基于JAK2/STAT3信號(hào)通路探究象皮生肌膏對(duì)肛瘺術(shù)后模型大鼠創(chuàng)面修復(fù)的影響*

黃靜雯，尹園緣，劉 穎，鄒巍瑩，程 揚(yáng)，詹 敏，余 煉，賓東華，

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

肛瘺（anal fistula）是位于肛周皮膚和直腸之間的一個(gè)異常通道，由內(nèi)口、瘺管、外口組成[1]。肛瘺占所有肛腸疾病的8%～25%，常見于中青年男性[2]。臨床主要表現(xiàn)為：肛周疼痛，肛周硬結(jié)，肛瘺外口持續(xù)性或間斷性流膿性及血性、黏液性分泌物，肛周皮膚瘙癢等[3]。肛瘺治愈率最高的治療方法是手術(shù)，包括瘺管的開放和切除，但手術(shù)治療只是第一步，術(shù)后創(chuàng)面的愈合尤為關(guān)鍵[4]。中醫(yī)藥在肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的治療中發(fā)揮了強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，不僅可以緩解術(shù)后傷口疼痛，還能加快促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，縮短病程[5]。象皮生肌膏出自張山雷《瘍科綱要》，是由象皮、鱉甲、生地黃、當(dāng)歸、爐甘石、血余炭、生石膏等藥材制成的藥膏，具有清熱解毒止癢、活血消腫止痛、斂瘡去腐生肌等功效[6]。湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院對(duì)原方藥物及藥量進(jìn)行化裁，并改進(jìn)制膏工藝，將其制作成膏劑用于臨床。研究[7]表明，象皮生肌膏能促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面恢復(fù)，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，但目前對(duì)其與炎癥反應(yīng)相關(guān)的機(jī)制仍未完全明確。因此，研究象皮生肌膏作用于創(chuàng)面、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制具有重要意義。

現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，炎癥反應(yīng)在造成肛瘺術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)緩慢中至關(guān)重要[8]。白介素-6（IL-6）是具有代表性的炎癥細(xì)胞因子，Janus激酶（JAK2）/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路是一條重要的炎癥反應(yīng)信號(hào)通路[9]，且IL-6能作用于JAK2/STAT3 信號(hào)通路并產(chǎn)生連鎖反應(yīng)。JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白[糖蛋白130（gp130）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、JAK2、磷酸化STAT3（p-STAT3）、STAT3]可在肛瘺創(chuàng)面肉芽組織可表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過研究JAK2/STAT3信號(hào)通路在肛瘺術(shù)后大鼠模型中的影響，探討象皮生肌膏在肛瘺術(shù)后創(chuàng)面炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制，旨在為肛瘺術(shù)后創(chuàng)面恢復(fù)的臨床指導(dǎo)用藥提供進(jìn)一步的依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只SPF級(jí)健康成年的SD大鼠（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供），動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。雌雄各半，體質(zhì)量210～250 g。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，溫度20～25 ℃，濕度50%～70%，12 h/12 h明暗光照。所有操作均遵循湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，倫理號(hào)：ZYFY20220225-01。

1.2 主要藥物及試劑 象皮生肌膏（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備，湘藥制字Z20070276，藥品批次：20211212，組成：象皮、當(dāng)歸、生地黃、爐甘石、血余炭、生石膏等）；凡士林（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑研究室制備）。蘇木素-伊紅染色液（廣州維格斯生物科技有限公司，批號(hào)：20211217）；中性樹膠（中國上海標(biāo)本模型廠，批號(hào)：20220802）；二甲苯（批號(hào)：1919BA1016）、RIPA裂解液（強(qiáng)）（批號(hào)：111522230104）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：111622230120）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜（美國Merck Millipore，批號(hào)：R1KB43735）；磷酸化gp130抗體[賽信通（上海）生物試劑有限公司CST，批號(hào)：20220218]；IL-6抗體（批號(hào)：20220307）、JAK2抗體（批號(hào)：20220425）、p-JAK2抗體（批號(hào)：20220316）、STAT3抗體（批號(hào)：20220215）、p-STAT3抗體（批號(hào)：20220310）均購自湖南艾方生物科技有限公司；Perfect Start Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：Q51224）；DEPC水（德國Sigma公司，批號(hào)：G511BA0019）；RNase inhibitor（批號(hào)：01031869）、dNTPs（批號(hào)：962220F14W04）、Revert Aid Reverse Transcriptase（批號(hào)：91254552）均購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 主要儀器 顯微鏡（德國萊卡公司，型號(hào)：DM2000 LED）；電泳儀電源（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYY-7C）；雙垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYCZ-24DN）；快速轉(zhuǎn)膜儀（金斯瑞生物科技股份有限公司，型號(hào)：eBlotTML1）；酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司，型號(hào)：ELX800）；化學(xué)發(fā)光儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：ClinxChemiScope 6000）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，型號(hào)：Q1）；超微量核酸分析儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：Nano-200）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 參照付小兵等[10]制定的肛瘺術(shù)后造模法并加以改進(jìn)，將36只SD大鼠于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為象皮生肌膏組、凡士林組、假手術(shù)組和模型組，每組9只。稱量每只大鼠體質(zhì)量，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（4 mg/100 g），約5 min后麻醉成功。大鼠肛門部備皮后，用0.1%絡(luò)合碘消毒備皮區(qū)域，再用50 mL注射針頭從肛門插入，于肛門左側(cè)（截石位3點(diǎn)）約1 cm處穿出，接著用約10 cm鋼絲沿孔徑穿入，擰緊鋼絲固定，以上操作結(jié)束后大鼠生命體征平穩(wěn)，無不良反應(yīng)，大鼠肛瘺模型造模成功。觀察30 d后，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（4 mg/100 g），沿鋼絲行瘺管切除術(shù)（假手術(shù)組除外），取瘺管下組織，術(shù)后棉球加壓止血，大鼠生命體征平穩(wěn)，無不良反應(yīng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)給藥 模型組：每日于創(chuàng)面滴0.2 mL生理鹽水，再覆蓋無菌紗布固定，2次/d，連續(xù)滴液10 d。象皮生肌膏組：用約2 g象皮生肌膏做成的油紗條覆蓋創(chuàng)面，再覆蓋無菌紗布固定。換藥2次/d，連續(xù)換藥10 d。凡士林組：用約2 g凡士林膏做成的油紗條覆蓋創(chuàng)面，再覆蓋無菌紗布固定。換藥2次/d，連續(xù)換藥10 d。以上3組在用藥前均使用生理鹽水對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行清洗，再使用碘伏消毒創(chuàng)面，將肛門部殘留糞便及壞死性分泌物清理干凈后再用藥治療。假手術(shù)組未行瘺管切除術(shù)，不用給藥治療。

2.3 取材 給藥第5、10天，按照隨機(jī)數(shù)字表法于各實(shí)驗(yàn)組大鼠選6只，取肛瘺術(shù)后同一側(cè)創(chuàng)面的同一部位約150 mg肉芽組織標(biāo)本（假手術(shù)組取瘺管下正常肉芽組織標(biāo)本），放入-80 ℃冰箱保存，或4%多聚甲醛固定保存。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合率 給藥第3、5、7、10天，在大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面用0.25 cm×0.25 cm的無菌透明方格紙（愛孚貼）測(cè)量局部創(chuàng)面組織面積并記錄，并與給藥第0天時(shí)創(chuàng)面面積進(jìn)行比較，獲得各組的動(dòng)態(tài)創(chuàng)面愈合率。計(jì)算公式為：創(chuàng)面愈合率（%）=（第0天創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/第0天創(chuàng)面面積×100%。

2.4.2 大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面肉芽組織形態(tài) 采用HE染色法（hematoxylin-eosin staining）觀察各組大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面肉芽組織形態(tài)。將肛瘺術(shù)后創(chuàng)面肉芽組織固定于4%多聚甲醛，進(jìn)行梯度脫水并包埋，切成約5 μm切片。蘇木素染色液染5 min，自來水沖洗，分色液進(jìn)行分化，再用自來水沖洗并反藍(lán)切片。放入乙醇中梯度脫水，伊紅染色5 min，最后中性樹膠封片并觀察。

2.4.3 創(chuàng)面肉芽組織IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量 采用RT-qPCR法測(cè)定創(chuàng)面肉芽組織IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。向細(xì)胞或組織樣本中加入500μL Trizol，向加有Trizol的1.5mL EP管中加入100μL氯仿，震蕩混勻后，靜置5 min，在12 000 r/min（離心半徑為8.6 cm），4 ℃離心10 min（離心半徑為8.6 cm）。從離心機(jī)中取出1.5 mL EP管，再將上層無色透明的水相層吸入到另一干凈的1.5 m LEP管中。樣品分為3層，RNA位于上層水相中。加入等體積的異丙醇，上下輕輕顛倒混勻之后，靜置10 min，再12 000 r/min（離心半徑為8.6 cm），4 ℃離心10 min。離心之后在EP管壁或管底有膠狀沉淀出現(xiàn)，為RNA。棄去上清，用1 mL 75%乙醇對(duì)RNA沉淀進(jìn)行洗滌，7 000 r/min，4 ℃離心5 min（離心半徑為8.6 cm），將上清去除干凈。室溫靜置干燥，干燥10 min。所有EP管中加入25 μL的DEPC H2O，用槍頭吹打幾次，使RNA充分溶解，-80 ℃保存。在95 ℃反應(yīng)45 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火40 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每組進(jìn)行3次測(cè)定，取3次的平均值，圖像分析儀掃描凝膠密度，采用2-△△CT法計(jì)算mRNA表達(dá)水平。RT-qPCR引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

2.4.4 創(chuàng)面肉芽組織IL-6、gp130、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量 采用蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)創(chuàng)面肉芽組織蛋白表達(dá)水平。每組大鼠取40～60 mg肛瘺術(shù)后創(chuàng)面肉芽組織，提取總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，然后進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)，將PVDF膜完全浸在5% milk-PBST或5% BSA-PBST中，室溫輕搖1 h，加入5% BSA-PBST稀釋后的一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入用PBST稀釋后的二抗（1∶5 000），室溫?fù)u床孵育1 h，再進(jìn)行PBST洗膜5次，每次6 min，加入ECLA和B液按體積1∶1混合后均勻滴在膜上，曝光成像，觀察IL-6、gp130、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)的灰度值，用ImageJ軟件分析灰度值，計(jì)算灰度系數(shù)比。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，組間比較以單因素方差分析（One-way ANOVA），多組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合情況 3組大鼠行瘺管切除術(shù)后分別給以每組相應(yīng)藥物創(chuàng)面換藥。給藥第3天，3組大鼠創(chuàng)面面積較大，無紅腫，有少量分泌物滲出。給藥第5、7、10天，象皮生肌膏組創(chuàng)面面積縮小明顯，新生肉芽生長較快；模型組及凡士林組大鼠創(chuàng)面減少面積小于同時(shí)間點(diǎn)象皮生肌膏組。給藥第10天，象皮生肌膏組大鼠大部分創(chuàng)面愈合，創(chuàng)面四周邊緣被毛覆蓋；凡士林組和模型組大鼠創(chuàng)面未完全愈合，創(chuàng)面四周邊緣被毛覆蓋較少。象皮生肌膏組肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合時(shí)間短，效果好。（見圖1）

圖1 各組大鼠不同時(shí)間段創(chuàng)面情況圖

3.2 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 給藥第3天，模型組、凡士林組和象皮生肌膏組大鼠創(chuàng)面愈合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥第5、7、10天，象皮生肌膏組、凡士林組大鼠創(chuàng)面愈合率高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。給藥第5、7、10天，象皮生肌膏組大鼠創(chuàng)面愈合率高于凡士林組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。所有大鼠不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），即存在時(shí)間效應(yīng)；3組大鼠創(chuàng)面愈合率總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），即存在分組效應(yīng)；時(shí)間與組別存在交互效應(yīng)（P＜0.01），即各組大鼠給藥前后創(chuàng)面愈合率上升幅度不一致。（見表2、圖2）結(jié)果表明象皮生肌膏組和凡士林組主要在創(chuàng)面恢復(fù)的中、后期產(chǎn)生促進(jìn)傷口愈合的作用，象皮生肌膏療效更好。

圖2 創(chuàng)面愈合率的交互效應(yīng)輪廓圖

表2 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 （，%）

表2 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 （，%）

注：F時(shí)間主效應(yīng)=806.038，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F組別主效應(yīng)=382.485，P組別主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=50.567，P交互效應(yīng)=0.000。與模型組比較，bP＜0.05；與凡士林組比較，cP＜0.05。

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3.3 大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué) HE染色結(jié)果顯示，象皮生肌膏組大鼠創(chuàng)面基本修復(fù)，成纖維細(xì)胞致密排列，少量炎癥細(xì)胞浸潤，血管豐富，組織結(jié)構(gòu)完整，未見充血、水腫、糜爛等變化；凡士林組大鼠創(chuàng)面受損修復(fù)較差，血管有擴(kuò)張出血，較多炎癥細(xì)胞浸潤，炎癥反應(yīng)明顯，有新生肉芽組織；模型組大鼠創(chuàng)面表層出現(xiàn)明顯出血及壞死，組織高度水腫，伴大量炎癥細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞分布散亂稀疏，未見新生毛細(xì)血管。與模型組比較，象皮生肌膏組和凡士林組炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，成纖維細(xì)胞成熟且分布整齊，膠原纖維致密且排列整齊，可見新生毛細(xì)血管分布，創(chuàng)面修復(fù)較完整。（見圖3）

圖3 各組大鼠創(chuàng)面組織病理圖 （HE，×200）

3.4 各組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 象皮生肌膏組、凡士林組、模型組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于假手術(shù)組（P＜0.05）；象皮生肌膏組、凡士林組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組（P＜0.05）；象皮生肌膏組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于凡士林組（P＜0.05）。（見圖4～5、表3）

圖4 熒光定量RT-PCR 檢測(cè)IL-6、JAK2、STAT3 的動(dòng)力學(xué)曲線

圖5 熒光定量RT-PCR 檢測(cè)IL-6、JAK2、STAT3 的融解曲線

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （）

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與凡士林組比較，cP＜0.05。

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3.5 各組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、gp130蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比較 給藥第5、10天，象皮生肌膏組、凡士林組、模型組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、gp130蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAk2、p-STAT3/STAT3高于假手術(shù)組（P＜0.05）；象皮生肌膏組、凡士林組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、gp130蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAk2、p-STAT3/STAT3低于模型組（P＜0.05）；象皮生肌膏組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、gp130蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAk2、p-STAT3/STAT3水平低于凡士林組（P＜0.05）。給藥第10天，象皮生肌膏組、凡士林組、模型組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、gp130蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAk2、p-STAT3/STAT3低于給藥第5天（P＜0.05）。（見圖6～7、表4）表明象皮生肌膏可以抑制肛瘺術(shù)后大鼠模型JAK2/STAT3信號(hào)通路的異常激活。

圖6 給藥第5 天大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、gp130、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖7 給藥第10 天大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、gp130、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織中IL6、gp130 蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 比較 （）

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織中IL6、gp130 蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 比較 （）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與凡士林組比較，cP＜0.05；與給藥第5天比較，dP＜0.05。

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4 討論

肛瘺最終獲得根治的方案是個(gè)體化的手術(shù)治療[11]。肛瘺發(fā)病部位為潮濕、有菌部位，且術(shù)后傷口創(chuàng)面通常是開放的。糞便、腸道細(xì)菌及一些物理因素導(dǎo)致術(shù)后傷口疼痛劇烈，愈合時(shí)間長，病程緩慢。因此手術(shù)后的創(chuàng)面愈合情況是疾病痊愈的重要標(biāo)志[12]。與其他手術(shù)傷口類似，肛瘺手術(shù)后的傷口愈合也可分為3個(gè)階段，即炎癥滲出物期、纖維組織增生期和瘢痕面愈合期。在第一階段，白細(xì)胞產(chǎn)生了各種炎癥因子；在第二階段，成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞參與血管生成和纖維增殖，誘導(dǎo)傷口處產(chǎn)生肉芽組織；在第三階段，細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)歷重組、降解和再合成，肉芽組織中的水分和血管減少，瘢痕組織形成[13]。在這些過程中，各種細(xì)胞因子起著重要作用，包括生長因子、炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等。炎癥反應(yīng)和血運(yùn)是影響創(chuàng)面愈合的重要原因[14]。有針對(duì)性地干預(yù)可以有效緩解炎癥反應(yīng)，減輕術(shù)后疼痛，阻止并發(fā)癥的發(fā)生，促進(jìn)傷口快速愈合。因此術(shù)后及時(shí)正確的治療是創(chuàng)面修復(fù)與愈合的關(guān)鍵。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肛瘺以“濕”“熱”為病因，“毒”“瘀”為病理產(chǎn)物，四者共同構(gòu)成以“濕、熱、毒、瘀”為主的病機(jī)[15]。肛瘺手術(shù)后傷口難以愈合的原因是原有皮膚和肌肉受到金刃損傷。由于手術(shù)切除了病灶，而局部的濕熱并沒有排除，術(shù)后傷口表面處于瘀血、濕熱的病理狀態(tài)。因此肛瘺手術(shù)后傷口愈合的主要治法應(yīng)是去腐生肌、清熱祛濕、活血化瘀[5]。中醫(yī)藥治療以清熱解毒、祛邪生肌為主要治法。臨床上有多種治療方法，如中藥內(nèi)服方、中藥軟膏、中藥坐浴、中藥栓劑等。中藥多靶點(diǎn)、多通路作用于創(chuàng)面，可改善創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，調(diào)整局部血運(yùn)，促進(jìn)毛細(xì)血管的生成，從而促進(jìn)傷口愈合。

肛瘺術(shù)后的創(chuàng)面愈合過程是由多因子參與且較為復(fù)雜的調(diào)控過程，炎癥因子和生長因子參與了傷口愈合[16]。如：IL-6、IL-12、IL-1β和TNF-α等炎癥因子的過表達(dá)通過影響成纖維細(xì)胞凋亡和膠原蛋白表達(dá)而導(dǎo)致傷口愈合緩慢；EGF、PDGF、VEGF、IGF-1R、TGF-β1、Ang-Ⅱ等生長因子通過誘導(dǎo)功能性血管生長，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖，從而提高創(chuàng)面愈合速度[17]。炎癥反應(yīng)是機(jī)體創(chuàng)傷后的基本防御性反應(yīng)，是影響創(chuàng)面愈合的重要因素。IL-6為常見的炎癥因子，可以促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)，同時(shí)機(jī)體炎癥條件也能誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6，參與肛瘺術(shù)后多種并發(fā)癥的發(fā)生與進(jìn)展。研究證實(shí)，IL-6是重要的炎癥細(xì)胞因子，也是一種多功能細(xì)胞因子，由纖維母細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞及多種瘤細(xì)胞所產(chǎn)生，局部細(xì)菌大量產(chǎn)生和繁殖可導(dǎo)致IL-6升高，其升高水平與感染的嚴(yán)重程度一致[18]。近年來，研究證實(shí)IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路與炎癥性疾病、腫瘤及自身免疫性疾病的發(fā)病相關(guān)[19]。IL-6能作用于多種信號(hào)途徑，IL-6能激活JAK2/STAT3信號(hào)通路。JAK2/STAT3信號(hào)通路能影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，從而在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等起重要作用，是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[20]。JAK2識(shí)別細(xì)胞外信號(hào)發(fā)生磷酸化激活后，能夠使下游STAT3發(fā)生磷酸化；p-STAT3具有轉(zhuǎn)錄激活活性，能夠調(diào)節(jié)下游多種基因的表達(dá)并參與凋亡、炎癥的調(diào)控。IL-6能識(shí)別靶細(xì)胞表面IL-6受體（sIL-6R），并與其結(jié)合形成sIL-6R/IL-6復(fù)合物，進(jìn)一步活化細(xì)胞膜表面gp130，誘導(dǎo)gp130二聚體和sIL-6R/IL-6復(fù)合物內(nèi)信號(hào)的啟動(dòng)，從而激活JAK2，使受體酪氨酸激酶活化，并與STAT3蛋白結(jié)合。STAT3磷酸化能激活下游轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[21]。JAK2/STAT3蛋白含量越低，表示創(chuàng)面炎癥反應(yīng)越低。本研究結(jié)果表明，凡士林組、象皮生肌膏組小鼠創(chuàng)面組織中IL-6、gp130蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3均低于模型組，且象皮生肌膏組低于凡士林組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；象皮生肌膏組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于凡士林組與模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明象皮生肌膏可以抑制肛瘺術(shù)后創(chuàng)面肉芽組織中JAK2/STAT3信號(hào)通路并調(diào)控炎癥反應(yīng)。

象皮生肌膏具有促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)與愈合的作用。象皮生肌膏組方中象皮有止血、斂瘡之功；當(dāng)歸活血消腫止痛；生地黃清熱涼血，生津滋陰；爐甘石止癢斂瘡；血余炭消瘀止血；生石膏清熱瀉火解毒。諸藥合用，具有祛瘀止痛、活血消腫、斂瘡生肌之功[22]。影響肛瘺創(chuàng)面修復(fù)與愈合的重要因素之一為創(chuàng)面腐肉已凈、新肉未生。象皮生肌膏可調(diào)節(jié)局部氣血，活血消腫，最終達(dá)到生肌長肉的目的；且象皮生肌膏藥物性狀穩(wěn)定性強(qiáng)，不易變質(zhì)，外科常用于創(chuàng)面換藥，具有顯著的生肌效果。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，象皮生肌膏可明顯提高大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合率，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，其作用機(jī)制可能與降低創(chuàng)面組織中炎癥反應(yīng)因子表達(dá)有關(guān)[23]。本研究結(jié)果表明，象皮生肌膏組大鼠創(chuàng)面愈合率高于模型組及凡士林組。HE染色結(jié)果顯示象皮生肌膏組創(chuàng)面炎癥反應(yīng)明顯減少，且肉芽組織形成情況優(yōu)于模型組及凡士林組，提示象皮生肌膏能促進(jìn)大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合，減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合過程中的局部血運(yùn)，縮短病程。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，爐甘石、生地黃、生石膏與血余炭具有抗炎作用，爐甘石與地黃可止癢，石膏可鎮(zhèn)痛，血余炭可抑菌、鎮(zhèn)痛[24]。但目前尚無關(guān)于象皮生肌膏對(duì)gp130、JAK2、STAT3作用的有關(guān)報(bào)道。本研究選取JAK2/STAT3信號(hào)通路為切入點(diǎn)進(jìn)一步探討象皮生肌膏對(duì)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，象皮生肌膏組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、gp130蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAk2、p-STAT3/STAT3水平低于模型組與凡士林組。象皮生肌膏可通過抑制IL-6，從而抑制JAK-STAT通路的促炎性細(xì)胞因子或趨化因子分泌，減少大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面組織炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面快速愈合。

綜上所述，象皮生肌膏能通過刺激JAK2/STAT3信號(hào)通路有效抑制炎癥反應(yīng)，并增加血管生成、成纖維細(xì)胞激活，從而促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)及減輕創(chuàng)面水腫。但本研究僅采用實(shí)驗(yàn)性肛瘺術(shù)后大鼠模型開展研究，具有一定的局限性，且樣本量相對(duì)較小，缺乏對(duì)肛門部微生物群的觀察，缺乏臨床試驗(yàn)等。今后的研究將通過體外研究和臨床檢測(cè)進(jìn)一步探究象皮生肌膏促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的作用靶點(diǎn)及通路。