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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接分析益氣復(fù)脈粉針劑預(yù)防心肌缺血再灌注損傷的作用機制

    2023-12-18 13:08:46王俊鵬何正大
    生物化工 2023年5期
    關(guān)鍵詞:粉針劑復(fù)脈皂苷

    王俊鵬,何正大

    (中國藥科大學 中藥學院,江蘇南京 211112)

    急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)是一種十分嚴重的心血管疾病,威脅著人們的生命和健康。目前最有效的治療方法是通過血運重建從而快速恢復(fù)冠狀動脈血流,使血液再灌注[1]。但是在血流恢復(fù)后部分患者的病情會出現(xiàn)加重的情況,這引起了臨床醫(yī)生和研究者們的注意。

    1960 年,研究者在通過結(jié)扎實驗狗的冠狀動脈導(dǎo)致心肌缺血的研究中發(fā)現(xiàn)了再灌注本身就可以加重心肌損傷,增加梗死面積,他們把這種心肌組織在短暫缺血之后恢復(fù)血流而導(dǎo)致組織進一步損傷的現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(Myocardial Ischemia Reperfusion Injury,MIRI)[2-3]。MIRI 包括多種不同的病理生理過程,如線粒體膜損傷、一氧化氮代謝紊亂、免疫激活、細胞凋亡及自噬等。以往的研究表明,MIRI 過程中將會破壞機體氧化和抗氧化過程,致使脂質(zhì)發(fā)生過氧化,最終對微血管和組織細胞造成不可逆的損傷[4]。

    近年來,人們對于MIRI 機制的認識已取得了長足的進步,但現(xiàn)有的臨床治療效果依然有限。中藥復(fù)方具有多角度、多靶點的診療效果,其在預(yù)防心肌缺血再灌注損傷方面產(chǎn)生的作用受到研究者的廣泛關(guān)注,以期改善MIRI 患者所面臨的損傷風險。益氣復(fù)脈粉針劑(YQFM)是參麥方的一種現(xiàn)代臨床應(yīng)用形式,源于古方“生脈散”,由紅參、麥冬、五味子3種中藥組成,具有益氣生津、斂陰止汗的功效。其中,紅參作為君藥,能大補元氣、鼓舞清陽;麥冬作為臣藥,能養(yǎng)陰生津、清心除煩;五味子用為佐使,能斂肺寧心、止汗生津;諸藥配伍以共奏益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津之功[5]。YQFM在臨床上常用于治療冠心病、心力衰竭心肌病等。

    網(wǎng)絡(luò)藥理學是融合系統(tǒng)生物學、分子藥理學、網(wǎng)絡(luò)生物學等多學科的一門新技術(shù),通過研究藥物在整體網(wǎng)絡(luò)中與某個特定節(jié)點之間存在的相互生物作用關(guān)系,進而從系統(tǒng)與整體角度探索并解釋藥物與機體相互作用的機制[6]。計算機輔助藥物設(shè)計(CADD)方法當前被廣泛用于提高藥物設(shè)計的效率。AutoDock軟件通過模擬小分子產(chǎn)物于蛋白質(zhì)受體中不同位置相同能量下的構(gòu)象變化,預(yù)測分子的作用位點[7]。

    本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接方法,初步研究YQFM 預(yù)防MIRI 的相關(guān)核心生物成分、關(guān)鍵信號通路與分子動力學過程,為臨床應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 使用軟件及相關(guān)線上數(shù)據(jù)庫

    本研究使用的軟件和相關(guān)的數(shù)據(jù)庫見表1。

    表1 使用的軟件及數(shù)據(jù)庫

    1.2 益氣復(fù)脈粉針劑活性成分篩選及靶點預(yù)測

    使用中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)和中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺(TCMIP)對紅參、五味子和麥冬關(guān)鍵詞進行檢索,可得到對應(yīng)的藥物化學成分。類藥性(Druglikeness,DL)是通過比對已知藥物與目標化合物的相似性,從而初步對其成藥可能性進行打分的標準[8]。對于TCMSP 中的成分數(shù)據(jù),設(shè)定DL ≥0.18,篩選得到的成分為潛在的活性成分[9];對于TCMIP 中的成分數(shù)據(jù),則根據(jù)Druglikeness Grading 一項篩選標記為Moderate 或Good,且將之化學成分導(dǎo)入SwissADME 數(shù)據(jù)庫中,將DL 一 欄5 項(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)中有3 項及以上為Yes 的成分作為潛在的活性成分[10]。此外,結(jié)合文獻,根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域研究,將不符合上述標準但經(jīng)實驗認定可能是有效成分的化合物也納入考量范圍[11-13]。使用Pubchem 獲得前述備選化學成分的2D 結(jié)構(gòu)與InChiKey,導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫,物種選擇“智人”(Homo Sapiens),以probability >0 為篩選條件預(yù)測其作用靶點,整理匯總相關(guān)數(shù)據(jù),得到Y(jié)QFM 中的活性成分作用靶點。

    1.3 MIRI 靶點收集篩選

    使用DrugBank、OMIM、GeneCards 數(shù)據(jù)庫,以“myocardial ischemia reperfusion injury”為關(guān)鍵詞進行查詢,獲取心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的相關(guān)基因靶點,對所得結(jié)果去重后建立MIRI 的潛在靶點數(shù)據(jù)庫,將之同YQFM 的活性成分作用靶點進行比對并取交集,得到Y(jié)QFM-MIRI 共同靶點。

    1.4 益氣復(fù)脈核心成分與候選靶點的篩選與獲取

    將所得的YQFM-MIRI 共同靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.8 軟件,構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò),分析網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵拓撲參數(shù),根據(jù)Degree,Betweenness Centrality,Closeness Centrality 大于中位數(shù)這一標準獲取候選靶點。

    1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的形成以及核心靶點的篩選與分析

    將所得到的候選靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫,物種設(shè)置為“Homo Sapiens”,構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。使用CytoScape 3.8 對所得的數(shù)據(jù)進行處理。

    1.6 GO 功能及KEGG 通路富集分析

    使用MetaScape 數(shù)據(jù)庫對候選靶點進行GO 富集分析與KEGG 通路富集分析,將P<0.05 作為具有生物學意義的臨界值,繪制生物學過程GO 分析條形圖與KEGG 通路條形圖。

    1.7 分子對接

    使用PDB 數(shù)據(jù)庫與AlphaFold 數(shù)據(jù)庫獲得所需的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)文件,使用PubChem 獲取所需的化學成分分子的3D 結(jié)構(gòu)文件,不具有3D 結(jié)構(gòu)的化學成分分子,則使用Chem3D 19.0 構(gòu)建最小化化學能的分子結(jié)構(gòu)。使用AutoDock Tools 1.5.7 處理由先前篩選所得到的小分子配體與靶蛋白,并使用Vina 將核心成分與靶蛋白進行分子盲對接(Blinding Dock)操作,對對接產(chǎn)生的聚合體進行評定,記錄對接完成后分子在蛋白質(zhì)空間構(gòu)象中的相對位置,并輸出對接打分(結(jié)合能),使用GraphPad Prism 8 對數(shù)據(jù)進行熱圖分析,使用Pymol 2.6 軟件和ProteinPlus 對分子對接結(jié)果進行處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 益氣復(fù)脈粉針劑中的治療靶點與核心成分

    使用TCMSP 與TCMIP 數(shù)據(jù)庫篩選得到的藥物活性化學成分共計104 個,其中紅參成分35 個、五味子成分50 個、麥冬成分19 個?;赟wissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫與TCMSP 數(shù)據(jù)庫預(yù)測紅參活性成分對應(yīng)基因靶點有53 個,五味子活性成分對應(yīng)基因靶點有55 個,麥冬活性成分對應(yīng)的基因靶點有123 個,合并并去除重復(fù)靶點后可得出YQFM共含有潛在作用靶點189 個。通過檢索OMIM、GeneCards、DrugBank 數(shù)據(jù)庫并去除重復(fù)項后總結(jié)出MIRI 相關(guān)靶點1 215 個。將二者進行匹配,可得知YQFM 可調(diào)控MIRI 相關(guān)的33 個潛在靶點(圖1)。以這33 個潛在靶點搜索并統(tǒng)計YQFM 的活性成分數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)有49 個活性成分為預(yù)防MIRI 的有效成分。構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)進行拓撲參數(shù)分析(圖2),根據(jù)前文所述的條件進行篩選,發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2、人參皂苷Rf、β-谷甾醇、戈米辛S、戈米辛T 和麥冬二氫高異黃酮B 可能是YQFM 預(yù)防MIRI 的核心成分(表2)。

    圖1 成分-疾病共同靶點韋恩圖

    圖2 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

    表2 YQFM 核心成分

    2.2 YQFM 預(yù)防MIRI 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建

    使用String 數(shù)據(jù)庫對上述內(nèi)容中取交集得到的33 個共同靶點進行處理,物種選擇“Homo Sapiens”(智人),構(gòu)建蛋白相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)(圖3)。使用Cytoscape 3.8 軟件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行處理,經(jīng)分析可知網(wǎng)絡(luò)共有33 個節(jié)點,160 條邊,網(wǎng)絡(luò)平均度數(shù)為9.7,其中顏色的深淺與節(jié)點大小代表著節(jié)點的度數(shù),使用Centiscape 2.2 插件對其進行進一步分析,計算出其中得分較高的靶點,處理結(jié)果見圖3,節(jié)點的度數(shù)越大,則表明該節(jié)點的生物學功能越重要,越可能是影響MIRI 發(fā)生的基因靶點。結(jié)果顯示,內(nèi)皮一氧化氮合成酶(NOS3)、腎上腺素能受體B2(ADRB2)、腫瘤壞死因子(TNF)、過氧化物酶體增生激活受體γ編碼基因(PPARG)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(SRC)、胱天蛋白酶3(CASP3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS2)、雌激素受體1(ESR1)與其他蛋白的關(guān)聯(lián)程度相對較大,這些靶點極可能是YQFM 預(yù)防MIRI 的關(guān)鍵作用靶點。

    圖3 關(guān)鍵靶點蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

    2.3 潛在靶點GO 富集與KEGG 富集分析結(jié)果

    使用MetaScape 數(shù)據(jù)庫以P<0.05 為標準進行GO分析(圖4A)與KEGG分析(圖4B),X軸為-log10(P),Y 軸為富集條目或途徑;圖中顏色越深P值越大。GO 預(yù)測YQFM 中核心成分主要參與的生物過程關(guān)鍵指標,如節(jié)律過程、血液循環(huán)、平滑肌細胞增殖調(diào)節(jié)和血壓調(diào)節(jié)等關(guān)鍵指標。KEGG 富集分析結(jié)果表明,脂質(zhì)與動脈粥樣硬化(Lipid and atherosclerosis)、癌癥蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)、血管內(nèi)皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)、癌癥通路(Pathways in cancer)和化學致癌-受體激活(Chemical carcinogenesis-receptor activation)與YQFM 預(yù)防MIRI的作用機制密切相關(guān)。

    圖4 富集結(jié)果

    2.4 分子對接結(jié)果

    使用AutoDock Vina 1.1.2 對YQFM 中的6 種核心成分與上述的8 個關(guān)鍵靶點進行親和力研究和分子結(jié)合模式模擬,使用GraphPad Prism 8 軟件統(tǒng)計并處理輸出熱圖。如圖5 所示,結(jié)合能均≤-5 kcal/moL,表明分子與目標蛋白之間存在較好的結(jié)合能力。選取其中具有代表性的分子對接結(jié)果,使用ProteinPlus繪制二維對接圖進行展示,見圖6。

    3 討論與結(jié)論

    通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法研究發(fā)現(xiàn),YQFM 發(fā)揮藥效的有效成分為33 個,其中以β-谷甾醇、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rf 為首的共6 種成分可能是YQFM 在預(yù)防MIRI 過程中發(fā)揮藥效的主要活性物質(zhì)。近些年,有研究表明β-谷甾醇通過提高超氧化物歧化酶表達間接降低活性氧水平,從而降低心肌炎癥反應(yīng)[14];人參皂苷Rh2 是一種藥理作用廣泛的化學物質(zhì),邵懇等[15]經(jīng)動物實驗研究發(fā)現(xiàn)其通過增加大鼠MIRI 后外周血內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量從而對大鼠受損心肌發(fā)揮保護作用;人參皂苷Rf 能抑制COX-2 蛋白表達,后者一般在缺氧條件下被誘導(dǎo)激活,產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì),這說明人參皂苷Rf 能夠?qū)θ毖醯男募〖毎a(chǎn)生一定的保護,具有抗炎活性[16]。

    通過GO 功能分析發(fā)現(xiàn)YQFM 可能通過參與節(jié)律過程、血液循環(huán)、平滑肌細胞增殖調(diào)節(jié)和血壓調(diào)節(jié)等生物進程發(fā)揮其預(yù)防MIRI 的作用。KEGG 富集分析結(jié)果則顯示,YQFM 與MIRI 的關(guān)鍵候選基因SRC、PPARG、NOS3、TNF、CASP3 均富集于脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路。實驗證據(jù)支持TNF 在MIRI 中以活躍形式存在,且通過抑制炎性細胞因子TNF-α 的表達可起到縮小心肌梗死面積,減輕MIRI的效果[17];NOS3 是參與血管生成調(diào)控的關(guān)鍵基因,NOS3 水平的升高可以緩解MIRI 的發(fā)作程度[18];近年的研究關(guān)注到PPARG 的磷酸化激活可以顯著緩解心律失常與心肌細胞氧化應(yīng)激和凋亡,而抑制PPARG 的表達則會促進MIRI 誘發(fā)嚴重心律失常[19];PTGS2 是前列腺素-過氧化物內(nèi)酯合酶的一種亞型,其在炎癥反應(yīng)中起到了特定的作用,當前研究表明,抑制PTGS2 可減少心肌梗死的炎癥反應(yīng)并且改善心肌重塑效果[20]。

    綜上所述,本研究通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接方法初步對益氣復(fù)脈粉針劑的預(yù)防心肌缺血再灌注分子機制做出了解釋,并發(fā)現(xiàn)益氣復(fù)脈粉針劑可能是通過人參皂苷Rf、人參皂苷Rh2、β-谷甾醇等核心成分通過作用于TNF、SRC、NOS3、PTGS2、CASP3 等靶點來調(diào)控脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、血管內(nèi)皮生長因子信號通路等,從而發(fā)揮了對心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防與治療作用。本研究為益氣復(fù)脈粉針劑的藥理作用機制相關(guān)研究提供了一種思路和方法,為今后深入探討益氣復(fù)脈粉針劑對MIRI 的作用機制提供了參考。

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