基于高效液相色譜測定白酒中乳酸和乙酸的方法研究

張 婷，胡來麗，時 源，楊 果，何世興

（1.四川郎酒股份有限公司，四川古藺 646523；2.四川省醬香型白酒生態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646523）

為準確定量白酒中乳酸含量，本研究采用高效液相色譜法，選用磷酸二氫鈉作為流動相體系，加入不同比例甲醇，用5%乙醇制備標準溶液以排除乙醇對乳酸、乙酸保留時間的干擾，建立標準曲線，并通過精密度和加標回收試驗，以驗證方法的準確性。利用該方法找出不同香型白酒中有機酸的差異性，并選取原酒蒸餾過程中的前段、中段、尾段酒樣進行分析，以期為白酒中乳酸含量測定提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：醬香、濃香、清香3 種香型酒樣各10 個，市購；選取原酒蒸餾過程前段、中段、后段酒樣各1個。

試劑：甲醇（fisher）、乙醇（西隴科學股份有限公司）、乳酸（天津市光復化工研究所）、乙酸（天津市光復化工研究所）均為色譜純；磷酸（成都市科隆化學品有限公司）、磷酸二氫鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司）均為優(yōu)級純。

儀器設備：Waters 2695 超高效液相色譜儀，配2489 紫外檢測器；Milli-Q（IQ7010）純水系統(tǒng)；pH儀，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；萬分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；0.22 μm有機濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 流動相配制

配制濃度為20 mM磷酸二氫鈉，并用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.7。

1.2.2 樣品前處理

總之，迪士尼樂園與色彩豐富的美國西海岸攝影藝術(shù)都曾在斯各格蘭德身上打下印記。同時出現(xiàn)在其作品中的，還有美國恐怖電影的痕跡，以及美國中產(chǎn)階級的焦慮——斯各格蘭德擅長以諷刺手法來表現(xiàn)這一點。她的作品中顯然飄蕩著一種城郊居民的憂郁氣息。她承認對平庸充滿興趣，“我自己也出身于中產(chǎn)階級，從品味來看，我的階層正是我做出許多選擇的根源?！?/p>

將樣品稀釋過0.22 μm 水系濾膜，待上機分析。

1.2.3 定性實驗

分別配制乳酸、乙酸標準溶液，在相同條件下進行檢測，根據(jù)乳酸、乙酸保留時間定性。

1.2.4 標準曲線的制作

準確稱取0.10 g 乳酸、乙酸至100 mL 容量瓶，分別用不同濃度乙醇溶液溶解并定容到100 mL，配制成濃度為100 mg/100 mL 乳酸、乙酸儲備液。用該儲備液配制濃度為0 mg/100 mL，5 mg/100 mL，10 mg/100 mL，25 mg/100 mL，50 mg/100 mL，100 mg/100 mL 的乳酸、乙酸混合標準溶液并建立標準曲線。

1.2.5 色譜條件

色譜柱：XSelect HSST3 (4.6 ×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量為10 μL；流動相A 為磷酸二氫鈉，B 為甲醇；配紫外檢測器，檢測波長為210 nm，分別在A∶B=95∶5 和A∶B=90∶10的流動相比例下進行測定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的建立

白酒樣品中主要成分為乙醇和水，考慮基質(zhì)對分析結(jié)果的影響，分別用純水和10 %乙醇溶液配制標準溶液建立標準曲線。由圖1 和圖2 可看出，乙醇影響分離程度，乳酸保留時間為5.5 min。

圖1 純水配制標準曲線

圖2 10%乙醇配制標準曲線

XSelect HSS T3 5 μm 4.6×250 mm為反相色譜柱，通過加入5 %、10 %甲醇提高色譜柱分離程度。圖3 為流動相中加入5%甲醇、用10%乙醇作為溶劑建立的標準曲線，乳酸、乙酸保留時間提前，出現(xiàn)乳酸峰前移及乙酸峰拖尾現(xiàn)象。

圖3 流動相中加入5%甲醇、10%乙醇作為溶劑建立的標準曲線

圖4 為流動相中加入10 %甲醇、10 %乙醇作為溶劑建立的標準曲線，乳酸保留時間提前至4.0 min，峰分離效果好。

圖4 流動相中加入10%甲醇、10%乙醇作為溶劑建立的標準曲線

考慮乙醇對保留時間及結(jié)果的影響，將樣品分別稀釋至1 %vol、2 %vol、3 %vol、4 %vol、5 %vol、6 %vol、7 %vol、8 %vol、9 %vol。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸保留時間不變，乙酸保留時間受乙醇濃度影響，隨乙醇濃度增加而提前。酒精度范圍在10%vol 內(nèi)，乙酸保留時間差異為0.1 min（見圖5）。根據(jù)流動相中不同乙醇濃度對保留時間的影響，綜合考慮將該方法優(yōu)化為濃度為20 mM、pH2.7 磷酸二氫鈉流動相中加入10%甲醇，用5%vol 乙醇溶液配制乳酸、乙酸標準溶液建立標準曲線。

圖5 不同乙醇濃度對乳酸、乙酸保留時間的影響

2.2 線性關(guān)系及檢出限

采用濃度為20 mM、pH2.7 磷酸二氫鈉，加入10%甲醇流動相，用5%乙醇作為溶劑建立標準曲線，對配制的不同濃度系列標準溶液進行檢測，得到標準曲線。乳酸、乙酸的保留時間、線性范圍、標準曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表1。

表1 乳酸乙酸HPLC分析標準曲線

相關(guān)系數(shù)R2均＞0.9999，可滿足定量檢測要求。以信噪比（S/N)=3確定檢出限，能夠滿足實驗室的檢測需求[5]。

2.3 精密度試驗

配制濃度為2 mg/100 mL、20 mg/100 mL、80 mg/100 mL 的標準溶液，用上述方法進行6 次平行測定，計算乳酸和乙酸在不同濃度下測定結(jié)果的平均值及RSD。由表2 可知，乳酸、乙酸精密度試驗結(jié)果相對標準偏差均＜1.0 %，說明該方法的精密度良好，可用于白酒樣品的檢測。

表2 精密度試驗結(jié)果 （n=6)

2.4 加標回收率試驗

在含量約為40 mg/L 的標樣中，加入40 mg/L的標準品，平行測定3次，計算平均回收率和RSD，結(jié)果如表3所示。

表3 加標回收率試驗結(jié)果 (n=3)

由表3 可知，乳酸的加標回收率在102 %～103%之間，乙酸的加標回收率在104%～106%之間，RSD 均＜0.5%，表明該方法的測定結(jié)果準確度較好。

2.5 3種香型白酒四大酸的測定分析

選取3 種香型不同廠家酒樣各10 個，稀釋為乙醇濃度≤5%vol 樣品，過0.22 μm 有機濾膜，進行乳酸、乙酸測定，用氣相色譜法進行丁酸、己酸分析，用指示劑法對總酸進行測定，結(jié)果見表4。

對比得出不同香型白酒四大酸存在差異性，其中醬香型白酒乳酸、乙酸和總酸較高；濃香型白酒己酸較高；清香型白酒乙酸較高。初步得出白酒四大酸指標差異性可影響白酒風格及香型[7]。

2.6 前、中、尾段酒樣四大酸結(jié)果分析

選取原酒蒸餾過程前段、中段、尾段酒樣，用此方法進行四大酸分析，結(jié)果見表5。對比得出，有機酸隨著餾酒時間的延長呈上升趨勢，有機酸與餾酒時間呈正相關(guān)。鑒于此，可進一步開展白酒餾分風味物質(zhì)的分析，并結(jié)合生產(chǎn)實際對白酒餾酒工藝提供技術(shù)指導[7]。

表5 前段、中段、尾段酒樣四大酸含量 (g/L)

3 結(jié)論

本研究確立了高效液相色譜法檢測白酒中乳酸、乙酸含量的方法，其標準曲線相關(guān)系數(shù)、精密度、加標回收率均能滿足試驗要求。通過研究不同體積分數(shù)乙醇對乳酸、乙酸保留時間和峰形的影響，在濃度為20 mM、pH2.7 磷酸二氫鈉加入10 %甲醇流動相，以便于增加乳酸、乙酸分離程度，用5%乙醇溶液配制標準溶液建立標準曲線，樣品稀釋為乙醇含量低于5%vol時，可以提高檢測結(jié)果的準確性。

利用該方法對醬香、濃香、清香3 種香型白酒的乳酸、乙酸進行測定，用氣相色譜法對己酸、丁酸進行測定，用指示劑法對總酸進行測定，可準確檢測出各酒樣中乳酸、乙酸、丁酸和己酸的含量差異。對餾酒過程中前段、中段、尾段酒樣中的四大酸進行測定，可知有機酸含量與餾酒時間呈正相關(guān)。本研究所提出的方法可用于白酒樣品中乳酸、乙酸的檢測，所得結(jié)果準確、可靠。