()AA11家族的LPMO(AoAA11)對(duì)晶體幾丁質(zhì)具有活性，表明AoAA11具有與AA9和AA10的LPMO相似的三維結(jié)構(gòu)，包括核心的反向平行β-三明治結(jié)構(gòu)和具有保守“組氨酸支架”的銅活性位點(diǎn)。Wang等[12]從富士鐮刀菌()中獲得截?cái)嘈问降腖PMO11新型酶，稱(chēng)為FfAA11。該酶對(duì)α-幾丁質(zhì)和β-幾丁質(zhì)以及龍蝦殼均表現(xiàn)出氧化活性。近年來(lái)，Rieder等[13]發(fā)現(xiàn)煙曲霉()中的AA11B不具有假定的幾丁質(zhì)活性，而對(duì)N-乙酰葡糖胺的可溶性低聚物具有催化活性。St?pamo等[14]發(fā)現(xiàn)AfAA11A雖然缺少碳水化合物結(jié)合模塊，但對(duì)α-和β-幾丁質(zhì)仍具有相當(dāng)大的催化能力。結(jié)合以上研究可知，盡管LPMO11被假定具有幾丁質(zhì)酶活性，但AA11家族的部分成員對(duì)幾丁質(zhì)卻沒(méi)有催化活性。因此，LPMO11可能在真菌生理學(xué)中發(fā)揮著除幾丁質(zhì)酶催化活性外的其他作用[14]。

迄今為止，雖然已經(jīng)有大量關(guān)于LPMO酶學(xué)的研究，但對(duì)于真菌中基因失活的研究卻鮮有報(bào)道。此外，尚未有利用缺失基因的突變體進(jìn)行復(fù)雜多糖如纖維素、淀粉或幾丁質(zhì)的降解研究，因此其功能尚未得到充分的研究。通過(guò)比對(duì)41種常見(jiàn)真菌的基因組發(fā)現(xiàn)，是含有最多降解木質(zhì)纖維素蛋白酶類(lèi)基因的子囊真菌[15]，又因其生命周期短，易于培養(yǎng)和進(jìn)行分子遺傳操作，因此它是用來(lái)研究木質(zhì)纖維素降解的良好模式生物[16]。盡管LPMOs在真菌界中廣泛存在，但屬于AA11家族的LPMO尚未得到充分研究。中5個(gè)基因功能仍有待進(jìn)一步被揭示與研究，本研究以期為闡明LPMO11在真菌生理學(xué)中發(fā)揮的不同作用提供一定的參考價(jià)值。

本研究以為實(shí)驗(yàn)菌株，利用同源重組方法分別構(gòu)建5個(gè)基因和缺失單突變型菌株，通過(guò)遺傳雜交獲得所有多基因突變體。通過(guò)突變型菌株與野生型菌株在生長(zhǎng)速率、有性生殖、氧化應(yīng)激和纖維素降解等方面的差異性分析，揭示AA11家族的基因在中的明確作用與功能，為系統(tǒng)闡述絲狀真菌中木質(zhì)纖維素降解的調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

(1) 菌株和質(zhì)粒：野生型菌株(WT)Δmus51::phleoR菌株(用腐草霉素抗性基因代替基因編碼序列所得到的菌株?；蚓哂行迯?fù)真菌DNA突變的功能，敲除可顯著提高同源重組效率[17])、Δmus51:: HygroR菌株、Δmus51:: NourR菌株和Δmus51:: GeneR菌株。質(zhì)粒pBC-Geneticin、pBC-Hygromycin、pBC- Phleomycin和pBC-Nourseothricin分別用于突變體構(gòu)建。

(2) 培養(yǎng)基：菌株培養(yǎng)條件以及M2基礎(chǔ)培養(yǎng)基等常用培養(yǎng)基的配置方法可在Genome Project (http://podospora.i2bc.paris-saclay.fr/ methods.php)檢索得到。木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基：在M2培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別用木質(zhì)素(lignin powder)、木屑(wood shaving)和微晶纖維素(avicel)等量取代糊精作為碳源，制備3種不同成分的木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基。

(3) 主要試劑和儀器：抗生素遺傳霉素(geneticin)和腐草霉素(phleomycin)購(gòu)自南京都萊生物技術(shù)有限公司；諾爾斯菌素(nourseothricin)購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司；潮霉素(hygromycin)、羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)和其他常用試劑均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；Go Taq?DNA Polymerase、Ex Taq?DNA Polymerase、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase均購(gòu)自TaKaRa；2×Phanta?Max Master Mix(Dye Plus)和Plasmid Mini Kit均由南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn)；Gel Extraction Kit和Cycle-Pure kit購(gòu)自O(shè)MEGA；溶壁酶購(gòu)自Sigma；M5 Fungal Genomic DNA Kit購(gòu)于北京聚合美生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒和氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitro blue tetrazolium，NBT)試劑購(gòu)自Solarbio，4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)和4-硝基苯基-β-D-纖維二糖(pNPC)均由Aladdin生產(chǎn)。

1.2 PaLPMO11生物信息學(xué)分析

從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得5個(gè)假定的基因、、、和，分別命名為和，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為PaLPMO11A (XP_001906381.1)、PaLPMO11B (XP_001912736.1)、PaLPMO11C (XP_001911580------.1)、PaLPMO11D (XP_001911666.1)和PaLPMO11E (XP_001909751.1)。在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索得到7條來(lái)自真菌子囊菌和輪蟲(chóng)的LPMO11蛋白序列。分別為：(BAE61530.1)、(XP 748042.1)、(CCT67099.1)、(EAA31701.1)、(XP 750980.1)、(EAA35129.1)和(UJR20201.1)。通過(guò)分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析軟件MEGA 11.0對(duì)12個(gè)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析建樹(shù)，使用muscle算法對(duì)編譯后的序列進(jìn)行比對(duì)，并手動(dòng)調(diào)整，采用MEGA 11.0中的鄰近法(neighbor-joining method)構(gòu)建基于這些序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，利用自展法(bootstrap)設(shè)置1000次重復(fù)檢驗(yàn)。使用I-TASSER在線網(wǎng)站(https://zhanglab. ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)和UCSF Chimera等軟件對(duì)5個(gè)目的基因的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)和保守氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 構(gòu)建PaLPMO11家族突變體

運(yùn)用Split-marker[18]方法在WT菌株中分別敲除和五個(gè)目的基因。構(gòu)建AA11家族5個(gè)單突變型菌株技術(shù)原理如圖1所示。常規(guī)PCR分別擴(kuò)增出目的基因上下游的同源臂片段(約1000 bp)以及相對(duì)應(yīng)的抗性標(biāo)記基因片段。其中選用nourseothricin標(biāo)記，選用hygromycin B標(biāo)記，和選用geneticin標(biāo)記，選用phleomycin標(biāo)記。融合PCR對(duì)常規(guī)PCR純化后得到的目的基因上下游的同源臂片段和抗性標(biāo)記基因片段進(jìn)行融合連接，構(gòu)建敲除表達(dá)盒(引物序列如表1所示)。將融合片段轉(zhuǎn)化至ΔPaMus51菌株的原生質(zhì)體后，分別使用含有nourseothricin、hygromycin、geneticin或phleomycin抗性的抗性平板篩選抗性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子與WT菌株雜交，篩選出具有目的基因抗性而不具有原生質(zhì)體抗性的小孢子，即獲得可穩(wěn)定遺傳的突變型菌株。PCR和基因測(cè)序驗(yàn)證5個(gè)單突變型菌株是否構(gòu)建成功。使用相應(yīng)的不同交配型菌株進(jìn)行遺傳雜交，雜交后篩選同時(shí)具有相應(yīng)抗性的小孢子，以此構(gòu)建AA11家族的10個(gè)雙重突變型菌株、10個(gè)三重突變型菌株、5個(gè)四重突變型菌株和五重突變型菌株，PCR驗(yàn)證具有相同抗性雙重突變型菌株ΔAΔD和五重突變體菌株是否構(gòu)建成功。

1.4 表型分析

(1) M2培養(yǎng)基培養(yǎng)：將不同交配型的WT和31個(gè)AA11家族突變型菌株接種在M2固體培養(yǎng)基上，并于光照條件下27℃恒溫培養(yǎng)1周。在培養(yǎng)過(guò)程中觀察并記錄各個(gè)菌株的生長(zhǎng)速率、菌落大小、菌落形態(tài)、色素沉著、子實(shí)體的形成以及子囊孢子的產(chǎn)生、噴發(fā)和萌發(fā)情況，進(jìn)行顯微觀察并記錄子實(shí)體的數(shù)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 構(gòu)建PaLPMO11家族突變體的流程圖

(2) 木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基培養(yǎng)：將不同交配型的WT和突變型菌株混勻破碎，分別接種于添加了木質(zhì)素、木屑和微晶纖維素的M0培養(yǎng)基上，于27℃光照條件下培養(yǎng)兩周。在培養(yǎng)過(guò)程中觀察并記錄各個(gè)菌株的生長(zhǎng)速率、菌落大小、菌落形態(tài)、色素沉著、子實(shí)體的形成以及子囊孢子的產(chǎn)生、噴發(fā)和萌發(fā)情況。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 菌絲ROS水平分析

將WT、ΔE和ΔAΔBΔCΔDΔE不同交配型菌株混勻破碎后分別接種在M2培養(yǎng)基上，于27℃黑暗培養(yǎng)3天，分別使用DAB染色試劑盒和NBT染色試劑對(duì)菌絲進(jìn)行染色，檢測(cè)菌絲組織中過(guò)氧化物和超氧化物的積累[19]。在過(guò)氧化物酶的存在下，過(guò)氧化氫與DAB反應(yīng)會(huì)生成棕褐色沉淀；NBT在超氧化物酶催化下，與超氧離子反應(yīng)生成藍(lán)紫色沉淀。菌絲染色強(qiáng)度與過(guò)氧化物和超氧化物的積累成正比關(guān)系[20]。置于水平搖床避光孵育3 h，菌絲體出現(xiàn)顏色變化時(shí)除去染色液，使用PBS洗滌3次，終止顯色反應(yīng)。觀察比對(duì)各菌株菌絲染色程度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 纖維素酶活測(cè)定

將不同交配型的WT、ΔE和ΔAΔBΔCΔDΔE菌株分別接種到纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，以促進(jìn)纖維素作用酶的分泌。27℃、150 r/min、光照條件下培養(yǎng)3天、5天、7天、9天，取上清液離心后即得粗酶液。參照國(guó)標(biāo)QB2583-2003及Dashtban[21]和Thankappan[22]的方法對(duì)濾紙酶活(filter paper activity，F(xiàn)PA)、內(nèi)切葡萄糖苷酶活(endoglucosidase activity，EG activity)、外切葡聚糖酶活(cellobiohydrolase activity，CBH activity)和β-葡萄糖苷酶活(β-D-glucosidase activity，BG activity)進(jìn)行測(cè)定，具體操作方法如下。每組樣品均設(shè)置3組重復(fù)。

表1 本研究使用的引物

1.6.1 FPA和EG activity測(cè)定

FPA和EG酶活單位(U)定義為：在實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1 μmol葡萄糖所需的酶量。纖維素酶可以降解纖維素底物，生成還原性單糖。還原性單糖與3,5-二硝基水楊酸(DNS)沸水浴后發(fā)生顯色反應(yīng)，生成棕紅色氨基化合物。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)顏色深淺與酶解反應(yīng)單位時(shí)間內(nèi)釋放的還原性單糖濃度呈正比，在540 nm波長(zhǎng)處可以檢測(cè)到其吸光度。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶解反應(yīng)釋放的還原性單糖含量，從而計(jì)算酶活。FPA實(shí)驗(yàn)以濾紙為反應(yīng)底物，EG activity實(shí)驗(yàn)以CMC-Na為反應(yīng)底物。將粗酶液與底物混合，50℃水浴1 h，進(jìn)行反應(yīng)。加入DNS后輕輕混合，沸水浴5 min后立即置于冰上冷卻，取200 μL反應(yīng)液于96孔板中，540 nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品均設(shè)置空白對(duì)照組。

1.6.2 CBH activity和BG activity測(cè)定

CBH和BG酶活單位(U)定義為：在實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1 μmol硝基苯酚(pNP)所需的酶量。無(wú)色底物pNPG 和pNPC在β-葡萄糖苷酶和外切葡聚糖酶的催化下，水解成有色物質(zhì)pNP，在405 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。根據(jù)pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶解反應(yīng)釋放的pNP含量，從而計(jì)算酶活。將粗酶液與底物混合，50℃水浴30 min，進(jìn)行反應(yīng)。水浴后立即置于冰上冷卻，向各離心管中加入2% Na2CO3終止反應(yīng)。取200 μL反應(yīng)液于96孔板中，405 nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品均設(shè)置空白對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 PaLPMO11家族蛋白的生物信息學(xué)分析

2.1.1 PaLPMO11的系統(tǒng)發(fā)育分析

真菌米曲霉(4MAI_A)和煙曲霉(7P3U_A)編碼的LPMO11蛋白相似度為39.63%，由此推測(cè)AA11家族LPMO氨基酸----序列差異雖然較大，但構(gòu)成組氨酸支架的兩個(gè)組氨酸和AA11家族獨(dú)有的軸位點(diǎn)酪氨酸側(cè)鏈均嚴(yán)格保守，該酪氨酸側(cè)鏈不直接參與金屬銅離子的配位，而是與其附近的丙氨酸相互作用[11]。5個(gè)基因編碼的蛋白PaLPMO11A、PaLPMO11B、PaLPMO11C、PaLPMO11D和PaLPMO11E與AoAA11蛋白以及AfAA11蛋白均有較高的一致性(均在27.9%以上)。與AoAA11蛋白相似度分別為37.04%、27.93%、35.94%、45.07%和40.64%；與AfAA11蛋白相似度分別為37.43%、49.02%、48.6%、38.39%和49.05%。因此，推測(cè)5個(gè)編碼的蛋白可能是與AoAA11和AfAA11蛋白類(lèi)似的裂解多糖單加氧酶。使用MEGA 11.0對(duì)12個(gè)LPMO11蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2A)。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，PaLPMO11D和AoAA11、AfAA11B和FfAA11親緣關(guān)系近；AfAA11A和PaLPMO11C處于同一分支上，表明親緣關(guān)系最近；其次是與PaLPMO11E關(guān)系較近；而PaLPMO11A和PaLPMO11B位于該進(jìn)化樹(shù)的最外側(cè)。由圖2B可知，5個(gè)PaLPMO11蛋白在催化位點(diǎn)核心保守區(qū)域顯示出較高相似度，預(yù)測(cè)兩個(gè)高度保守的組氨酸會(huì)與金屬銅離子螯合成T形的組氨酸支架，從而構(gòu)成催化活性位點(diǎn)[23]。而PaLPMO11B在多序列比對(duì)結(jié)果中顯示缺少軸位點(diǎn)酪氨酸側(cè)鏈，因此在預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中，無(wú)法預(yù)測(cè)出其催化活性位點(diǎn)的保守氨基酸所處位置(圖3)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果和多序列比對(duì)結(jié)果顯示，推測(cè)5個(gè)PaLPMO11蛋白可能分屬于AA11家族的不同亞家族。--

2.1.2 PaLPMO11蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)

和基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與活性位點(diǎn)保守氨基酸預(yù)測(cè)如圖3所示。5個(gè)PaLPMO11蛋白預(yù)測(cè)具有與AoAA11蛋白相似的整體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，均具有典型的反向平行β-三明治核心結(jié)構(gòu)。將除PaLPMO11B外的4個(gè)PaLPMO11預(yù)測(cè)蛋白的催化活性位點(diǎn)的保守氨基酸與AoAA11蛋白的活性位點(diǎn)的保守氨基酸進(jìn)行比較，所有原子的均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)在0.77～0.97 ?范圍內(nèi)顯示出較高水平的結(jié)構(gòu)重疊。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析、多序列比對(duì)和蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)結(jié)果推測(cè)，的5個(gè)LPMO11蛋白可能是與AoAA11類(lèi)似的蛋白，可以通過(guò)氧化還原反應(yīng)裂解糖苷鍵，從而降解某種頑固多糖[11]。---

A: PaLPMO11蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。AA11蛋白氨基酸序列來(lái)源于CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI網(wǎng)站，基因庫(kù)序列號(hào)顯示在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中。B: LPMO11s和PaLPMO11s的部分氨基酸序列比對(duì)。三角形表示參與銅離子配位的兩個(gè)絕對(duì)保守的組氨酸殘基，以及AA11家族特有的軸向酪氨酸殘基。

2.2 ΔPaLPMO11突變體的構(gòu)建

2.2.1五個(gè)基因敲除表達(dá)盒的構(gòu)建

按1.3構(gòu)建PaLPMO11家族突變體所述方法構(gòu)建突變體。利用4種不同的抗性標(biāo)記geneticin、nourseothricin、hygromycin和phleomycin代替5個(gè)基因序列，敲除這5個(gè)基因，并對(duì)5個(gè)單突變體進(jìn)行抗性驗(yàn)證和PCR驗(yàn)證。以WT基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到5個(gè)基因上游片段PaLPMO11-5′和下游片段PaLPMO11-3′約1000 bp片段。以質(zhì)粒pBC- Hygromycin、pBC-Nourseothricin、pBC-Geneticin或pBC-Phleomycin DNA為模板，擴(kuò)增獲得HygroR基因片段(3657 bp)、NourR基因片段(1773 bp)、GeneR基因片段(2342 bp)或PhleR基因片段(3100 bp)。將各個(gè)基因的上下游片段和抗性標(biāo)記基因片段進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，分別構(gòu)建的敲除表達(dá)盒-5′-HygroR和HygroR--3′；的敲除表達(dá)盒-5′-NourR和NourR--3′；的敲除表達(dá)盒-5′-GeneRand GeneR--3′；的敲除表達(dá)盒-5′-PhleR和PhleR--3′以及的敲除表達(dá)盒-5′-GeneR和GeneR--3′。5個(gè)基因敲除表達(dá)盒的構(gòu)建結(jié)果見(jiàn)附圖1和附圖2。通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，將敲除表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到ΔPaMus51菌株的原生質(zhì)體中，篩選具有相應(yīng)抗性的轉(zhuǎn)化子，利用兩對(duì)驗(yàn)證引物(verify__1F和5T、verify__2F和3T)對(duì)篩選出來(lái)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證(驗(yàn)證引物序列見(jiàn)表1)并純化，擴(kuò)增得到的同源重組片段與目的序列大小一致，序列比對(duì)結(jié)果與目標(biāo)序列一致。以上結(jié)果均表明，目的基因片段與抗性基因片段在目的敲除基因位點(diǎn)發(fā)生同源重組置換，證實(shí)抗性標(biāo)記基因成功整合在目的基因座中，成功構(gòu)建PaLPMO11家族5個(gè)基因缺失菌株。

A: 目標(biāo)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。B：PaLPMO11蛋白與AoAA11蛋白的整體疊加。AoAA11蛋白用黃色標(biāo)注，PaLPMO11蛋白用藍(lán)色標(biāo)注。C：PaLPMO11蛋白(藍(lán)色)與AoAA11蛋白(黃色)的活性位點(diǎn)的重疊。

2.2.2 ΔPaLPMO11突變體的PCR驗(yàn)證

單突變體構(gòu)建成功后，通過(guò)遺傳雜交構(gòu)建10個(gè)雙突變型菌株ΔAΔB(ΔPaLPMO11AΔΔPaLPMO11B)、ΔAΔC、ΔAΔD、ΔAΔE、ΔBΔC、ΔBΔD、ΔBΔE、ΔCΔD、ΔCΔE和ΔDΔE，10個(gè)三重突變型菌株ΔAΔBΔC、ΔAΔBΔD、ΔAΔBΔE、ΔAΔCΔD、ΔAΔCΔE、ΔAΔDΔE、ΔBΔCΔD、ΔBΔCΔE、ΔBΔDΔE和ΔCΔDΔE，5個(gè)四重突變型菌株ΔAΔBΔCΔD、ΔAΔBΔCΔE、ΔAΔBΔDΔE、ΔAΔCΔDΔE和ΔBΔCΔDΔE以及缺失所有PaLPMO11家族基因的五重突變體菌株ΔAΔBΔCΔDΔE。具有相同抗性雙重突變型菌株ΔAΔD和五重突變體菌株ΔAΔBΔCΔDΔE均通過(guò)PCR驗(yàn)證。ΔPaLPMO11突變體的PCR驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)附圖3。

2.3 PaLPMO11家族基因的缺失影響P. anserina利用碳源的能力

2.3.1 菌株在M2培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)發(fā)育

M2培養(yǎng)基是以糊精作為唯一碳源、能滿(mǎn)足生長(zhǎng)和發(fā)育的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將WT和突變型菌株接種到M2培養(yǎng)基上，27℃培養(yǎng)1周。除ΔAΔBΔCΔDΔE外的突變型菌株均不受影響，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)WT和其他突變型菌株在菌落大小、形態(tài)和色素沉著、子實(shí)體形成以及子囊孢子產(chǎn)生、噴發(fā)和萌發(fā)方面存在明顯差異(數(shù)據(jù)未顯示)。而ΔAΔBΔCΔDΔE出現(xiàn)色素沉著的時(shí)間和子實(shí)體生成時(shí)間與其他菌株出現(xiàn)差異，且菌落大小、菌絲密度、子實(shí)體形成數(shù)量及子囊孢子噴發(fā)數(shù)量都遠(yuǎn)低于WT (圖4)。與WT相比，ΔAΔBΔCΔDΔE的生長(zhǎng)有最顯著的延遲，且提前進(jìn)入衰老狀態(tài)。培養(yǎng)第7天起，ΔAΔBΔCΔDΔE開(kāi)始停止生長(zhǎng)并伴隨明顯的色素沉著。結(jié)果表明，PaLPMO11家族單個(gè)基因在的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中似乎沒(méi)有發(fā)揮關(guān)鍵作用，但5個(gè)基因同時(shí)敲除，會(huì)引起菌株生長(zhǎng)發(fā)育和有性生殖明顯延緩并導(dǎo)致菌株提前衰老。

2.3.2 菌株在木質(zhì)素培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)發(fā)育

能夠高效利用木質(zhì)纖維素作為碳源，通過(guò)分泌胞外酶使其能夠有效地滲透和降解植物生物質(zhì)[24]。為了確定PaLPMO11家族基因在木質(zhì)纖維素利用中的作用，將WT與31個(gè)突變型菌株進(jìn)行表型分析比較。用木質(zhì)素、木屑和微晶纖維素等量代替糊精作為唯一的碳源，評(píng)估突變體利用木質(zhì)纖維素的能力。

在以純木質(zhì)素作為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，WT菌絲呈紡絲狀生長(zhǎng)，在培養(yǎng)基上只形成菌絲體，而不生成子實(shí)體[25]。除ΔAΔBΔCΔDΔE外，其余菌株生長(zhǎng)速度很快，菌絲體在培養(yǎng)6天后幾乎覆蓋了整個(gè)培養(yǎng)基。在木質(zhì)素平板上，ΔAΔBΔCΔDΔE的生長(zhǎng)直徑與菌絲密度明顯減少(圖5)，在培養(yǎng)5天時(shí)，生長(zhǎng)直徑比WT減少了19%；在培養(yǎng)7天時(shí)，直徑減少了近31%。結(jié)果表明，ΔAΔBΔCΔDΔE利用木質(zhì)素的能力降低。除ΔAΔBΔCΔDΔE外，其他突變型菌株的生長(zhǎng)與WT幾乎沒(méi)有差異。這表明，5個(gè)基因之間可能在降解木質(zhì)素以獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)程中具有補(bǔ)償效應(yīng)，在PaLPMO11家族基因一個(gè)或多個(gè)基因缺失的情況下，菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)并沒(méi)有顯著改變，而PaLPMO11家族的基因全部缺失時(shí)，菌株的生長(zhǎng)和菌絲量都會(huì)相應(yīng)地下降減少。

2.3.3 菌株在木屑培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)發(fā)育

在以木屑為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，除ΔAΔBΔCΔDΔE外，WT和其他突變型菌株的子實(shí)體在培養(yǎng)6天后開(kāi)始發(fā)育，數(shù)量眾多，并在2天后噴發(fā)具有活性的子囊孢子。且除ΔAΔBΔCΔDΔE以外，其他突變型菌株的子實(shí)體萌發(fā)時(shí)間、生長(zhǎng)速率和菌絲密度與WT并無(wú)明顯差異。而5個(gè)基因的同時(shí)缺失會(huì)導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)速率延緩，子囊孢子的形成時(shí)間延遲，子實(shí)體的產(chǎn)生顯著減少，這與M2基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的觀察結(jié)果一致。

圖4 WT與ΔAΔBΔCΔDΔE菌株在M2培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)發(fā)育情況

將不同交配型菌株混合破碎，取5 μL菌懸液滴在M2培養(yǎng)基中央，27℃光照培養(yǎng)3天(d)后，拍照并記錄菌株生長(zhǎng)直徑。野生型與其他突變株間生長(zhǎng)直徑并無(wú)顯著差異。檢驗(yàn)：*<0.05，**<0.01，***<0.001。

圖5 WT與ΔAΔBΔCΔDΔE菌株在木質(zhì)素培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)發(fā)育情況

將不同交配型菌株混合破碎，取5 μL菌懸液滴在木質(zhì)素培養(yǎng)基中央，27℃光照培養(yǎng)3天(d)后，拍照并記錄菌株生長(zhǎng)直徑。圖中數(shù)字表示突變型菌株與野生型菌株相比，生長(zhǎng)直徑減少的百分比。野生型與其他突變株間生長(zhǎng)直徑并無(wú)顯著差異。檢驗(yàn)：*<0.05，**<0.01，***<0.001。

圖6 WT與ΔAΔBΔCΔDΔE菌株在木屑培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)發(fā)育情況

將不同交配型菌株混合破碎，取5 μL菌懸液滴在木屑培養(yǎng)基中央，27℃光照培養(yǎng)9天(d)后，拍照并觀察培養(yǎng)基上及培養(yǎng)皿蓋上的子實(shí)體密度。子實(shí)體為可見(jiàn)的黑色小點(diǎn)。野生型與其他突變株間子實(shí)體數(shù)量并無(wú)明顯差異。

絲狀真菌的子實(shí)體是區(qū)分營(yíng)養(yǎng)生殖和有性生殖的重要生殖器官[26]；在真菌生命周期中，子實(shí)體的形成是最為復(fù)雜的發(fā)育過(guò)程之一，需要消耗大量的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[27,28]。觀察噴發(fā)到培養(yǎng)基蓋子上的子囊孢子密度(圖7A)，發(fā)現(xiàn)敲除基因的突變型菌株噴發(fā)的孢子數(shù)明顯少于WT和其他突變體，ΔAΔBΔCΔDΔE的產(chǎn)孢數(shù)是最少的(圖片未完全展示)。為了量化菌株產(chǎn)孢數(shù)，對(duì)WT和敲除基因的16個(gè)突變型菌株進(jìn)行子實(shí)體數(shù)量統(tǒng)計(jì)與顯微鏡觀察(圖7B)。每個(gè)菌株均設(shè)置了3組重復(fù)。由圖7D可知，ΔBΔCΔE子實(shí)體數(shù)量為5739，ΔAΔBΔCΔE子實(shí)體數(shù)量為5296，ΔAΔCΔDΔE子實(shí)體數(shù)量為4812，ΔAΔBΔCΔDΔE子實(shí)體數(shù)量為379，與WT的子實(shí)體數(shù)量7216相比，分別減少了20%、27%、33%和95%，均存在顯著差異。統(tǒng)計(jì)上述菌株子囊孢子的萌發(fā)率，WT菌株子囊孢子萌發(fā)率為95.5%，ΔBΔCΔE子囊孢子萌發(fā)率為92%，ΔAΔBΔCΔE子囊孢子萌發(fā)率為81.5%，ΔAΔCΔDΔE子囊孢子萌發(fā)率為70%，ΔAΔBΔCΔDΔE子囊孢子萌發(fā)率為51.5% (圖7E)。子實(shí)體是真菌體內(nèi)的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，孢子在子實(shí)體內(nèi)形成并于成熟后噴發(fā)，是真菌進(jìn)行繁殖的主要途徑[29]。ΔAΔBΔCΔDΔE菌株進(jìn)入有性生殖階段后，會(huì)生成部分異常的子實(shí)體，部分子實(shí)體無(wú)內(nèi)容物，不含有活性的子囊孢子(圖7C)，因而無(wú)法正常排出子囊孢子，導(dǎo)致噴發(fā)到培養(yǎng)基蓋子上的子囊孢子密度遠(yuǎn)小于其他菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基因缺失的突變體的子囊孢子萌發(fā)率和子實(shí)體數(shù)量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明基因可能與子囊孢子萌發(fā)和子實(shí)體形成有關(guān)；除ΔAΔBΔCΔDΔE外，WT和其余突變體的生長(zhǎng)速率和菌絲密度無(wú)明顯差異。

圖7 WT和部分PaLPMO11E基因缺失突變型菌株的子囊孢子密度圖、顯微觀察、子實(shí)體數(shù)量統(tǒng)計(jì)與子囊孢子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)

A：野生型和部分基因缺失突變型菌株的子囊孢子密度圖。菌株于木屑培養(yǎng)基上培養(yǎng)8天后會(huì)將孢子噴發(fā)至培養(yǎng)皿蓋子上，對(duì)接有子囊孢子的培養(yǎng)皿蓋拍照。B：野生型和突變型菌株于倒置顯微鏡下的觀察結(jié)果。不同交配型菌株于M2培養(yǎng)基27℃光照培養(yǎng)5天后，置于倒置顯微鏡下觀察子實(shí)體形態(tài)與數(shù)量。標(biāo)尺：500 μm。C：WT及ΔΔBΔCΔDΔE子實(shí)體放大圖。在M2培養(yǎng)基27℃光照培養(yǎng)5天后，挑取子實(shí)體置于載玻片上，用蓋玻片蓋上碾壓，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。標(biāo)尺：100 μm。D：子實(shí)體數(shù)量統(tǒng)計(jì)。不同交配型菌株在M2培養(yǎng)基上27℃光照7天后，在顯微鏡下對(duì)野生型和突變型菌株的子實(shí)體數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。E：子囊孢子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)。將不同交配型菌株在M2培養(yǎng)基上進(jìn)行雜交，培養(yǎng)7天后開(kāi)始噴發(fā)子囊孢子，用接種孢子培養(yǎng)基接住噴發(fā)出來(lái)的子囊孢子。每個(gè)菌株挑取200個(gè)子囊孢子于萌發(fā)孢子培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)1天后，統(tǒng)計(jì)子囊孢子的萌發(fā)率。檢驗(yàn): *<0.05，**<0.01，***<0.001。

這表明基因可能參與了有性生殖過(guò)程，而PaLPMO11家族5個(gè)基因的同時(shí)缺失，會(huì)導(dǎo)致菌株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)和有性生殖過(guò)程進(jìn)一步受損，不僅表現(xiàn)為菌落的生長(zhǎng)直徑明顯降低和子實(shí)體數(shù)量大幅減少，還表現(xiàn)為生成異常子實(shí)體，導(dǎo)致菌株的低育性。由此推測(cè)上述突變型菌株可能無(wú)法從木屑中正常獲取足夠的碳源，利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力受損，導(dǎo)致菌株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)期間能量?jī)?chǔ)備不足，無(wú)法正常供應(yīng)有性生殖過(guò)程的能量需求，從而造成菌株有性生殖過(guò)程部分受損，其中ΔAΔBΔCΔDΔE的表型最為明顯。

2.3.4 菌株在微晶纖維素平板上的生長(zhǎng)發(fā)育

在以微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，野生型菌株生成的子實(shí)體以接種點(diǎn)為中心呈環(huán)狀分布[20]，通過(guò)計(jì)算培養(yǎng)皿上的成熟子實(shí)體數(shù)量來(lái)衡量菌株的生育力。由圖8A可知，敲除基因的突變型菌株形成更大更彌散的子實(shí)體環(huán)，子實(shí)體分布呈現(xiàn)發(fā)散狀，且子實(shí)體數(shù)量少于WT，這一點(diǎn)與菌株在木屑平板上生長(zhǎng)得到的結(jié)果一致。這一表型在ΔAΔBΔCΔDΔE菌株上尤為明顯，ΔAΔBΔCΔDΔE的子實(shí)體數(shù)量與WT相比下降了19倍。在其他突變型菌株中沒(méi)有觀察到這種表型，它們所生成的子實(shí)體環(huán)與WT無(wú)太大差異，均在培養(yǎng)皿中央生成成熟的子實(shí)體環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基因可能在的有性生殖過(guò)程中發(fā)揮了作用，基因缺失菌株會(huì)形成一個(gè)更大更彌散的子實(shí)體環(huán)，子實(shí)體密度減少(圖8B)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，基因缺失菌株可能無(wú)法充分利用微晶纖維素碳源以維持自身生長(zhǎng)發(fā)育所需，導(dǎo)致有性生殖過(guò)程在一定程度上受到影響，因而生成的子實(shí)體數(shù)量減少。PaLPMO11家族基因的同時(shí)敲除，會(huì)對(duì)的生長(zhǎng)發(fā)育和有性繁殖造成更大程度的影響，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)發(fā)育明顯延緩，生成空心子實(shí)體，子實(shí)體數(shù)量與子囊孢子萌發(fā)率顯著下降。而PaLPMO11家族基因間可能發(fā)揮相互代償?shù)淖饔?，一個(gè)基因或多個(gè)基因缺失時(shí)，PaLPMO11家族的其他基因可能發(fā)揮類(lèi)似的功能，以代償其他基因的缺失，從而保證菌株可以維持正常的生理過(guò)程。

2.4 過(guò)量生成的過(guò)氧化氫可能加速了菌株的衰老

活性氧(ROS)是細(xì)胞有氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，主要由超氧陰離子自由基和過(guò)氧化氫組成[30]。生物體內(nèi)存在一系列抗氧化系統(tǒng)使ROS的產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài)，當(dāng)ROS在生物體內(nèi)過(guò)量產(chǎn)生時(shí)，會(huì)開(kāi)始攻擊細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡[30,31]。對(duì)WT、ΔE和ΔAΔBΔCΔDΔE菌株菌絲的ROS水平進(jìn)行分析，染色結(jié)果如圖9所示。NBT染色觀察發(fā)現(xiàn)，WT和ΔE菌絲的藍(lán)紫色顯色最深，且WT和ΔE之間菌絲染色并無(wú)明顯差異，而ΔAΔBΔCΔDΔE藍(lán)紫色染色最淺，說(shuō)明ΔAΔBΔCΔDΔE超氧化物的分泌量明顯減少。DAB染色觀察發(fā)現(xiàn)，除培養(yǎng)第1天外，DAB染色結(jié)果與NBT染色結(jié)果一致，WT和ΔE染色程度無(wú)差異，均呈現(xiàn)明顯的棕褐色，ΔAΔBΔCΔDΔE菌絲染色程度最淺。培養(yǎng)1天時(shí)，ΔAΔBΔCΔDΔE菌絲密度低于WT，但其DAB染色程度卻深于WT，結(jié)果表明ΔAΔBΔCΔDΔE菌株可能在培養(yǎng)第1天時(shí)分泌了大量的過(guò)氧化氫。由上述結(jié)果推測(cè)，單突變型菌株體內(nèi)可能存在其他相似功能的基因能彌補(bǔ)其缺失，因而其染色結(jié)果與WT無(wú)明顯差異。再結(jié)合在M2和木質(zhì)素平板上的表型分析結(jié)果，ΔAΔBΔCΔDΔE菌株均出現(xiàn)提前衰老的現(xiàn)象。由此推測(cè)，ΔAΔBΔCΔDΔE衰老的潛在機(jī)制可能是由于菌株生長(zhǎng)前期體內(nèi)積累了過(guò)量過(guò)氧化氫，而過(guò)量的過(guò)氧化氫可能會(huì)導(dǎo)致菌株進(jìn)入過(guò)度氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致分子氧化損傷增加，從而促進(jìn)了突變菌株的衰老過(guò)程，導(dǎo)致突變型菌株提前進(jìn)入衰老狀態(tài)。

2.5 PaLPMO11基因參與纖維素降解過(guò)程

纖維素可以用于乙醇生產(chǎn)等工業(yè)生物煉制應(yīng)用，而纖維素的降解利用卻受到如物化特性、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及組成成分等因素的阻礙[32,33]。因此，提高木質(zhì)纖維素的降解效率、減少工業(yè)生產(chǎn)成本對(duì)于木質(zhì)纖維素的工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。濾紙酶活是包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三種纖維素降解酶在內(nèi)的總纖維素酶活[34]。單突變體ΔE的四種纖維素酶活力與WT差異不大，而ΔAΔBΔCΔDΔE的酶活降低最為顯著。培養(yǎng)7天時(shí)，ΔAΔBΔCΔDΔE的FPA酶活是WT酶活的53%，EG酶活是WT酶活的61%，CBH酶活是WT酶活的61%，BG酶活是WT酶活的32%；菌株培養(yǎng)9天時(shí)，ΔAΔBΔCΔDΔE的FPA活性、EG活性、CBH活性和BG活性分別是WT酶活的45%、58%、36%和35% (圖10)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單個(gè)基因的缺失，對(duì)總纖維素酶活影響不明顯，而5個(gè)基因的同時(shí)缺失，總纖維素酶活顯著下降，但卻仍有野生型45%以上的活力，說(shuō)明基因之間可能存在功能冗余，且5個(gè)基因功能可能與纖維素降解有關(guān)。

圖8 WT與突變型菌株在微晶纖維素培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)發(fā)育情況與對(duì)比圖

子實(shí)體為可見(jiàn)的黑色小點(diǎn)。將不同交配型菌株混合破碎，取5 μL菌懸液滴在微晶纖維素培養(yǎng)基中央，培養(yǎng)8天后拍照。除基因缺失突變型菌株外，未發(fā)現(xiàn)野生型與其他突變株間子實(shí)體數(shù)量與分布存在顯著差異。A：野生型和基因缺失突變型菌株于微晶纖維素培養(yǎng)基培養(yǎng)的結(jié)果圖。B：野生型和突變型菌株放大對(duì)比圖。

3 討論

目前僅有來(lái)自米曲霉、富士鐮刀-菌和煙曲霉的LPMO11蛋白被純化和表征[11～13]。所有已知真菌的LPMO均具有保守的中央反向平行β-折疊核心結(jié)構(gòu)，而暴露在平坦核心結(jié)構(gòu)表面的金屬銅離子會(huì)與兩個(gè)高度保守的組氨酸提供的3個(gè)氮原子配位，形成T形的組氨酸支架，從而構(gòu)成催化活性位點(diǎn)[10,35]。全基因組序列中存在5個(gè)可能編碼LPMO11蛋白序列的基因，分別為和。進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，5個(gè)PaLPMO11蛋白均含有構(gòu)成催化活性位點(diǎn)的兩個(gè)高度保守的組氨酸殘基和β-三明治折疊核心結(jié)構(gòu)，而PaLPMO11B缺乏AA11家族獨(dú)有的軸位點(diǎn)酪氨酸側(cè)鏈。因此推測(cè)5個(gè)PaLPMO11蛋白可能屬于AA11家族的不同亞家族，可以通過(guò)氧化還原反應(yīng)裂解糖苷鍵，從而降解某種難降解多糖。

圖9 DAB和NBT染色分析野生型菌株與突變型菌株菌絲ROS水平

將不同交配型菌株混合破碎，取5 μL菌懸液滴在M2培養(yǎng)基中央。黑暗培養(yǎng)1、2、3天(d)后，用DAB和NBT對(duì)菌株菌絲進(jìn)行染色。

將100 μL菌懸液接種于50 mL 微晶纖維素液體培養(yǎng)基中，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3、5、7、9天(d)，提取粗酶液，測(cè)定不同菌株的纖維素酶活。檢驗(yàn)：*<0.05，**<0.01，***<0.001。

多項(xiàng)研究表明，是一種壽命有限的絲狀真菌，其衰老的表型為：菌株生長(zhǎng)速率和生殖能力的下降、氣生菌絲形成的減少以及生長(zhǎng)停滯會(huì)伴隨著明顯的色素沉著[36,37]。本研究也發(fā)現(xiàn)ΔAΔBΔCΔDΔE在M2和木質(zhì)素培養(yǎng)基上均表現(xiàn)出異常的菌落形態(tài)和顯著的生長(zhǎng)減少，與WT的蓬松菌落表面不同，ΔAΔBΔCΔDΔE菌株的環(huán)狀菌落僅形成稀疏的氣生菌絲；生殖能力顯著下降，僅在內(nèi)圈生成少數(shù)子實(shí)體；培養(yǎng)5天后，ΔAΔBΔCΔDΔE加速了外圈色素的過(guò)度積累(圖4，圖5)。子實(shí)體是真菌體內(nèi)的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，孢子在子實(shí)體內(nèi)形成并于成熟后噴發(fā)，是真菌繁殖的主要途徑，該過(guò)程需要消耗大量的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[26,29]。如圖6、圖7和圖8所示，基因可能與子實(shí)體分布、形成和子囊孢子萌發(fā)有關(guān)。同時(shí)敲除PaLPMO11家族的5個(gè)基因，會(huì)導(dǎo)致菌株子實(shí)體數(shù)量明顯減少和生成部分異常子實(shí)體，進(jìn)而造成有性生殖部分受損。ΔAΔBΔCΔDΔE菌株子實(shí)體數(shù)相較于WT減少95%，子囊孢子萌發(fā)率僅為51.5%，說(shuō)明PaLPMO11家族基因可能是控制菌株有性生殖的關(guān)鍵基因。適量的過(guò)氧化氫可以作為一種信號(hào)分子，發(fā)揮一定的生理作用，但高濃度的過(guò)氧化氫可能會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡[38]。根據(jù)前人的研究報(bào)道，用400 μmol/L的過(guò)氧化氫會(huì)誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降[39]；在中，WT菌株體內(nèi)過(guò)氧化氫釋放量會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，菌株培養(yǎng)后期釋放的過(guò)氧化氫量約是培養(yǎng)前期的3倍，證實(shí)了衰老與氧化應(yīng)激的增加有關(guān)[40]；在水稻中，基因的突變會(huì)導(dǎo)致過(guò)氧化氫的積累，從而導(dǎo)致葉片過(guò)早衰老[41]。在M2培養(yǎng)基上培養(yǎng)的第1天，ΔAΔBΔCΔDΔE菌株產(chǎn)生了大量過(guò)氧化氫(圖9)，再結(jié)合前面表型分析所得結(jié)果推測(cè)，過(guò)量的過(guò)氧化氫可能引發(fā)了ΔAΔBΔCΔDΔE菌株過(guò)度氧化應(yīng)激狀態(tài)，增強(qiáng)了自由基對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，從而促進(jìn)了突變菌株的衰老過(guò)程。綜上，中5個(gè)基因的完全缺失會(huì)導(dǎo)致菌株出現(xiàn)嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷、形態(tài)變化和壽命縮短等情況。因而，PaLPMO11家族基因在絲狀真菌的生長(zhǎng)發(fā)育和有性生殖過(guò)程中可能是必不可少的。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)PaLPMO11家族基因功能冗余，5個(gè)基因間可能相互協(xié)調(diào)調(diào)控碳源利用與菌株的生長(zhǎng)發(fā)育、有性生殖和衰老，一個(gè)或多個(gè)基因缺失時(shí)，其他基因可能在一定程度上能替代或補(bǔ)充其功能，使能夠應(yīng)對(duì)AA11家族單個(gè)或多個(gè)基因的缺失。在41種常見(jiàn)的真菌基因組中，是含有最多降解木質(zhì)纖維素蛋白酶類(lèi)基因的絲狀真菌[15]，具有強(qiáng)大的木質(zhì)纖維降解能力，能夠?qū)⒛举|(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化成如生物乙醇等不同的高附加值產(chǎn)品[42]。將作為真菌降解木質(zhì)纖維素的模式生物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)一些新的木質(zhì)纖維素降解相關(guān)基因和酶，闡明這些酶和基因在真菌中的作用機(jī)制，有望為深入了解真菌降解復(fù)雜多糖、提高生物能源生產(chǎn)效率等領(lǐng)域的研究提供參考[16,43]。如圖10所示，單突變體的濾紙酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活和β-葡萄糖苷酶活與WT沒(méi)有顯著差異，而5個(gè)基因的同時(shí)缺失，會(huì)導(dǎo)致菌株總纖維素酶活顯著下降，但卻仍有野生型45%以上的酶活力。在中，基因缺失突變體降解纖維素的效率比WT提高了近兩倍[44]；和漆酶基因亞家族1的突變體降解纖維素的能力明顯下降[25,45]；證實(shí)了它們均參與了纖維素降解過(guò)程。在本研究中，出乎意料的是，PaLPMO11家族基因家族貢獻(xiàn)了接近一半的纖維素酶活力。根據(jù)結(jié)果推測(cè)，基因之間可能存在功能冗余，且PaLPMO11家族的5個(gè)基因功能可能與纖維素降解有關(guān)，PaLPMO11家族的裂解多糖單加氧酶的完全失活可能會(huì)改變的纖維素降解機(jī)制。

綜上所述，中AA11家族的裂解多糖單加氧酶基因參與菌株的生長(zhǎng)發(fā)育、有性生殖、衰老和纖維素降解過(guò)程。本研究結(jié)果為系統(tǒng)闡述絲狀真菌中木質(zhì)纖維素降解的調(diào)控機(jī)制提供參考。

附加材料見(jiàn)文章電子版www.chinagene.cn。

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Identification and functional study of AA11 family polysaccharide monooxygenase genes in filamentous fungus

Wenzhen Du1, Yuanjing Li2, Jialing Wu1, Siyu Chen1, Liang Jiang1, Gang Liu1, Ning Xie1

The lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO) in the auxiliary active protein family (AA family) catalyzes the oxidative depolymerization of various refractory carbohydrates including cellulose, chitin and starch. While accumulating studies investigate the enzymology of LPMO, the research on the inactivation ofgenes has been rarely explored. In this study, fivegenes()()()()()of the AA11 family in the filamentous funguswere knocked out by homologous recombination. Single mutants ΔPaLPMO11A (ΔA), ΔPaLPMO11B (ΔB), ΔPaLPMO11C (ΔC), ΔPaLPMO11D (ΔD) and ΔPaLPMO11E (ΔE) were constructed, and then all polygenic mutants were constructed via genetic crosses. The differences in the growth rate and sexual reproduction between wild type and mutant strains were observed on different carbon source media. The alteration of oxidative stress and cellulose degradation ability were found on DAB and NBT staining and cellulase activity determination. These results implicated thatgenes play a key role in the growth, development, and lignocellulose degradation of. The results showed that the spore germination efficiency, growth rate and reproductive capacity of mutant strains including ΔBΔCΔE, ΔAΔBΔCΔE, ΔAΔCΔDΔE and ΔAΔBΔCΔDΔE was significantly decreased on different cellulose carbon sources and the remaining strains have no difference. The reduced utilization of various carbon sources, the growth rate, the spore germination rate, the number of fruiting bodies, the normal fruiting bodies, the shortened life span and the ability to degrade cellulose were found in strains which all five genes in the PaLPMO11 family were deleted. However, the strain still had 45% cellulase activity compared to wild type. These results suggest thatgenes may be involved in the growth and development, sexual reproduction, senescence and cellulose degradation of. This study provides information for systematically elucidating the regulatory mechanism of lignocellulose degradation in filamentous fungus.

filamentous fungi;;; gene knockout; lignocellulose degradation

2023-08-21;

2023-10-28;

2023-11-10

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2021YFA0910800)，廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2021A1515012166，2021A1515012118)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31601014，22078199)資助[Supported by the National Key R&D Program of China (No. 2021YFA0910800), the Basic and Applied Basic Research Fund of Guangdong Province (Nos. 2021A1515012166, 2021A1515012118), and the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31601014, 22078199)]

杜文珍，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：微生物遺傳學(xué)。E-mail: 2100251038@email.szu.edu.cn

謝寧，博士，副教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：微生物遺傳學(xué)。E-mail: ning.xie@szu.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-223

(責(zé)任編委: 劉鋼)