寧鄉(xiāng)豬皮下脂肪與肌內(nèi)脂肪組織轉(zhuǎn)錄組差異分析

王芳，張躍博，蔣謙，印遇龍，譚碧娥，陳家順

研究報告

寧鄉(xiāng)豬皮下脂肪與肌內(nèi)脂肪組織轉(zhuǎn)錄組差異分析

王芳1,2,3，張躍博1,2，蔣謙1,3，印遇龍1,2,3，譚碧娥1,2,3，陳家順1,2,3

1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動物營養(yǎng)基因組與種質(zhì)創(chuàng)新研究中心，長沙 410128 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽資源(豬)評價利用重點實驗室，長沙 410128 3. 畜禽產(chǎn)品品質(zhì)調(diào)控湖南省重點實驗室，長沙 410128

為了比較分析寧鄉(xiāng)豬皮下脂肪(subcutaneous fat，SAF)和肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat，IMF)組織脂肪沉積的分子機制，本文利用RNA-seq技術(shù)鑒定和分析寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF組織中差異基因表達譜。選取6頭250日齡健康狀況良好、種內(nèi)個體體重相近(約85 kg)的雄性寧鄉(xiāng)豬為實驗材料，采集SAF與IMF組織樣品。通過對兩個脂肪組織轉(zhuǎn)錄組測序并進行GO (Gene Ontology)功能注釋及KEGG (and Genomes)信號通路富集分析，得到與脂肪沉積和脂質(zhì)代謝相關(guān)的差異基因。為驗證測序數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性，本研究隨機選取6個差異基因進行qRT-PCR驗證。結(jié)果表明，寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF組織中有2406個基因差異表達，其中1422個基因表達上調(diào)，984個基因表達下調(diào)。通過GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要通過參與類固醇生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、甘油磷脂代謝及自噬途徑等與脂質(zhì)代謝相關(guān)途徑，調(diào)控寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF的沉積。KEGG通路富集結(jié)果顯示，差異基因主要富集在脂質(zhì)結(jié)合、脂肪酸代謝過程、甘油酯代謝過程、脂類生物合成等與脂質(zhì)代謝相關(guān)的生物學(xué)過程。qRT-PCR結(jié)果與測序結(jié)果一致，表明測序結(jié)果可靠。通過對寧鄉(xiāng)豬SAF與IMF組織進行轉(zhuǎn)錄組測序以及生物信息學(xué)分析，篩選到、、、、、、、、、、和等基因與脂質(zhì)代謝相關(guān)，這些基因可能在寧鄉(xiāng)豬SAF與IMF組織中脂肪沉積和代謝過程發(fā)揮重要調(diào)控作用，對進一步研究寧鄉(xiāng)豬脂肪沉積機制具有重要意義。

寧鄉(xiāng)豬；肌內(nèi)脂肪；皮下脂肪；RNA-seq；差異表達基因

豬肉是我國居民肉食的主要來源，在我國居民的膳食結(jié)構(gòu)中扮演著重要角色，可為人們提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和必需的脂肪酸[1]。肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat，IMF)是影響豬肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，影響肉的嫩度、系水力、風(fēng)味和多汁性[2]。一般認為，IMF含量在2.5%～3.5%的豬肉其口感較為理想[3]。地方豬種具有繁殖力高、抗逆性強和IMF含量高等特點，例如寧鄉(xiāng)豬IMF含量高達7.11%，不飽和脂肪酸含量在IMF中高達59.6%，被認為是具有較好肉質(zhì)的豬種之一，但是其生長速度極其緩慢[4]。而改良型豬種雖然生長速度快、瘦肉率高、皮下脂肪(subcutaneous fat，SAF)沉積少，但同時IMF含量低、肉品質(zhì)差。IMF與SAF的沉積(背膘厚度)呈現(xiàn)一定正相關(guān)性，SAF厚度可用于預(yù)測IMF含量[5]。因此，如何在不影響生長速度的前提下，減少豬SAF的沉積、增加IMF的含量已成為當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題之一。

黃萬龍等[6]采用RNA測序(RNA-seq)技術(shù)分析了大白豬SAF和IMF組織基因表達譜，發(fā)現(xiàn)不同部位的脂肪在脂肪代謝與脂肪細胞分化能力上存在著差異。這為尋找調(diào)控脂肪在不同組織差異沉積的分子機理提供了可能性。目前，RNA-seq技術(shù)已被廣泛用于挖掘調(diào)控畜禽肉質(zhì)性狀的候選基因和生物學(xué)通路[5,7,8]。Chen等[9]利用RNA-seq技術(shù)分析比較了萊蕪豬和大白豬肌肉組織轉(zhuǎn)錄組表達譜，結(jié)果表明差異表達基因主要富集在脂肪細胞因子信號通路、脂肪酸代謝和脂肪酸生物合成途徑。Sodhi等[5]研究表明，巴克夏豬和濟州島本地豬的皮下、肌間與IMF組織中差異表達基因主要富集在脂質(zhì)代謝相關(guān)的生物學(xué)過程和信號通路中。以上研究揭示了決定脂肪差異沉積的關(guān)鍵基因和途徑。目前，關(guān)于同一品種及不同品種間豬不同組織脂肪差異沉積的機制研究較多[10,11]，但有關(guān)寧鄉(xiāng)豬品種內(nèi)不同脂肪組織脂肪沉積差異的分子機制研究鮮見報道，尤其是寧鄉(xiāng)豬SAF與IMF組織脂肪沉積的生物學(xué)機制，有待深入探究。因此，本研究利用RNA-seq技術(shù)對寧鄉(xiāng)豬SAF與IMF組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，得到SAF與IMF組織中差異表達的mRNA，并從中篩選出與脂肪沉積相關(guān)的候選基因，為進一步探究寧鄉(xiāng)豬脂肪沉積機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品制備

本研究所選用的豬只由湖南楚溈香農(nóng)牧股份有限公司提供。豬只選自相同飼養(yǎng)單元、同批次、同胎次，飼養(yǎng)于相同飼養(yǎng)管理環(huán)境下，體重接近、健康狀況良好的6頭250日齡寧鄉(xiāng)豬。對豬放血屠宰后，立即采集寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF組織樣本存放于液氮中。IMF組織的分離具體步驟如下[10,11]：

(1)將所需的眼科鑷子和手術(shù)刀及其他實驗器具經(jīng)DEPC水浸泡并高壓滅菌，烘箱烘干后待用。

(2)取出部分于液氮中保存的背最長肌組織，浸入–80℃預(yù)冷的RNAKeeper-ICE Tissue Transition Buffer (Vazyme)中解凍以防止RNA降解以及使組織解凍轉(zhuǎn)變至易于處理的狀態(tài)。

(3)在適度解凍后，在背最長肌組織趨向于透明時，白色的IMF組織比較明顯。置于冰上，使用眼科鑷子和手術(shù)刀分離IMF組織，并小心地剔除肌纖維和結(jié)締組織，避免其他組織的污染。為了減少RNA降解，分離程序在冰上并在5 min內(nèi)完成。分離出的IMF組織置于裝有1 mL Trizol的2 mL無RNA 酶離心管中，儲存于液氮中待提取RNA。

之后轉(zhuǎn)入–80℃冰箱保存，直至后續(xù)分析。實驗設(shè)置兩組樣本，每組6個重復(fù)：IMF及SAF，分別命名IMF1、IMF2、IMF3、IMF4、IMF5、IMF6和SAF1、SAF2、SAF3、SAF4、SAF5、SAF6。

1.2 RNA提取及質(zhì)量檢測

利用Trizol (美國Invitrogen公司)法提取IMF及SAF樣本總RNA。Nanodrop 2000對提取的RNA濃度及純度進行檢測，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對RNA完整性進行檢測，Agilent 2100對其RIN值進行測定，以確保轉(zhuǎn)錄組測序所用樣本的質(zhì)量。單次建庫要求RNA總量1 μg，濃度≥50 ng/μL，260 nm/280 nm值介于1.8～2.2之間。測序文庫的建立采用TruSeqTMRNA sample preparation Kit (美國Illumina公司)試劑盒。文庫使用Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000測序平臺進行高通量測序，測序讀長為PE150。對每個樣本原始測序數(shù)據(jù)進行過濾的步驟如下：(1)去除reads中的接頭序列，去除由于接頭自連等原因?qū)е聸]有插入片段的reads；(2)將序列末端(3'端)質(zhì)量值小于20的堿基修剪，若質(zhì)量值小于10，則將整條序列剔除；(3)去除含N比率超過10%的reads；(4)舍棄adapter及質(zhì)量修剪后長度小于20 bp的序列。通過以上過程得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)(clean data)以確保后續(xù)分析。將高質(zhì)量clean data與參考基因組比對，獲得用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄本組裝、表達量計算等的mapped reads。

1.3 基因表達水平及差異分析

在RNA-seq分析中，通過定位到基因組區(qū)域的序列(clean reads)數(shù)量(reads counts)來計算基因的表達水平。使用軟件RSEM (http://deweylab.biostat.wisc. edu/rsem/)進行定量分析，并進一步分析其差異表達情況。獲得基因的read counts后，使用DESeq2軟件進行樣本間基因的表達差異分析。

1.4 差異表達基因GO及KEGG通路富集分析

利用在線軟件Network Analyst進行主成分分析(principal component analysis，PCA)。利用Goatools軟件(https://godtoolsapp.com/en/)對差異表達基因進行富集分析。利用GO (Gene Ontology，http://wwwge-neonto-logy.org/)數(shù)據(jù)庫，將基因按照它們參與的生物學(xué)過程(biological process，BP)、構(gòu)成細胞的組分(cellular component，CC)和實現(xiàn)的分子功能(molecular function，MF)進行分類。利用KEGG庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://wwwge-no--mejp/kegg/)對基因參與的pathway通路或行使的功能進行分類。對差異表達基因進行KEGG注釋，可將差異基因顯示在KEGG pathway通路圖上。計算差異表達基因顯著富集的GO條目和信號通路，當(dāng)<0.05時，則顯著富集。

1.5 實時熒光定量PCR驗證

為了進一步驗證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機挑選、、、、和共6個差異表達基因進行qRT-PCR，用于驗證基因的表達水平。以豬肌動蛋白β (actin beta，)為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系為10 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各0.2 μL，2× QuantiFast?SYBR?Green PCR預(yù)混液5 μL，DEPC水3.6 μL。qRT-PCR 擴增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)。采用2–ΔΔCt計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-seq數(shù)據(jù)分析

通過RNA-seq分析，結(jié)果顯示，寧鄉(xiāng)豬SAF、IMF平均原始測序數(shù)據(jù)的總條目數(shù)分別為46,260,748和62,821,105條，通過質(zhì)控后得到平均測序數(shù)據(jù)的總條目數(shù)為45,856,365和61,793,414條。Q-score>30的reads平均為94.803% (SAF)及93.860% (IMF)以上，未檢出的堿基比為0.024% (SAF)及0.025% (IMF)，GC堿基含量分別為51.745% (SAF)和56.345% (IMF)。由此可見，clean reads的數(shù)量及比對結(jié)果符合要求(表1)。

2.2 差異表達基因鑒定

根據(jù)FPKM法計算得到基因的FPKM值，比較了寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF組織中基因差異性表達情況。將校正后的值FDR<0.01及差異倍數(shù)FC≥2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對寧鄉(xiāng)豬兩種組織中的極具顯著差異基因進行分析。PCA分析結(jié)果顯示(圖1A)，同一組基因表達模式更加接近，各組樣本明顯分離，說明本研究的數(shù)據(jù)可靠，且組內(nèi)一致性和組間差異性較好。

分析結(jié)果顯示，寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF組織間的差異表達基因共2406個，其中1422個基因上調(diào)表達，984個基因下調(diào)表達(圖1B)。具有100倍以上差異倍數(shù)的差異基因共328個，其中上調(diào)基因300個，下調(diào)基因28個。具有500倍以上差異倍數(shù)的差異基因共142個，其中上調(diào)基因136個，下調(diào)基因6個(圖2)。其中，肌聯(lián)蛋白帽(titin-cap，)基因在寧鄉(xiāng)豬IMF組織中表達量較高，與SAF表達量的差異倍數(shù)最大(為252,288.86倍)，F(xiàn)DR較低，表明該基因可能是寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF組織特異性差異沉積的關(guān)鍵基因。

表1 寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果

圖1 差異表達基因分析

A：轉(zhuǎn)錄組主成分分析；B：差異表達基因火山圖。SAF：皮下脂肪；IMF：肌內(nèi)脂肪。

2.3 差異表達基因GO富集及KEGG通路分析

利用GO富集分析對差異性表達基因進行基因功能注釋。GO富集分析結(jié)果顯示，差異表達基因顯著富集的條目共有271個，其中生物學(xué)過程有197個，占73%；分子功能有36個，占13%；細胞組分有38個條，占14% (圖3A)。差異表達基因與脂質(zhì)代謝相關(guān)的生物學(xué)過程較多，主要富集在脂質(zhì)合成、脂肪酸代謝過程、甘油三酯代謝過程和脂類生物合成等，上述注釋到GO功能中可能與脂質(zhì)差異沉積相關(guān)的基因包括、ACACA、、、和。

圖2 寧鄉(xiāng)豬皮下脂肪和肌內(nèi)脂肪組織差異表達基因分布

通過對寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF組織差異表達基因進行KEGG信號通路富集分析，結(jié)果顯示，共富集到114條生物學(xué)代謝通路。其中，極顯著性富集的KEGG通路有75條(<0.01)；類固醇生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、甘油磷脂代謝和自噬途徑等與脂肪細胞分化和脂質(zhì)代謝相關(guān)信號通路顯著富集，涉及到133個差異表達基因(圖3B)，差異表達基因信息見表2。

2.4 脂質(zhì)代謝差異表達基因篩選

基于以上分析，篩選出主要在脂質(zhì)代謝中起調(diào)控作用的差異表達基因12個(、、、、、、、和)，與SAF組織相比，IMF組織中差異表達基因上調(diào)5個(、和)，差異表達基因下調(diào)7個(、、、、、和) (<0.05) (表3)。

2.5 qRT-PCR驗證

為了進一步驗證RNA-seq結(jié)果的可靠性，隨機選取6個差異表達基因(、、、、和)進行驗證。結(jié)果顯示，乙酰輔酶A羧化酶α (acetyl-CoA carboxylase α，)、長鏈脂肪酸延伸酶6 (ELOVL fatty acid elongase 6，)、脂肪酶A (lipase A，)、角鯊烯環(huán)氧酶(aqualene epoxidase，)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl-CoA desaturase，)基因在SAF組織中顯著上調(diào)表達，法尼基轉(zhuǎn)移酶1(farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1，)基因在SAF組織中顯著下調(diào)表達(圖4)，與測序結(jié)果一致，表明測序結(jié)果可靠。

圖3 功能富集分析

A：差異表達基因GO富集分析；B：差異表達基因KEGG富集分析。

表2 可能與脂質(zhì)代謝相關(guān)的富集通路(差異倍數(shù)FC>2)

>0.05表示差異不顯著，<0.05為差異顯著。

表3 脂質(zhì)代謝顯著差異表達基因

<0.05表示差異顯著。

圖4 差異表達基因qRT-PCR驗證

SAF：皮下脂肪；IMF：肌內(nèi)脂肪；**表示<0.01，差異極顯著。

3 討論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序?qū)庎l(xiāng)豬SAF和IMF組織中差異表達基因進行分析，鑒定差異表達基因及其參與的關(guān)鍵生物學(xué)過程，以期篩選出與寧鄉(xiāng)豬脂肪差異沉積的相關(guān)關(guān)鍵基因。本研究共鑒定差異表達基因2406個，其中1422個基因表達上調(diào)，984個基因表達下調(diào)。通過qRT-PCR對、、、、和基因進行了驗證，與測序結(jié)果一致，表明測序結(jié)果可靠。

脂質(zhì)代謝是由多個基因和調(diào)控因子通過多種信號途徑調(diào)節(jié)的復(fù)雜的生物學(xué)過程。TCAP作為一種肌絲蛋白在肌原纖維的組裝過程中發(fā)揮著重要作用，且已被證明在不同肌間脂肪含量的肌肉中存在差異表達[12]。本研究中，在寧鄉(xiāng)豬IMF組織中表達量較高，顯著高于在SAF組織中的表達量，這提示基因可能是調(diào)控寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF組織特異性脂肪差異沉積的關(guān)鍵基因。吳怡琦等[13]通過比較牛前體脂肪細胞在成脂分化前后基因的表達差異，發(fā)現(xiàn)基因可誘導(dǎo)C3H10T1/2細胞的成脂分化，表明可調(diào)控脂肪前體細胞成脂分化。周乾等[14]發(fā)現(xiàn)是調(diào)節(jié)肌間脂肪差異沉積的重要基因，表明在具有不同脂肪沉積程度的牛肉中存在差異表達，對肌肉中脂肪的沉積具有潛在的影響。與本研究結(jié)果一致，在秦川牛背膘中表達量較低，而在IMF組織中表達量較高，表明與秦川牛胴體性狀顯著相關(guān)[15]。由此可見，以上研究證明了基因在不同組織中差異表達規(guī)律的一致性，暗示基因?qū)ωi脂肪生成、特別是SAF沉積起到抑制作用。

通過GO富集分析，差異基因主要富集在脂質(zhì)結(jié)合、脂肪酸代謝過程、甘油酯代謝過程以及脂類生物合成等與脂質(zhì)代謝相關(guān)的生物學(xué)過程。上述過程篩選出核受體亞家族4 A族成員1(nuclear receptor subfamily 4 group A member 1，)、脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，)、長鏈脂肪酸延伸酶6 (ELOVL fatty acid elongase 6，)、二酰基甘油O-?；D(zhuǎn)移酶1 (diacylglycerol O-acyltransferase 1，)、蛋白激酶AMP激活的催化亞單位α1 (protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 1，)、乙酰輔酶A羧化酶α (acetyl-CoA carbo-xylase α，)等與脂質(zhì)沉積相關(guān)基因。是核受體NR4A家族中的重要一員，可通過對靶細胞基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，參與調(diào)控體內(nèi)多種生理過程，包括細胞存活與凋亡、脂質(zhì)代謝等生命活動[16]。本研究中，在寧鄉(xiāng)豬IMF組織中表達上調(diào)，與其在山羊不同組織中相對表達模式一致，即與SAF組織相比，IMF組織中表達較高[17]。通常在脂肪組織中，對脂質(zhì)沉積起到抑制作用[18]。也有研究指出，對脂肪分解過程無直接調(diào)控作用，但可以通過直接激活GATA結(jié)合蛋白2 (GATA binding protein 2，)基因的表達來抑制過氧化物酶體增殖激活受體(peroxisome prolife-rator activated receptor gamma，)的轉(zhuǎn)錄表達，上調(diào)p53降低甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1 (sterol regulatory element binding transcri-ption factor 1，)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，)的表達，抑制脂肪細胞的分化和脂肪生成[19]。脂蛋白脂酶是由脂肪細胞、心肌細胞等實質(zhì)細胞合成及分泌的一種三酞甘油蛋白酞基水解酶，可經(jīng)血管內(nèi)皮將血液中的乳糜顆粒和極低密度脂蛋白與甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，運輸?shù)綑C體組織貯存及利用。IMF組織中脂肪主要成分為磷脂，其中不飽和脂肪酸含量較SAF組織高(主要成分為甘油三酯)[20]。豬基因可能是影響豬脂肪沉積的重要候選基因之一。在蘇鐘豬SAF中基因表達上調(diào)，基因表達水平與IMF含量、大理石紋評分均呈現(xiàn)正相關(guān)，表明基因?qū)ωiSAF沉積和肉品質(zhì)調(diào)控具有重要作用[21,22]。甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶(diacylgycerol acyltransferase，DGAT)是三酰甘油合成的限速酶，可通過催化二酰甘油加上脂肪酸?；扇８视?。過表達顯著增加小鼠脂肪組織及骨骼肌中甘油三酯的含量[23,24]，促進前體脂肪細胞甘油三酯合成[25]。而在敲除基因的小鼠骨骼肌中，骨骼肌內(nèi)甘油三酯的含量顯著降低，這表明基因在脂質(zhì)代謝過程中具有重要的調(diào)控作用[26]。為甘油三酯合成提供基質(zhì)，其過表達可使油酸(甘油三酯合成的首選底物)的合成增加，促進脂滴的形成[27]。此外，ACACA酶參與調(diào)控脂肪酸從頭合成，其表達水平能夠調(diào)控脂肪酸的合成速率，影響機體的脂肪沉積[28]。姚大為等[29]研究證實，基因被干擾表達后，和基因的表達量顯著下調(diào)，降低了脂肪合成，以上研究結(jié)果表明，基因及其底物參與甘油三酯的合成。由此可見，、、及基因在SAF組織中特異性高水平表達，提示這些差異表達基因可作為影響豬脂肪沉積的重要候選基因。

通過對寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF組織差異表達基因進行KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達基因顯著富集到類固醇生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成及甘油磷脂代謝通路，這3條通路中法尼基轉(zhuǎn)移酶1 (farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1，)、酰基輔酶A氧化酶1 (acyl-CoA oxidase 1，)和硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl-CoA desaturase，)可能是脂肪在寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF組織中差異沉積的3個相關(guān)基因。其中，在寧鄉(xiāng)豬IMF組織中表達上調(diào)，及在寧鄉(xiāng)豬SAF組織中表達上調(diào)。ACOX1是脂肪細胞內(nèi)特異性與脂肪酸β-氧化過程中脫氫反應(yīng)相關(guān)的限速酶，通過改變脂肪酸代謝影響甘油三酯的沉積[30]。在3T3-L1前體脂肪細胞中，基因過表達可顯著降低脂肪細胞脂滴沉積量，且能夠抑制脂肪分化后期脂代謝關(guān)鍵基因、脂肪酸合成基因——脂肪酸合酶(fatty acid synthase，)和乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，)的表達，促進脂肪分解基因激素敏感脂肪酶的表達，抑制脂肪合成[31]。SCD是機體內(nèi)催化飽和脂肪酸(主要包括棕櫚酰CoA、硬脂酰CoA等)向單不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，對肌肉組織脂肪沉積有重要調(diào)控作用。

此外，值得注意的是，通過通路富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達基因顯著富集到細胞自噬途徑，包括腺苷單磷酸活化蛋白激酶α1亞基(protein kinase AMP- activated catalytic subunitα1，)、自噬相關(guān)蛋白101 (autophagy related 101，ATG101)及腫瘤蛋白p53誘導(dǎo)的核蛋白2(tumor protein p53-induced nuclear protein 2，)。其中，在SAF組織中高表達，和在IMF組織中高表達。自噬是真核生物中一種進化上高度保守的、用于降解和回收利用細胞內(nèi)生物大分子和受損細胞器的過程[31,32]。自噬在脂肪細胞分化、脂質(zhì)代謝等方面發(fā)揮著重要作用[33,34]。研究表明，基因可調(diào)控脂肪前體細胞中脂肪代謝相關(guān)基因(、、)的表達，推測基因在脂肪代謝過程中發(fā)揮重要作用[35]。馬靜遠等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在米色脂肪細胞分化過程中表達量增加，但基因的缺失抑制了ULK1自噬起始復(fù)合物形成，降低了米色脂肪細胞分化、脂質(zhì)合成降低，表明自噬活動維持細胞器功能受損，從而影響了脂肪細胞分化。也被稱為糖尿病和肥胖調(diào)節(jié)蛋白(diabetes and obesity regulatedprotein，DOR)，與細胞自噬、糖尿病、肥胖的調(diào)節(jié)及成脂分化的調(diào)控等密切相關(guān)。在Zucker糖尿病脂肪大鼠模型中，肌肉組織的mRNA表達水平顯著下調(diào)[37]。Romero等[38]在3T3-L1前體脂肪細胞上的研究發(fā)現(xiàn)，通過慢病毒過表達基因，導(dǎo)致脂肪細胞中脂滴減少，甘油三脂減少且脂肪細胞分化標(biāo)志性基因的表達量也顯著下調(diào)，表明能負調(diào)控前體脂肪細胞分化。以上研究結(jié)果提示，可負調(diào)節(jié)脂肪前體細胞成脂分化及機體脂質(zhì)代謝，可能作為治療脂肪代謝疾病的潛在靶標(biāo)。但是最近的研究表明，過表達秦川牛前體脂肪細胞中基因，導(dǎo)致形成的脂滴增加，脂肪細胞分化標(biāo)志基因的表達量升高，表明基因促進牛前體脂肪細胞的分化[39]。推測造成這種結(jié)果的原因可能是物種間差別，也可能是基因參與的脂肪細胞分化通路不同，具體機制有待進一步的探討。

黃萬龍等[6]應(yīng)用RNA-seq對大白豬SAF和IMF組織中的基因表達譜進行分析，鑒定出180個差異表達基因(75個上調(diào)表達，105個下調(diào)表達)，發(fā)現(xiàn)大白豬基因?qū)AF沉積起到抑制作用。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因在寧鄉(xiāng)豬IMF組織中表達下調(diào)，與本研究結(jié)果一致[4]。由此可見，在調(diào)控不同品種豬脂質(zhì)沉積中的功能是一致的。但在大白豬IMF組織轉(zhuǎn)錄組研究中，并不是差異表達基因[38]，表明對寧鄉(xiāng)豬的脂質(zhì)代謝調(diào)控具有高度的特異性。此外，、、、、以及在大白豬SAF與IMF組織中并不是差異表達基因，表明這些基因可能參與了寧鄉(xiāng)豬脂肪代謝過程[4]。

本研究初步揭示了寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF組織脂質(zhì)沉積相關(guān)的差異基因的表達特征。其中，基因在寧鄉(xiāng)豬IMF組織中表達量較高，與SAF組織表達量的差異倍數(shù)最大，提示該基因可能是脂肪在寧鄉(xiāng)豬SAF和IMF組織中差異沉積的關(guān)鍵基因。注釋到GO功能中可能與脂質(zhì)代謝相關(guān)的候選基因為、、、、和。值得注意的是，在自噬途徑中存在與脂肪沉積差異相關(guān)的候選基因，分別為、和。KEGG通路富集到與脂質(zhì)代謝相關(guān)的有類固醇生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成及甘油磷脂代謝通路，篩選到、和為候選基因。

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Analysis of transcriptome differences between subcutaneous and intramuscular adipose tissue of Ningxiang pigs

Fang Wang1,2,3, Yuebo Zhang1,2, Qian Jiang1,3, Yulong Yin1,2,3, Bi’e Tan1,2,3, Jiashun Chen1,2,3

To compare and analyze the molecular mechanisms of adipose deposition in subcutaneous fat (SAF)and intramuscular fat (IMF) tissues in Ningxiang pigs,differential gene expression profiles in SAF andIMF tissues of Ningxiang pigs were identified and analysed using RNA-seq technology.Six healthy 250-day-old male Ningxiang pigs with similar body weights (approximately 85 kg) of intraspecific individuals were selected as experimental material and samples of SAF and IMF tissues were collected.Differential genes associated with fat deposition and lipid metabolism were obtained by sequencing two adipose tissue transcriptomes and performing GO (Gene Ontology) functional annotation and KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathway enrichment analysis. To verify the reliability of the sequencing results, six differential genes were randomly selected to validate using qRT-PCR. The results showed that we identified 2406 DEGs, with 1422 up-regulated and 984 down-regulated genes in two tissues. GO functional annotation analysis revealed that the differentially expressed genes were mainly involved in lipid metabolism related pathways, such as steroid biosynthesis, unsaturated fatty acid biosynthesis, glycerophospholipid metabolism and autophagy pathway. KEGG pathway enrichment showed that the differentially expressed genes were mainly enriched in the biological processes related to lipid binding, fatty acid metabolism, glycol ester metabolism, lipid biosynthesis and other biological processes related to lipid metabolism. Genes related to lipid metabolism, such as TCAP, NR4A1, ACACA, LPL, ELOVL6, DGAT1, PRKAA1, ATG101, TP53INP2, FDFT1, ACOX1 and SCD were identified by bioinformatic analyses and verified by qRT-PCR. Our results indicated that these genes may play important roles in the regulation of fat deposition and metabolism in the SAF and IMF tissue, providing the further mechanistic investigation of fat deposition in Ningxiang pigs.

Ningxiang pig; intramuscular fat; subcutaneous fat; RNA-seq; differentially expressed gene

2023-05-09;

2023-08-16;

2023-09-18

國家重點研發(fā)計劃項目(編號：2021YFD1300403)，國家自然科學(xué)基金項目(編號：32302761，U20A2054)，湖南省自然科學(xué)基金項目(編號：2022JJ40165)，國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(編號：CARS-35)和湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金項目(編號：22B0206)資助[Supported by the National Key Research and Development Program of China (No. 2021YFD1300403), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 32302761, U20A2054), the Youth Science Fund Project of the Natural Science Foundation of Hunan (No. 2022JJ40165), Earmarked Fund for China Agriculture Research System (No. CARS-35), and the Excellent Youth Project of Hunan Provincial Department of Education (No. 22B0206)]

王芳，碩士研究生，專業(yè)方向：畜牧學(xué)。E-mail: 1264873344@qq.com

陳家順，講師，研究方向：動物肉質(zhì)調(diào)控。E-mail: jschen@hunau.edu.cn

譚碧娥，教授，研究方向：豬營養(yǎng)調(diào)控研究。E-mail: bietan@hunau.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-131

(責(zé)任編委: 李明洲)