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    喹諾酮信號(hào)分子對(duì)lasR 缺陷型銅綠假單胞菌綠膿菌素活性的影響

    2023-12-18 13:09:02王延茹段金菊
    生物化工 2023年5期
    關(guān)鍵詞:菌素銅綠單胞菌

    王延茹,段金菊

    (1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理教研室,山西汾陽(yáng) 032200;2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 藥學(xué)部,山西太原 030001)

    銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)廣泛存在于自然界,是臨床分離率高且耐藥性強(qiáng)的條件致病菌[1-3]。綠膿菌素是PA 分泌的一種藍(lán)綠色吩嗪類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物,不僅能自由地穿透生物膜、干擾正常離子轉(zhuǎn)運(yùn)、打斷細(xì)胞呼吸鏈、過(guò)量產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)致細(xì)胞死亡,還參與細(xì)菌外排泵的激活[4-5],因此,綠膿菌素在PA 定植、感染以及耐藥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。綠膿菌素受多種調(diào)控信號(hào)網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)[6],研究較為成熟的是群體感應(yīng)(Quorum Sensing,QS)系統(tǒng),該系統(tǒng)參與綠膿菌素在內(nèi)的多種毒力因子的調(diào)控[7-10]。喹諾酮信號(hào)分子(Pseudomonas Quinolone Signal,PQS)是QS 系統(tǒng)中至關(guān)重要的信號(hào)分子[11-12],由于在慢性感染人群(如囊性纖維化患者)的臨床標(biāo)本中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)lasR缺陷突變菌[2,13],該菌不產(chǎn)生或產(chǎn)生極少量的內(nèi)源性PQS[2,7],卻能增強(qiáng)綠膿菌素的表達(dá)[13]。本研究選取臨床分離lasR 缺陷菌株與正常菌株為研究對(duì)象,對(duì)比探究PQS 不同誘導(dǎo)方案對(duì)兩種菌株綠膿菌素活性的影響,旨在進(jìn)一步了解PQS對(duì)銅綠假單胞菌致病性的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株

    收集2021 年3 月至2022 年10 月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院經(jīng)全自動(dòng)鑒定儀VITEK-2 鑒定的銅綠假單胞菌作為研究對(duì)象。正常組納入標(biāo)準(zhǔn):由臨床血培養(yǎng)及胸水腹水等無(wú)菌體液分離得到;非重復(fù)菌株;QS基因正常。排除標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)PCR 擴(kuò)增及DNA 測(cè)序檢測(cè)QS 基因lasR、rhlR、lasI、rhlI以及pqsR單一或多種基因缺失[14]。只有l(wèi)asR基因缺失菌株為缺陷組。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 15692(PAO1),為南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物學(xué)與微生物工程實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。收集到的正常菌株和lasR缺陷菌株作為本研究的原始菌株。

    1.1.2 試劑與儀器

    PQS,HPLC 級(jí),批號(hào)BCBR3314V,美國(guó)Sigma-Aldrich 公司;0.9%氯化鈉注射液,醫(yī)用級(jí),石家莊四藥有限公司;氯仿,分析純,北京化工廠(chǎng)有限責(zé)任公司;鹽酸,分析純,深圳市精成科技有限公司;血培養(yǎng)皿,濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司;綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基,批號(hào)210322,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;一次性使用培養(yǎng)皿,江蘇康健醫(yī)療用品有限公司;LB 液體培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

    SpectraMax 190 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,上海美谷分子儀器有限公司;BY-R20 型低溫高速離心機(jī),北京白洋醫(yī)療器械有限公司;GNP-9270BS-Ⅲ隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;LMQ.C 型立式高壓滅菌鍋,山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;21255 麥?zhǔn)媳葷醿x,生物梅里埃公司;Costar-3599 型96 孔板,美國(guó)康寧公司。

    1.2 方法

    1.2.1 PQS 誘導(dǎo)方案

    (1)復(fù)蘇菌株:將保存于-70 ℃的原始菌株接種于血培養(yǎng)皿,37 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng);(2)配制含PQS培養(yǎng)基:分別配制10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的含PQS 固體培養(yǎng)基;(3)傳代培養(yǎng):將純化的銅綠假單胞菌用無(wú)菌0.9%NaCl 調(diào)成3.0 麥?zhǔn)蠁挝唬【?0 μL 接種于上述含藥培養(yǎng)基中,恒溫培養(yǎng)24 h后作為誘導(dǎo)一天的菌株;將誘導(dǎo)一天菌株用無(wú)菌0.9%NaCl 調(diào)成3.0 麥?zhǔn)蠁挝?,取菌?0 μL 接種于上述含PQS 新培養(yǎng)基中繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h 作為誘導(dǎo)第二天的菌株;以此類(lèi)推,分別誘導(dǎo)至第五天,將完成誘導(dǎo)的菌株分別在-70 ℃保存于液體培養(yǎng)基中。

    1.2.2 綠膿菌素活性的測(cè)定

    (1)綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基的配制:按每100 mL蒸餾水中含4.64 g 綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基、1 g 甘油的比例進(jìn)行配制,充分搖勻,以121 ℃高壓滅菌20 min,室溫冷卻至50 ~60 ℃,傾倒于一次性培養(yǎng)皿中(大約20 mL),靜置至完全凝固,于4 ℃冰箱保存,備用(七天內(nèi)用完)[15]。

    (2)OD600的測(cè)定:復(fù)蘇菌株后,挑取單個(gè)菌落于經(jīng)高壓滅菌的LB 培養(yǎng)液中,使用比濁儀調(diào)節(jié)菌懸液的麥?zhǔn)蠁挝粸?.5,吸取200 μL 于96 孔板中,用酶標(biāo)儀測(cè)OD600(LB 培養(yǎng)液做空白對(duì)照)。

    (3)菌懸液的培養(yǎng):取上述2 mL LB 菌懸液于24 孔板中,置于振蕩器上振蕩培養(yǎng)24 h(130 r/min,37 ℃)。

    (4)OD520的測(cè)定:將24 孔板中的菌懸液吸取到滅菌EP 管中,經(jīng)高速離心機(jī)12 000 r/min 離心5 min,取上清于滅菌試管中,加入3 mL 氯仿,吸打混勻,輕輕搖動(dòng)萃取20 min;將下層溶液移入干凈的試管,加入1 mL 0.2 mol/L 的鹽酸,吸打混勻,輕輕搖動(dòng)萃取20 min;取上層鹽酸溶液于96 孔板,酶標(biāo)儀測(cè)OD520(空白對(duì)照為L(zhǎng)B 培養(yǎng)液經(jīng)雙相萃取后的鹽酸溶液)。

    (5)活性計(jì)算。綠膿菌素活性=OD520/OD600。

    1.3 觀(guān)察指標(biāo)與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

    觀(guān)察正常組和缺陷組經(jīng)不同濃度PQS(10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)和不同時(shí)間(1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d)誘導(dǎo)綠膿菌素活性的變化,以未進(jìn)行PQS誘導(dǎo)的原始菌株的OD520/OD600值作為基值,高于或低于原始菌株的基值被認(rèn)為促進(jìn)或抑制綠膿菌素的活性。誘導(dǎo)前正常組和缺陷組綠膿菌素活性的大小與質(zhì)控菌株進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,誘導(dǎo)前正常組和缺陷組綠膿菌素活性的比較采用秩和檢驗(yàn),P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;原始菌株經(jīng)不同濃度PQS 和不同時(shí)間誘導(dǎo)對(duì)綠膿菌素活性的影響采用重復(fù)測(cè)量方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株的收集

    從臨床分離得到符合條件的原始菌株共10 株,正常組和缺陷組各5 株,分別經(jīng)不同濃度PQS 和不同時(shí)間誘導(dǎo)最終共保存160 株銅綠假單胞菌。

    2.2 PQS 誘導(dǎo)前正常組和缺陷組綠膿菌素活性的比較

    PQS 誘導(dǎo)前正常組與缺陷組綠膿菌素活性比較的結(jié)果見(jiàn)表1,P=0.008,表明誘導(dǎo)前兩組的綠膿菌素活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),缺陷組的綠膿菌素活性低于正常組,缺陷組的綠膿菌素活性低于PAO1。

    表1 誘導(dǎo)前兩組綠膿菌素活性的比較

    2.3 PA 經(jīng)PQS 不同誘導(dǎo)方案后正常組和缺陷組綠膿菌素活性的比較

    不同誘導(dǎo)方案下,正常組和缺陷組綠膿菌素活性結(jié)果如表2 所示,相關(guān)分析見(jiàn)2.3.1 和2.3.2。

    表2 正常組和缺陷組經(jīng)PQS 不同誘導(dǎo)方案綠膿菌素活性的組內(nèi)比較

    2.3.1 正常組與缺陷組組內(nèi)比較

    正常組與缺陷組經(jīng)PQS 不同誘導(dǎo)方案綠膿菌素活性的組內(nèi)比較見(jiàn)表3。結(jié)果表明,不考慮誘導(dǎo)濃度間的差異(即不同誘導(dǎo)時(shí)間下的活性均值),正常組在不同時(shí)間的綠膿菌素活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),缺陷組活性差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);不考慮誘導(dǎo)時(shí)間之間的差異(即不同誘導(dǎo)濃度下的活性均值),正常組在不同誘導(dǎo)濃度下的綠膿菌素活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),缺陷組活性差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    表3 正常組和缺陷組經(jīng)PQS 不同誘導(dǎo)方案綠膿菌素活性的組內(nèi)比較

    具體地,正常組隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)綠膿菌素的活性不同程度地增加(除了誘導(dǎo)3 d 時(shí)活性較1 d 和2 d稍有降低),其中10 μmol/L 和80 μmol/L 的誘導(dǎo)濃度下差異顯著(P<0.05),40 μmol/L 時(shí)差異不顯著(P>0.05);缺陷組在同一誘導(dǎo)濃度下隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)綠膿菌素的活性變化不明顯(P>0.05)。除了正常組在誘導(dǎo)3 d 時(shí)隨誘導(dǎo)濃度的增加綠膿菌素的活性變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),兩組在同一誘導(dǎo)時(shí)間下隨誘導(dǎo)濃度的增加綠膿菌素的活性變化均不明顯(P>0.05)。正常組和缺陷組的誘導(dǎo)時(shí)間與誘導(dǎo)濃度之間均無(wú)交互作用(正常組F=0.612,P=0.643;缺陷組F=0.919,P=0.446),表明兩組分別在不同PQS 誘導(dǎo)濃度下,綠膿菌素活性隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)變化的趨勢(shì)相近。

    2.3.2 正常組與缺陷組組間比較

    正常組與缺陷組經(jīng)不同誘導(dǎo)方案綠膿菌素活性的組間比較見(jiàn)表4,兩組菌株在誘導(dǎo)1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d 時(shí)綠膿菌素活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),缺陷組的綠膿菌素活性均顯著低于正常組。兩組菌株在誘導(dǎo)濃度10 μmol/L、40 μmol/L 和80 μmol/L 時(shí),綠膿菌素活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),缺陷組的綠膿菌素活性均低于正常組。

    表4 正常組與缺陷組經(jīng)不同誘導(dǎo)方案綠膿菌素活性的組間比較

    3 結(jié)論與討論

    銅綠假單胞菌導(dǎo)致的嚴(yán)重感染與其自身產(chǎn)生的毒力因子密切相關(guān),毒力因子活性越強(qiáng),引起的感染癥狀越嚴(yán)重。PA 的毒力因子主要受三個(gè)QS 系統(tǒng),即以高絲氨酸內(nèi)酯為信號(hào)分子的Las 系統(tǒng)、Rhl 系統(tǒng)和以喹諾酮類(lèi)為信號(hào)分子的PQS 系統(tǒng)的調(diào)控。三個(gè)系統(tǒng)相互制約,構(gòu)成一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜而又井然有序的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Las 系統(tǒng)位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游,由轉(zhuǎn)錄激活因子lasR 和信號(hào)合成酶lasI 組成,正向調(diào)控Rhl 和PQS系統(tǒng);PQS 系統(tǒng)位于中間層級(jí),起連接作用,可正調(diào)節(jié)rhlI、lasI基因的表達(dá),又受Rhl 系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)[7-9,16]。綠膿菌素的生成主要受Rhl 和PQS 系統(tǒng)的調(diào)控,PQS可直接上調(diào)phzA-G 操縱子的表達(dá),促進(jìn)吩嗪類(lèi)的合成[17-18],如DIGGLE 等[19]發(fā)現(xiàn)外源性PQS 能促進(jìn)綠膿菌素的提前表達(dá)。本課題組前期研究[12]已表明,與誘導(dǎo)前相比,外源性PQS 不同誘導(dǎo)方案對(duì)銅綠假單胞菌綠膿菌素的活性有促進(jìn)作用,但是只研究了基因正常的銅綠假單胞菌,可能忽略了內(nèi)源性PQS 對(duì)綠膿菌素活性的影響。

    研究表明,囊性纖維化患者臨床標(biāo)本中經(jīng)常出現(xiàn)的lasR缺陷突變株不產(chǎn)生或產(chǎn)生極少量的內(nèi)源性PQS,部分突變株能生成綠膿菌素,甚至有研究顯示Las 系統(tǒng)對(duì)綠膿菌素的生成呈負(fù)向調(diào)控,PAO1 的lasR缺陷突變株比野生型菌株生成綠膿菌素的能力增強(qiáng)[2,10,13]。然而,本研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)前l(fā)asR缺陷菌株的綠膿菌素活性低于正常菌株和PAO1,可能與菌株的來(lái)源有關(guān),菌株所處的環(huán)境不同,相應(yīng)的適應(yīng)性改變也有所差異。缺陷菌株因無(wú)法激活Las 系統(tǒng),影響中下游PQS 和Rhl 系統(tǒng)的功能,不利于綠膿菌素的生成。

    本研究中兩組菌株經(jīng)不同PQS 誘導(dǎo)方案綠膿菌素活性變化有差異,其中正常組菌株在不同誘導(dǎo)方案下綠膿菌素活性呈不同程度地促進(jìn),缺陷組菌株在不同誘導(dǎo)方案下綠膿菌素活性變化不明顯,缺陷組菌株綠膿菌素活性始終低于正常組。一方面說(shuō)明lasR 可能在綠膿菌素的生成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,推測(cè)綠膿菌素的表達(dá)可能也受Las 系統(tǒng)調(diào)控;另一方面表明,PQS 信號(hào)分子雖然可促進(jìn)綠膿菌素表達(dá),但可能不是主要影響因素。對(duì)于這些推測(cè)尚需進(jìn)行基因和蛋白水平的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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