LC-ESI-MS/MS測定白酒中氨基甲酸乙酯的方法研究

董孝元，周 玉，余 義，劉 莎，汪明迪，孫 莉，唐艷榮*

（1.黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北 武漢 430050；2.湖北信嘉檢測科技有限公司，湖北咸寧 437000；3.黃鶴樓酒業(yè)（咸寧）有限公司，湖北咸寧 437000）

中國是蒸餾酒生產(chǎn)大國。酒類在發(fā)酵蒸餾過程中會產(chǎn)生一種致癌物質(zhì)氨基甲酸乙酯，該物質(zhì)不斷為大眾所熟知，是食物在發(fā)酵或貯存過程中天然產(chǎn)生的物質(zhì)，普遍存在于發(fā)酵食品和酒類產(chǎn)品中。眾所周知，用糧食釀造的白酒需要經(jīng)過發(fā)酵以及高溫蒸煮，釀造酒中的氨基甲酸乙酯主要是由乙醇和尿素共同作用產(chǎn)生的。尿素是在發(fā)酵過程中酵母分解精氨酸所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。氨基甲酸乙酯也會在蒸餾酒內(nèi)產(chǎn)生，特別是核果（如櫻桃、杏和梅）烈酒。果核所含的氰基糖苷在酶水解后會產(chǎn)生一種名為異氰酸酯的副產(chǎn)品，異氰酸酯與酒中的乙醇發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生氨基甲酸乙酯。

氨基甲酸乙酯是一種廣泛存在于白酒飲料中的2A 類致癌物質(zhì)，對人體健康存在潛在危害性[1]，各類酒中均不同程度微量存在，一些國家對酒中的含量有明確的限制規(guī)定[4]。關(guān)于食物中的EC含量，國際上對食品及酒類的氨基甲酸乙酯含量控制規(guī)定各不相同。我國白酒固態(tài)發(fā)酵方式及獨特的生產(chǎn)工藝，在一定程度上限制了現(xiàn)有氨基甲酸乙酯控制措施的可使用性。目前氨基甲酸乙酯的檢測方法包括液相法、液相質(zhì)譜串聯(lián)法、氣相質(zhì)譜串聯(lián)法等[3]。本文從利用液相質(zhì)譜聯(lián)用儀高效快速檢測氨基甲酸乙酯入手，優(yōu)化前處理方式，縮短檢測出峰時間，有利于我國白酒中氨基甲酸乙酯限量標(biāo)準(zhǔn)的建立，為消費者和白酒生產(chǎn)企業(yè)提供參考，使我國白酒企業(yè)得以良性發(fā)展及保障白酒產(chǎn)品的質(zhì)量安全[2]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：市售白酒。

試劑及耗材：氨基甲酸乙酯（規(guī)格0.1 g，儲存溫度20 ℃±4 ℃），Dr.Ehrenstorfer GmbH；乙腈（色譜純），美國Baker 公司；甲酸（色譜純），麥克林集團(tuán)有限公司；超純水，德國默克密理博MiLLi-QDireat。

儀器設(shè)備：Agilent 1260LC-Agilent 6460 安捷倫三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀；Agilent ZORBAX RXC18安捷倫色譜柱（2.1×150 mm，1.8 μm）；有機(jī)濾膜(孔徑0.22 μm)，天津津騰；天津津騰全玻璃微孔過濾器(規(guī)格1000 mL)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 mg/L）：準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.0001 mg）氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用一級水溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4 ℃冰箱中保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取0.04 mL、0.08 mL、0.16 mL、0.40 mL、0.80 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，一級水定容至刻度，配制成濃度分別為0.04 mg/L、0.08 mg/L、0.16 mg/L、0.40 mg/L、0.80 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理方法

用移液管準(zhǔn)確移取10 mL 白酒樣品于蒸發(fā)皿中，放于沸騰水浴鍋上，蒸發(fā)至近干后用純水定容至10 mL，并搖勻。用一次性2.5 mL 注射器吸取均質(zhì)樣品，經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾至1 mL進(jìn)樣瓶中，供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上機(jī)檢測。

1.2.3 色譜條件

(a)色譜柱：C18柱（柱長150 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm，填料粒徑1.8μm）；

(b)流動相：A 相：0.1 %甲酸溶液；B 相：乙腈溶液；

(c)流速：0.15 mL/min；

(d)柱溫：40 ℃；

(e)進(jìn)樣量：2 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

(a)離子源類型：電噴霧離子源；

(b)掃描方式：正離子模式；

(c)毛細(xì)管電壓：3000 V；

(d)離子源溫度：350 ℃；

(e)霧化氣：30 psi；

(f)多反應(yīng)監(jiān)測：選擇至少2個子離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將液相部分色譜柱換為兩通連接，采取直接進(jìn)樣的方式，將配制的純品目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜，分別進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式，在Scan 狀態(tài)下進(jìn)行全掃描檢測，得到TIC 總離子流圖，根據(jù)總離子流圖標(biāo)記出特征離子峰，即得到一級質(zhì)譜圖和準(zhǔn)分子離子峰，再進(jìn)行SIM 模式掃描，將標(biāo)記出的準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行單獨掃描，得到EIC 提取離子流圖；再用碰撞氣惰性氣體氮氣攻擊該前體離子，獲得其二級質(zhì)譜圖及相應(yīng)的子離子。結(jié)果表明在正離子模式下響應(yīng)值及靈敏度均高于負(fù)離子模式，因此，本方法選擇正離子電離模式。利用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM)）對選定的定性離子和定量離子對裂解電壓、毛細(xì)管電壓、碰撞能、保留時間、碰撞池加速電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使各監(jiān)測離子豐度和信號達(dá)到最佳。正離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 氨基甲酸乙酯的質(zhì)譜參數(shù)

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

通過對氨基甲酸乙酯物理和化學(xué)信息的分析，分別以0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、5 mmol/L甲酸銨-乙腈、5 mmol/L 甲酸銨-甲醇作為流動相進(jìn)行樣品分離。由于不同流動相的pH 值不同，對色譜柱中的填料物質(zhì)會起到一定的作用，有的流動相有利于目標(biāo)物質(zhì)的分離，有的流動相則會抑制目標(biāo)物出峰，導(dǎo)致峰形異常，如峰拖尾、峰前伸、雙頭峰，以及鬼峰等現(xiàn)象，均不利于對樣品進(jìn)行定性以及定量分析。通過利用以上流動相對氨基甲酸乙酯進(jìn)行色譜峰分離，結(jié)果表明，用0.1%甲酸-乙腈作為流動相時物質(zhì)分離度、峰形、響應(yīng)值以及保留時間的穩(wěn)定性均優(yōu)于0.1%甲酸-甲醇、5 mmol/L甲酸銨-乙腈、5 mmol/L 甲酸銨-甲醇，故本方法最終選用0.1 %甲酸-乙腈為流動相進(jìn)行洗脫。圖3 是氨基甲酸乙酯在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下的MRM色譜圖。

圖1 氨基甲酸乙酯離子質(zhì)譜圖

圖2 不同流動相色譜圖對比

圖3 氨基甲酸乙酯的多反映監(jiān)測色譜圖

圖4 氨基甲酸乙酯母離子及子離子色譜圖

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

將氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液用一級水稀釋，分別配制成濃度為40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、400 μg/L、800 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.2 節(jié)所述的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖5 所示。參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417—2017《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》中5.4 檢出限和定量限的評定方法規(guī)定，信噪比法評估檢出限和定量限，檢出限可接受的信噪比為3∶1，定量限可接受的信噪比為10∶1。本方法為保證實用性，模擬氨基甲酸乙酯在白酒中的狀態(tài)，由于目前市面上的白酒酒精度大多在42%vol和52%vol，本方法利用購買的無水乙醇，配制成酒精度為46%vol 的白酒模擬樣品，在白酒模擬樣品中添加氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液，進(jìn)行方法探底試驗。既要保證信噪比可接受，也要保證峰形易識別，且峰形無異常，如圖6所示。

圖5 氨基甲酸乙酯的線性相關(guān)系數(shù)

圖6 檢出限和定量限信噪比

結(jié)果顯示，在40～800 μg/L 的濃度范圍內(nèi)，分析物氨基甲酸乙酯的質(zhì)量濃度x(ng/mL)和響應(yīng)值y之間線性相關(guān)系數(shù)為0.999；模擬樣品中添加濃度為10 μg/L 時，信噪比為6 大于3，峰形易識別且無異常，即確定為檢出限；濃度為20 μg/L信噪比為15大于10，峰形易識別且無異常，故確定為定量限。

2.3 精密度和回收率

為充分保證相關(guān)樣品檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確有效，本試驗分別準(zhǔn)備3 種常見的不同香型白酒樣品，濃香型白酒、醬香型白酒和清香型白酒，并在3 種白酒樣品中分別加入按標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度最高點的0.1倍、0.5倍和0.9倍的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低中高3種濃度的加標(biāo)樣品溶液，按照給定分析方法的全過程進(jìn)行處理和測定，記錄6 個平行樣的測定結(jié)果，按全程序每個樣品平行測定6 次，分別計算每個樣品的加標(biāo)回收率，統(tǒng)計其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，見表2、表3、表4。

表2 樣品1加標(biāo)回收率計算

表3 樣品2加標(biāo)回收率計算

表4 樣品3加標(biāo)回收率計算

參考公式：

加標(biāo)回收率=(加標(biāo)試樣測定值-試樣測定值)/加標(biāo)量×100%

由表2 可知，本實驗中檢測結(jié)果的重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)）均小于10 %，且加標(biāo)回收率均在95%～115%之間，滿足方法驗證學(xué)要求。

2.4 與國標(biāo)法比對

選擇市面上常見的3 種香型白酒，濃香、清香和醬香，按照本方法和食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基甲酸乙酯的測定GB 5009.223—2014 分別進(jìn)行樣品前處理以及上機(jī)檢測。本方法采用除醇方式對白酒樣品進(jìn)行前處理，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測，外標(biāo)法定量分析；國標(biāo)GB 5009.223—2014采用萃取、分液及氮吹等方式對樣品進(jìn)行前處理，氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，內(nèi)標(biāo)法定量分析。3種香型白酒的檢測比對結(jié)果見表5。

表5 方法結(jié)果比對 (μg/L)

由表5 可知，不同香型白酒氨基甲酸乙酯含量差別比較大，將本方法和國標(biāo)方法的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，相對偏差均小于10 %，由此可知，對于不同濃度的白酒樣品，本方法與國標(biāo)方法檢測結(jié)果相差不大，能滿足檢測要求。

3 結(jié)論

本研究利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了白酒中氨基甲酸乙酯化合物的分子信息，利用多反應(yīng)監(jiān)測模式的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了快速、穩(wěn)定、靈敏的可定性定量分析氨基甲酸乙酯的方法。該方法可在8 min內(nèi)完成，經(jīng)過多種方法學(xué)驗證，其檢測范圍內(nèi)線性良好（r=0.999）；檢出限0.01 mg/L；定量限0.02 mg/L；精密度小于10 %；回收率大于95%；并且在與國標(biāo)方法檢測結(jié)果比較中，檢測結(jié)果相對偏差均小于10 %。對于不同香型白酒，氨基甲酸乙酯濃度各異。由結(jié)果可知本方法與國標(biāo)方法偏差較小，滿足使用要求。與國標(biāo)中的檢測方法相比本方法前處理更加方便快捷，便于日常對白酒中氨基甲酸乙酯的含量進(jìn)行監(jiān)控。綜上所述本方法可以對白酒中氨基甲酸乙酯進(jìn)行實際的定性定量分析檢測。