補肝健膝方對膝骨關節(jié)炎模型兔軟骨Wnt信號通路的影響*

羅 潔，仇湘中，匡建軍，張信成，許 輝

（1.長沙市口腔醫(yī)院，湖南 長沙 410004；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006）

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種最常見的膝關節(jié)疾病，其特征包括骨贅形成、關節(jié)軟骨退化、骨質(zhì)增生和滑膜炎。KOA常由遺傳、年齡、肥胖或其他機械損傷等綜合因素引起[1-2]。目前估計全球有超過3億人患有KOA[3]，其經(jīng)濟成本預計將在未來幾十年內(nèi)翻倍，這將對社會造成巨大經(jīng)濟負擔[4]。軟骨退行性變是KOA發(fā)生發(fā)展過程中最顯著的病理改變，包括軟骨細胞凋亡和細胞外基質(zhì)異常降解[5]。軟骨細胞的主要功能是分泌細胞外基質(zhì)，而這種基質(zhì)可能會被促炎性細胞因子和金屬蛋白酶破壞[6]。在人和動物的軟骨細胞中，基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）過度表達，從而導致細胞外基質(zhì)降解以致軟骨退化[7]。白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的過度表達也參與KOA的發(fā)病機制[8]。

補肝健膝方是湖南省名老中醫(yī)仇湘中教授治療膝骨關節(jié)炎的經(jīng)驗方，臨床研究發(fā)現(xiàn)補肝健膝方治療KOA具有較好的療效。為進一步闡明其作用機制，本研究探討了補肝健膝方對KOA模型兔軟骨Wnt信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 白細胞介素-1（IL-1）ELISA試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號：2206061230）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號：2206061390）；木瓜蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司，批號：N08GS166292）；內(nèi)參一抗（Mouse Anti-β-Actin）（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：#Q21129）；內(nèi)參二抗[HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG（H+L）]（Servicebio，批號：AC230602002）；目的一抗Rabbit Anti MMP-13（Proteintech，批號：00098899）；目的一抗Rabbit Anti Wnt3a（Affinity，批號：25s0136）；目的一抗Mouse Anti β catenin（Affinity，批號：10023865）；目的二抗HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（Servicebio，批號：AC23071 6005）。

1.1.2 主要儀器 BX43型顯微鏡（OLYMPUS公司）；WD-2012B型自動酶標儀（北京六一公司）；UltiMate3000型超高壓液相色譜儀（THERMO公司）、5600 QTOF型高分辨質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司）；ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm 2.1 mm×100 mm色譜柱（Waters公司）；BA7004型超凈高級封片膠（BASO公司）；IPVH00010型PVDF膜（Millipore公司）；KD-TS3S1型組織脫水機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；HistoCore Arcadia型石蠟包埋機（Leica公司）；HistoCore BIOCUT型切片機（Leica公司）；Leica HI1210型攤片機（Leica公司）；HGZF-101-1型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；5424R型低溫高速離心機（Eppendorf公司）；HH-11-2型電熱恒溫水浴鍋（上海助藍儀器科技有限公司）；DYY-6C型蛋白垂直電泳儀（北京市六一儀器廠）；TC-100B型恒溫搖床（上海領成生物科技有限公司）；Tiss-12型全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；Chemi DocTM XRS+型超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)[伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司]。

1.2 藥物 補肝健膝方：酸棗仁20 g，牛膝15 g，白芍30 g，桂枝12 g，生地黃15 g，白芷10 g，僵蠶10 g，澤瀉10 g，車前子10 g，熟地黃25 g，當歸10 g，木瓜15 g，炒麥芽10 g，桑枝15 g，蜈蚣1條，甘草5 g。加味獨活寄生湯：獨活10 g，秦艽10 g，防風10 g，桑寄生10 g，茯苓10 g，甘草6 g，杜仲10 g，白芍15 g，人參10 g，細辛3 g，桂枝10 g，熟地黃15 g，牛膝15 g，川芎10 g，當歸10 g。上述藥材均購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房，由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院田其學主任藥師、楊瑩主任藥師鑒定符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。將上述中藥分別浸泡30 min，調(diào)整液面，大火煮沸后用小火煮30 min，濾出煎液，鍋中加入水，再次煎煮，火候控制同前，煎煮20 min。兩次藥液混合，繼續(xù)文火蒸餾至100 mL，加味獨活寄生湯煎煮方法同補肝健膝方，分別得到補肝健膝方煎液（1 g/mL）及加味獨活寄生湯煎液（1 g/mL）。4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗動物 36只新西蘭兔，雄性，購自江西省贛州畜牧水產(chǎn)研究所，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2018-0009，體質(zhì)量（2.0±0.5）kg。動物均在無病原體的（SPF）環(huán)境下飼養(yǎng)，室溫為22～26 ℃，相對濕度為55%～65%，12 h明暗交替光照，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。所有動物管理和協(xié)議均獲得湖南省中醫(yī)藥研究院實驗動物管理和使用委員會的批準（倫理號：2022040734）。

1.4 動物模型構(gòu)建 36只健康雄性新西蘭兔，購入后適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為正常組、模型組、陽性藥物組、補肝健膝方低劑量組、補肝健膝方中劑量組、補肝健膝方高劑量組，每組6只。模型組、陽性藥物組、補肝健膝方低劑量組、補肝健膝方中劑量組、補肝健膝方高劑量組采用木瓜蛋白酶關節(jié)腔注射制備膝骨關節(jié)炎模型。方法：將0.3 mL的4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液注入膝關節(jié)腔，屈伸膝關節(jié)使木瓜蛋白酶充分擴散于關節(jié)腔，造模開始第1、4、7天各注射1次，總共注射3次。造模期間對所有動物進行驅(qū)趕，2次/d，30 min/次，連續(xù)4周，即可制備兔膝骨關節(jié)炎模型[9-10]。

1.5 給藥 根據(jù)人與動物間藥物劑量的換算方法，通過人與動物體表面積折算中藥灌胃劑量，相當于臨床用量3.72倍。補肝健膝方低劑量組用生藥質(zhì)量濃度為1.962 g/kg的補肝健膝方藥液灌胃，10 mL/（kg·d）；補肝健膝方中劑量組用生藥質(zhì)量濃度為3.924 g/kg的補肝健膝方藥液灌胃，10 mL/（kg·d）；補肝健膝方高劑量組用生藥質(zhì)量濃度為5.886 g/kg的補肝健膝方藥液灌胃，10 mL/（kg·d）；陽性藥物組用生藥質(zhì)量濃度為2.895 g/kg的加味獨活寄生湯藥液灌胃，10 mL/（kg·d）；正常組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，10 mL/（kg·d）。各組均連續(xù)灌胃4周。4周后進行取材并檢測。

1.6 觀察指標

1.6.1 大體觀察和組織學分析 抽取各組新西蘭兔的關節(jié)液，采用ELISA法檢測IL-1和TNF-α表達水平，然后空氣栓塞法處死各組新西蘭兔，切開顯露右后肢膝關節(jié)，觀察膝關節(jié)結(jié)構(gòu)，并拍照。切取同樣大小和部位的脛骨平臺軟骨，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅染色，200倍光學顯微鏡下觀察。

1.6.2 關節(jié)軟骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白表達 采用Western blotting檢測關節(jié)軟骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達量。取兔右后膝關節(jié)股骨髁軟骨后，用PBS洗滌，取50 mg組織，加1 mL裂解液和鋼珠，研磨至充分。高速離心，4 ℃，12 000 r/min（離心半徑為6.26 cm），離心10 min，檢測蛋白濃度，制備SDS-PAGE膠板。乙醇壓膠，加濃縮膠后插齒梳，配置電泳液，加蛋白樣品和Marker。電泳：60 V壓縮，80 V分離。轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉-PBST封閉1 h，抗體稀釋比例為1∶1 000，加一抗，4 ℃孵育過夜。HRP標記的二抗，37 ℃孵育1 h。超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影成像，Image J定量分析蛋白表達情況。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”（）表示。計量資料符合正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用最小顯著差（LSD）檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。實驗數(shù)據(jù)均由GraphPad Prism 8.0軟件進行繪圖展示。

2 結(jié)果

2.1 各組兔關節(jié)大體觀察及顯微形態(tài)觀察 正常組兔關節(jié)軟骨表面光滑，而模型組則粗糙，光澤度降低并形成骨贅。陽性藥物組、補肝健膝方低劑量組、補肝健膝方中劑量組、補肝健膝方高劑量組兔關節(jié)表面比模型組光滑。（見圖1）

圖1 各組兔關節(jié)大體觀察

HE染色結(jié)果顯示，正常組軟骨細胞排列規(guī)律，而模型組軟骨細胞數(shù)量明顯減少。陽性藥物組、補肝健膝方低劑量組、補肝健膝方中劑量組、補肝健膝方高劑量組兔軟骨病變減輕，尤其是補肝健膝方中劑量組軟骨結(jié)構(gòu)得到了改善，軟骨細胞數(shù)量增加。（見圖2）

圖2 各組兔關節(jié)軟骨顯微形態(tài)觀察（HE，×200）

2.2 各組兔關節(jié)液炎癥因子IL-1、TNF-α水平比較 模型組兔關節(jié)液IL-1、TNF-α水平高于正常組（P＜0.01）。陽性藥物組、補肝健膝方低劑量組、補肝健膝方中劑量組、補肝健膝方高劑量組兔關節(jié)液IL-1、TNF-α水平均低于模型組（P＜0.01）。木瓜蛋白酶誘導的KOA兔的關節(jié)液中IL-1和TNF-α顯著增加，且加味獨活寄生湯和補肝健膝方干預后，這種趨勢得到了阻斷。（見圖3）

圖3 各組兔關節(jié)液IL-1、TNF-α 水平比較 （，n=6）

2.3 各組兔關節(jié)軟骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達量比較 模型組兔關節(jié)軟骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達量高于正常組（P＜0.01）。補肝健膝方高劑量組兔關節(jié)軟骨Wnt3a蛋白相對表達量低于模型組（P＜0.05）。陽性藥物組、補肝健膝方低劑量組、補肝健膝方中劑量組、補肝健膝方高劑量組兔關節(jié)軟骨β-catenin蛋白相對表達量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。陽性藥物組、補肝健膝方中劑量組、補肝健膝方高劑量組兔關節(jié)軟骨MMP-13蛋白相對表達量均低于模型組（P＜0.05）。木瓜蛋白酶誘導的KOA兔關節(jié)軟骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達量顯著增加，且補肝健膝方干預后，這種趨勢一定程度上得到了阻斷。（見圖4～5）

圖4 各組兔關節(jié)軟骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13 蛋白表達Western blotting 圖

圖5 各組兔關節(jié)軟骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13 蛋白相對表達量比較 （，n=6）

3 討論

KOA的發(fā)病與外傷、衰老、無菌性炎癥、代謝、免疫等諸多因素關系密切，但確切的發(fā)病機制尚未明確。目前，越來越多的研究表明KOA患者往往伴有關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)合成與降解失衡，而這就是導致關節(jié)軟骨變形的重要原因之一，其中無菌性炎癥因子及與軟骨代謝有關的細胞因子在KOA發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用[11]。IL-1、TNF-α大量存在于膝關節(jié)軟骨組織、上層軟骨細胞與基質(zhì)中，可誘導并激活金屬蛋白酶（MMPs）的合成并且抑制TIMPs的生成，加快膠原蛋白的降解，抑制軟骨細胞的合成，致使軟骨細胞凋亡，最終導致關節(jié)軟骨的破壞[12-13]。軟骨退變是KOA主要的病理變化，軟骨細胞能夠通過提供微環(huán)境來調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)。軟骨降解以軟骨細胞凋亡和細胞外基質(zhì)降解為特征。然而，炎癥微環(huán)境可誘導軟骨細胞凋亡和高表達MMPs，這可能導致細胞外基質(zhì)降解。本實驗中，模型組兔關節(jié)液IL-1、TNF-α水平升高，間接說明造模成功，與上述觀點相符。研究發(fā)現(xiàn)，促炎性細胞因子和MMPs之間的相互作用也可以引起軟骨退化[14]。無翅型MMTV整合位點家族是一種外分泌的糖蛋白，能夠影響生長組織的形態(tài)并作為生長因子誘導細胞增殖[15]。它調(diào)節(jié)著經(jīng)典的β-catenin依賴和非經(jīng)典的β-catenin依賴信號通路。在經(jīng)典的β-catenin依賴通路中，過度激活會增加基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達并減少膠原Ⅱ的產(chǎn)生[16]。對于非經(jīng)典的β-catenin依賴信號通路，它可以分為Wnt/Ca2+和平面細胞極性（planar cell polarity）通路[17]。兩者主要在Wnt5a中，能介導細胞骨架的變化和細胞遷移。

中醫(yī)學中無KOA的病名。根據(jù)其臨床特點，KOA屬中醫(yī)學中“膝痹”范疇。仇湘中教授認為KOA屬“筋”病，與肝密切相關。其病機核心為肝虛瘀痹，為本虛標實之證。肝虛為本，瘀痹為標?！峨s病源流犀燭·筋骨皮肉毛發(fā)病源流》指出“筋也者，所以束節(jié)絡骨……其主則屬于肝”。筋屬于肝，筋的各項功能得益于肝的濡養(yǎng)?；诖耍鹣嬷薪淌诳偨Y(jié)出補肝健膝方。臨床試驗證明補肝健膝方治療KOA安全有效。方中酸棗仁、牛膝共為君藥，平補肝腎，且牛膝能引藥下行，直達病所。熟地黃、當歸、生地黃益肝腎之精血。重白芍而輕桂枝意在養(yǎng)血柔肝，滋陰緩中。桂枝得白芍之酸收和營，辛散而不耗肝陰；白芍得桂枝辛溫則柔肝而不致“伐生發(fā)之氣”。僵蠶、蜈蚣搜風通絡，化痰散結(jié)，祛風止痛。桑枝祛風濕，利關節(jié)。白芷散寒止痛。以上九藥共為臣藥。澤瀉、車前子利水滲濕消腫；木瓜舒筋活絡，且善走下肢；炒麥芽健脾開胃，佐僵蠶、蜈蚣傷及脾胃以及生地黃、熟地黃、白芍滋補而阻滯胃之弊。以上四藥共為佐藥。甘草調(diào)和諸藥，為使藥。全方共奏補肝養(yǎng)血柔筋、舒筋通絡止痛之效，臨床療效確切[18]。

目前，治療KOA的常用方劑有補腎活血湯[19]、獨活寄生湯[20]和加味補陽還五湯[21]等。獨活寄生湯來源于《備急千金要方》，其功效主要為通脈絡、補氣血、補肝腎、祛風濕、止痹痛，是治療膝痹的常用方。KOA的發(fā)病是多種因素在不同途徑下協(xié)同作用導致的，獨活寄生湯對于許多可導致KOA進展的途徑都有一定調(diào)控作用，如調(diào)控相關炎癥因子、促進軟骨細胞增殖分化、抑制軟骨細胞凋亡等。循證醫(yī)學證據(jù)已證明獨活寄生湯可延緩或改善膝骨關節(jié)炎病程[22-23]。研究[13-14]顯示，獨活寄生湯可通過調(diào)控KOA兔Wnt/β-catenin通路和下游因子MMP-13等相關基因表達，抑制膝關節(jié)軟骨細胞凋亡。因此，本研究選擇加味獨活寄生湯作為陽性對照藥物。

本研究結(jié)果表明，模型組兔關節(jié)軟骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白相對表達量以及關節(jié)液IL-1、TNF-α水平均增加，符合經(jīng)典β-catenin依賴的信號通路促進OA的發(fā)生這一理論。其中，高劑量補肝健膝方具有治療作用，能減少Wnt3a、MMP-13、IL-1和TNF-α的表達，而β-catenin沒有改變。這表明補肝健膝方可能通過阻斷非經(jīng)典β-catenin信號通路發(fā)揮其作用。此外，過度抑制Wnt信號通路也會導致KOA的進展。因此，補肝健膝方在體內(nèi)過量使用可能會過度抑制Wnt信號通路，從而出現(xiàn)負面效應。由于過量治療，IL-1、TNF-α和MMP-13的水平會增加，但仍低于模型組。結(jié)果表明，補肝健膝方能通過抑制Wnt信號通路，降低MMP-13、IL-1和TNF-α的表達，從而阻止KOA的進展。而補肝健膝方在體內(nèi)的最佳劑量需要進一步探索。本研究為補肝健膝方對KOA模型Wnt信號通路調(diào)控作用的初步探索，研究中僅觀察了干預后相關指標。后續(xù)研究將進行多時間點動態(tài)觀察，進一步評估該方對KOA的作用機制，為臨床運用本方治療KOA提供依據(jù)。