含香豆素結(jié)構(gòu)的1,4-戊二烯-3-酮類衍生物的合成及生物活性

王曉斌，王瑞穎，董 雪，嚴(yán)莉莉，張 娟，顧一飛，，程青芳，，薛 偉

（1.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院,江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室,連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院,連云港 222005；3.貴州大學(xué)教育部綠色農(nóng)藥與生物工程重點實驗室,貴陽 550025）

眾所周知，天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)新穎、活性廣泛、作用方式獨特及環(huán)境友好的特點，對其結(jié)構(gòu)進行理性改造通常能獲取一些性能更卓越的二次先導(dǎo)［1，2］.這些二次先導(dǎo)在繼承了天然產(chǎn)物獨特作用方式和生態(tài)環(huán)保特性的同時，其生物活性和物化性質(zhì)也能得到顯著改善［3，4］.如，通過對青蒿素（Artemisinin）、紫杉醇（Paclitaxel）和康帕尼（Compactin）等天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)優(yōu)化，已相繼開發(fā)出蒿甲醚（Artemether）、多西他賽（Docetaxel）和普伐他?。≒ravastatin）等數(shù)百種功能各異的藥物［5～7］.作為我國傳統(tǒng)中藥姜黃（Curcuma longa L.）的有效成分，姜黃素（Curcumin）因具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎及殺蟲等廣譜藥理活性而在藥物創(chuàng)制領(lǐng)域備受青睞［8，9］.然而，姜黃素本身難溶于水，其分子中存在的β-二酮結(jié)構(gòu)易在中性和堿性條件下發(fā)生異構(gòu)化，使其難以被有機體吸收和有效利用［10，11］.在此背景下，藥物創(chuàng)制工作者對姜黃素分子結(jié)構(gòu)進行了多維度的改造，發(fā)現(xiàn)1，5-二芳基-1，4-戊二烯-3-酮分子不僅可以有效保持姜黃素分子的多種生物活性，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和毒副作用也得到顯著改善，可作為優(yōu)勢抗腫瘤先導(dǎo)分子進行深度的結(jié)構(gòu)發(fā)掘［12，13］.近年來，本課題組報道了一系列含有吡啶［14］、喹唑啉酮［15］、苯并三嗪酮［16］、亞磷酸酯［17］、肟酯［18］、喹唑啉［19］和磺酰胺［20］等片段的1，4-戊二烯-3-酮分子，并發(fā)現(xiàn)上述分子在抗病毒、抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌及抗炎等方面具有潛在的開發(fā)價值［Scheme 1（A）］.

Scheme 1 Reported penta-1,4-dien-3-one derivatives with casing anticancer activities(A),natural coumarin derivatives with anticancer activities(B) and design strategy of title compounds(C)

香豆素（Coumarin）是植物在受到環(huán)境脅迫后產(chǎn)生的苯駢α-吡喃酮類次生代謝產(chǎn)物.該物質(zhì)可以在植物受脅迫部位快速富集，有效促進植物對營養(yǎng)成分的吸收及抵御病原微生物的侵染，最終起到降低環(huán)境脅迫對作物植株損傷程度的效果［21］.迄今，近千種結(jié)構(gòu)各異的香豆素分子相繼在傘形科、瑞香科、豆科、菊科、桑科及茄科等植物中發(fā)現(xiàn)，這些香豆素分子通常以游離態(tài)或糖苷形式存在于植物的根、莖、葉等部位，表現(xiàn)出抑菌、抗病毒、殺蟲、抗凝血、抗炎、抗氧化及抗癌等多種生物活性［22，23］.近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)補骨脂素（Psoralen）［24］、花椒毒素（Xanthotoxin）［25］、香柑內(nèi)酯（Bergapten）［26］、歐前胡內(nèi)脂（Imperatorin）［27］和蛇床子素（Osthole）［28］等香豆素分子［Scheme 1（B）］可通過調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號通路的方式有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，上述分子的抗腫瘤活性與苯駢α-吡喃酮母核上存在的取代基類型和位置密切相關(guān)，使香豆素分子在抗腫瘤藥物創(chuàng)制方面具有巨大的潛力［29，30］.

鑒于香豆素結(jié)構(gòu)在抗癌領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，本文利用醚鍵將此天然抗癌單元有機融入1，4-戊二烯-3-酮分子骨架中，構(gòu)建了16個結(jié)構(gòu)新穎的單羰基姜黃素衍生物［結(jié)構(gòu)見Scheme 1（C）］，并采用甲基四氮唑鹽（MTT）比色法測試了目標(biāo)化合物對胃癌SGC7901細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞的體外抑制活性.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

4-羥基香豆素、2-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲醛、芳基甲醛、氫氧化鈉、無水乙醇、碳酸鉀和乙腈，分析純，上海泰坦科技股份有限公司；三氯氧磷和胰蛋白酶，純度98%，上海泰坦科技股份有限公司；36%鹽酸和98%丙酮，成都市科隆化學(xué)品有限公司；胎牛血清，天津市灝陽生物制品科技有限公司；MTT，北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展有限公司.

JEOL-ECX 500 型核磁共振波譜儀（NMR），日本電子株式會社；4000QTRAP 型三重四級桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（HRMS），美國AB Sciex公司；X-4型數(shù)顯熔點測定儀，北京泰克儀器有限公司；BSA124S型電子天平，德國Sartorius公司；MCO-18AC型CO2培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；BIO-RAD680型96孔板酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司；細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corning Incorporated公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州凈化工程有限公司；ELX800型酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 含香豆素結(jié)構(gòu)1，4-戊二烯-3-酮類衍生物（4a～4q）的合成 化合物4a～4q的合成路線見Scheme 2.

Scheme 2 Synthetic routes of target compounds 4a—4p

在冰浴條件下，將50 mmol 2-羥基苯甲醛或4-羥基苯甲醛溶于60 mL丙酮中，攪拌30 min后緩慢加入100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氫氧化鈉溶液.室溫下反應(yīng)24 h后，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至500 mL燒杯中，加入適量冰塊后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的鹽酸溶液調(diào)節(jié)體系pH值為5～6，析出大量黃色固體.過濾，濾餅用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液重結(jié)晶，再次過濾，得到中間體4-（2-羥基苯基）-3-丁烯-2-酮（1a）或4-（4-羥基苯基）-3-丁烯-2-酮（1b）黃色固體.

將25 mmol 中間體1 和30 mmol 芳基甲醛溶于50 mL 乙醇中，冰浴條件下緩慢滴加50 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氫氧化鈉溶液，用薄層色譜（TLC，石油醚/乙酸乙酯體積比3∶1）追蹤反應(yīng).待反應(yīng)完成后，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至500 mL燒杯中，加入適量冰塊后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的鹽酸溶液調(diào)節(jié)體系pH值為5～6，析出大量黃色固體.過濾，濾餅用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液重結(jié)晶，再次過濾，得到中間體2a～2p黃色固體.

將50 mmol 4-羥基香豆素溶于100 mL三氯氧磷中，加入30 mL三乙胺，加熱至回流反應(yīng)5 h.隨后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至燒杯中，用濃氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH值至中性，用二氯甲烷萃取（50 mL×3），無水硫酸鈉干燥有機相，減壓蒸餾除去溶劑，經(jīng)柱層析（石油醚/乙酸乙酯體積比10∶1）分離得到中間體3白色固體.

將2 mmol 中間體2、2 mmol 中間體3 和6 mmol 碳酸鉀加入60 mL 乙腈中，攪拌下加熱至回流，用TLC（石油醚/乙酸乙酯體積比3∶1）追蹤反應(yīng)進程.待反應(yīng)完成后過濾，濾液減壓蒸餾除去多余溶劑，經(jīng)柱層析（石油醚/乙酸乙酯體積比3∶1）分離得到目標(biāo)分子4a～4p.

中間體及目標(biāo)化合物的理化性質(zhì)如表1所示，目標(biāo)化合物的1H NMR 和13C NMR 數(shù)據(jù)見表2，譜圖見支持信息圖S1～S48.

Table 1 Appearance,yields,melting points and HRMS data of compounds 1—4

1.2.2 抗腫瘤活性測試 以商品化抗腫瘤藥物表柔比星（Epirubicin）為陽性對照，利用MTT 比色法測定了目標(biāo)分子4a～4p對胃癌SGC7901細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞的體外抑制活性［31，32］，上述細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫.取對數(shù)生長期細(xì)胞，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的胰蛋白酶消化后，重懸于含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，以4×104cell/mL 的終濃度接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL.將培養(yǎng)板置于37 ℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后吸掉培養(yǎng)基，加入含既定濃度待測藥物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，同時以等量的二甲基亞砜（DMSO）作為空白對照，每孔200 μL.注意培養(yǎng)基中DMSO 終濃度不能超過0.1%.去除上層清液，加入100 μL 含MTT 質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的培養(yǎng)基，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再補加100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的十二烷基硫酸鈉溶液.在37 ℃下培養(yǎng)10 h后取出，微振蕩5 min，室溫下放置30 min 后，在492 nm 波長下測定其OD 值，并基于OD值計算各化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制活性.上述實驗每個樣本濃度重復(fù)6個孔，每個實驗重復(fù)3次，取平均值為最終結(jié)果.隨后，通過光學(xué)顯微鏡觀察了高活性分子在作用24，48和72 h后對腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)分子的合成及結(jié)構(gòu)表征

鄰羥基苯甲醛或?qū)αu基苯甲醛在氫氧化鈉的作用下與丙酮發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)，得到中間體1a 或1b.隨后，中間體1a或1b繼續(xù)在氫氧化鈉的作用下與芳基甲醛發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)，得到在苯環(huán)鄰位或?qū)ξ缓辛u基的5-芳基-1，4-戊二烯-3-酮衍生物2a～2p.上述兩步羥醛縮合反應(yīng)條件溫和、操作簡便、產(chǎn)率均大于75%.同時，在三乙胺存在下，香豆素4位的羥基能在熱的三氯氧磷溶液中轉(zhuǎn)變?yōu)槁仍?值得注意的是，若用氯化亞砜代替三氯氧磷，反應(yīng)則無法順利得到重要中間體4-氯香豆素.最后，中間體2a～2p酚羥基上的氫原子被碳酸鉀拔除，所得氧負(fù)離子隨即進攻4-氯香豆素4位碳正離子，得到目標(biāo)分子4a～4p.

以目標(biāo)分子4o 的1H NMR，13C NMR 和HRMS 數(shù)據(jù)解析為例進行具體分析如下：δ8.01 處的雙峰為香豆素5 位質(zhì)子氫的信號峰；δ7.88 處的雙峰為戊二烯酮1 位與苯環(huán)相連烯烴質(zhì)子氫的信號峰；δ7.74～7.70處的多重峰為噻吩5位和苯環(huán)鄰位質(zhì)子氫的信號峰；δ7.62處的三重峰為香豆素7位上質(zhì)子氫的信號峰；δ7.42和7.09處的雙峰和三重峰分別為噻吩3位和4位質(zhì)子氫的信號峰；δ7.39～7.34處的多重峰為香豆素6 位和8 位以及戊二烯酮5 位烯烴質(zhì)子氫的信號峰；δ7.23 處的雙峰為戊二烯酮1 位苯環(huán)間位質(zhì)子氫的信號峰；δ7.03 和6.88 處的雙峰分別為戊二烯酮2 位和4 位烯烴質(zhì)子氫的信號峰；δ5.46處的單峰為香豆素3位質(zhì)子氫的信號峰.在化合物4o的13C NMR譜圖中，δ188.06處的吸收峰為戊二烯酮3位酮羰基碳的信號峰；δ165.98和162.41處的吸收峰為香豆素4位和2位碳的信號峰；δ94.02處的吸收峰為香豆素3位碳的信號峰；δ153.91～115.31處的吸收峰為其余芳環(huán)碳和烯烴碳的信號峰.化合物4o的HRMS譜圖顯示，［M+H］+離子峰為m/z401.0838，與其分子式C24H17O4S［M+H］+的計算值m/z401.0842非常接近.

2.2 目標(biāo)分子抗癌活性分析

目標(biāo)分子4a～4p對胃癌SGC7901細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞的抗腫瘤活性測試結(jié)果列于表3.可見，目標(biāo)分子4a～4f，4h～4n 和4p 在供試濃度為10 μmol/L 時對胃癌SGC7901 細(xì)胞體外增殖的抑制率為85.56%～98.77%，其抑制效果均優(yōu)于對照藥劑表柔比星（78.38%）.當(dāng)供試濃度下降為1 μmol/L時，目標(biāo)分子4c，4j，4l和4m對胃癌SGC7901細(xì)胞體外增殖的抑制率（86.98%，80.83%，42.73%和43.69%）要優(yōu)于對照藥劑表柔比星（42.43%）.進一步的生物活性測試結(jié)果（表4）表明，目標(biāo)分子4c和4j對胃癌SGC7901細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）值分別為0.22和0.27 μmol/L，其活性顯著優(yōu)于對照藥劑表柔比星（1.23 μmol/L）.同時，目標(biāo)分子4a～4c，4e，4f和4i～4c在供試濃度為10 μmol/L時對肝癌HepG2細(xì)胞體外增殖的抑制活性（85.80%～99.94%）顯著優(yōu)于對照藥劑表柔比星（81.64%）.當(dāng)供試濃度下降為1 μmol/L 時，除化合物4i 外的其它目標(biāo)分子均對肝癌HepG2 細(xì)胞體外增殖具有一定的抑制活性（＞6.30%），其中化合物4l對肝癌HepG2細(xì)胞體外增殖的抑制效果（66.69%）最佳，其活性顯著優(yōu)于對照藥劑表柔比星（1.36%）.由表4還可見，目標(biāo)分子4l對肝癌HepG2細(xì)胞的IC50值達(dá)到0.47 μmol/L，其活性顯著優(yōu)于對照藥劑表柔比星（2.30 μmol/L）.

Table 3 Inhibition rates(%) of title compounds against SGC7901 and HepG2 cells in vitro

由表3可以看出，1，4-戊二烯-3-酮骨架上取代基的位置和類型對目標(biāo)分子的抗腫瘤活性具有顯著影響，通過系統(tǒng)的對比分析總結(jié)如下.首先，將香豆素結(jié)構(gòu)引入戊二烯酮1位苯環(huán)的鄰位總體上有利于提高目標(biāo)分子對胃癌SGC7901細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞體外增殖的抑制活性.如，在戊二烯酮苯環(huán)鄰位含有香豆素結(jié)構(gòu)的化合物4c，4j，4l 和4m 在濃度為1 μmol/L 時對胃癌SGC7901 細(xì)胞（86.98%，80.83%，42.73%和43.69%）和肝癌HepG2細(xì)胞（25.42%，26.92%，66.69%和44.52%）體外增殖的抑制率均顯著優(yōu)于對照藥劑表柔比星（42.43%和1.36%）.其次，將戊二烯酮5位的苯環(huán)替代為六元吡啶雜環(huán)能更有利于改善目標(biāo)分子的抗腫瘤活性.如，含吡啶單元的化合物4a（Ar=Pyrid-2-yl，X=4-O-），4b（Ar=Pyrid-3-yl，X=4-O-）和4m（Ar=Pyrid-2-yl，X=2-O-）在濃度為1 μmol/L 時對胃癌SGC7901 細(xì)胞（16.87%，28.78%和43.69%）和肝癌HepG2細(xì)胞（11.42%，15.98%和44.52%）體外增殖的抑制率總體要優(yōu)于目標(biāo)分子4p（Ar=Ph，X=4-O-）和4d（Ar=Ph，X=2-O-）對胃癌SGC7901細(xì)胞（1.03%和22.47%）和肝癌HepG2細(xì)胞（12.79%和6.30%）的抑制率.對于Ar位置上為取代苯環(huán)的分子，其苯環(huán)鄰位或?qū)ξ灰爰籽趸鶎@著增強所得分子的抗腫瘤活性.如，目標(biāo)分子4c（Ar=2，4-di-OMePh，X=2-O-），4j（Ar=2-OMePh，X=2-O-）和4l（Ar=4-OMePh，X=2-O-）在濃度為1 μmol/L 時對胃癌SGC7901 細(xì)胞（86.89%，80.83%和42.43%）和肝癌HepG2 細(xì)胞（25.42%，26.92%和66.69%）體外增殖的抑制率顯著優(yōu)于目標(biāo)分子4d（Ar=Ph，X=2-O-）對胃癌SGC7901細(xì)胞（22.47%）和肝癌HepG2細(xì)胞（6.30%）的抑制率.

以DMSO 為空白對照，利用光學(xué)電子顯微鏡探究了表柔比星、化合物4c 和4j 分別作用于胃癌SGC7901 細(xì)胞24，48 和72 h 后在形態(tài)上的改變，結(jié)果示于圖1.由圖1 可見，用DMSO 處理過的SGC7901 細(xì)胞輪廓豐滿圓潤，多呈現(xiàn)為梭形，且細(xì)胞的數(shù)量隨著作用時間的延長而顯著增加.用10 μmol/L 表柔比星處理的SGC7901細(xì)胞數(shù)量顯著減少，在處理48 h后細(xì)胞輪廓出現(xiàn)了較明顯的不規(guī)則變化，甚至在72 h后出現(xiàn)破碎和裂解，上述變化在表柔比星濃度降至1 μmol/L時依舊存在.令人欣喜的是，用1 μmol/L目標(biāo)分子4c和4j僅在處理24 h后就能使SGC7901細(xì)胞發(fā)生萎縮和失活，這種現(xiàn)象隨著作用時間的延長而逐漸明顯，且顯著不同于表柔比星處理組出現(xiàn)的損傷型細(xì)胞變化.上述形態(tài)學(xué)觀察再次證實，含香豆素結(jié)構(gòu)1，4-戊二烯-3-酮衍生物能顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的體外增殖，可作為新型潛在高效抗腫瘤藥物進行深度的開發(fā)和研究.

Fig.1 Morphology effects of SGC7901 cells treated with DMSO(0.1%,mass fraction)(A),compounds 4c(B,C) and 4j(D,E),and Epirubicin(F,G) with 24(A1—G1),48(A2—G2) and 72 h(A3—G3)

3 結(jié)論

為開發(fā)新型高效抗腫瘤藥物分子，采用活性基團拼接原理將香豆素單元有機融入1，4-戊二烯-3-酮分子骨架中，設(shè)計合成了16個單羰基姜黃素衍生物4a～4p.通過1H NMR，13C NMR和HRMS等手段對目標(biāo)化合物進行了結(jié)構(gòu)表征，并采用MTT法測定了上述化合物對胃癌SGC7901細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞體外增殖的抑制活性，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)目標(biāo)分子均能顯著抑制上述兩種腫瘤細(xì)胞的增殖.其中，化合物4c 和4j 對SGC7901 細(xì)胞的IC50值達(dá)到了0.22 和0.27 μmol/L，其活性顯著優(yōu)于對照藥劑表柔比星（1.23 μmol/L）.同時，化合物4l 對HepG2 細(xì)胞的IC50值（0.47 μmol/L）也顯著優(yōu)于表柔比星（2.30 μmol/L）.細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究結(jié)果進一步證實，含香豆素結(jié)構(gòu)1，4-戊二烯-3-酮衍生物能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，可作為潛在高效抗腫瘤藥物候選分子進行深度的開發(fā).

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/20230337.