網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究藿香-龍膽草藥對(duì)治療鼻竇炎的機(jī)制*

藺 婷，熊 靜，蘭 超，田道法,，吳 婷，周振峰

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南中醫(yī)藥大學(xué)湖南省中醫(yī)藥防治眼耳鼻喉疾病與視功能保護(hù)工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.岳陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 岳陽 414000）

鼻竇炎（nasosinusitis）是發(fā)生在鼻黏膜及鼻竇黏膜的炎癥性疾病，屬于耳鼻咽喉科的常見病[1]，以鼻塞、流膿涕為主要癥狀，可伴有頭面部疼痛、嗅覺減退或喪失等癥狀，臨床根據(jù)病程長(zhǎng)短分為急性和慢性[2]。歐洲和美國(guó)鼻竇炎的發(fā)病率分別高達(dá)11%和12%[3]；而我國(guó)的鼻竇炎發(fā)病率也高達(dá)8%[4-5]。以上數(shù)據(jù)表明，全球范圍內(nèi)鼻竇炎的發(fā)病率日趨上升。

鼻竇炎在中醫(yī)學(xué)中屬于“鼻淵”“腦漏”范疇，中醫(yī)對(duì)鼻淵的認(rèn)識(shí)歷史悠久。如《素問·氣厥論篇》就有“膽移熱于腦，則辛頞鼻淵。鼻淵者，濁涕下不止也”的記載[6-7]，指出鼻淵為膽移熱于腦所致。這是中醫(yī)對(duì)鼻淵病因病機(jī)最早的描述?！镀諠?jì)方卷五十六》記載“夫腦為髓?！钅懸菩盁?，上入于腦，則陰氣不固，而藏者泄矣，故腦液下滲于鼻，其證濁涕出不已”。隨后后世醫(yī)家在此基礎(chǔ)上對(duì)本病的認(rèn)識(shí)有了較完善的認(rèn)識(shí)。如清代醫(yī)家費(fèi)伯雄所著的《醫(yī)醇賸義》記載：“腦漏者，鼻如淵泉，滑涓流涕，致病有三，曰風(fēng)也、火也、寵也。”提示鼻淵的風(fēng)、火、寵三因，火者多為肝膽熱盛所致。同時(shí)也指出“陽邪外爍，肝火內(nèi)燔，鼻竅半通，時(shí)流黃水，此火傷之腦漏也”。上訴醫(yī)書中詳盡地論述了鼻淵與膽腑的密切關(guān)系?？v觀古今，眾多醫(yī)家治療鼻淵以“膽熱犯鼻，濕郁竅閉”立論，以清泄膽熱，利濕通竅為治法[8]。

湖南省岳陽市中醫(yī)醫(yī)院耳鼻咽喉科的自制藥藿膽鼻淵丸（湘藥制備字Z20190109000，曾用名龍膽通竅丸[9]）臨床治療鼻竇炎效果顯著[10-11]。藿香-龍膽草作為藿膽鼻淵丸中的君藥，發(fā)揮了重要的治療作用。藿香，味辛、性微溫，屬升浮之品，具有辛溫通竅、祛濕化濁、除穢行氣之功效，是中醫(yī)臨床治療鼻淵的常用藥。如《外科正宗》中有關(guān)于“腦漏”的記載：“腦漏又名鼻淵……奇授藿香湯治鼻淵，黃水濁涕長(zhǎng)流，致腦戶虛眩不已。用藿香連枝帶葉五錢，水一碗，煎七分，加公豬膽汁一枚和勻，食后通口服之，至重不過三服。如此藥苦甚不堪服用，藿香末一兩，公豬膽汁熬稠膏為丸，每服二錢食后白滾湯送下亦效。”近年來，很多醫(yī)家[12-14]在臨床治療鼻淵時(shí)都將芳香化濁之品藿香作為方中主藥?！侗静菥V目》中記載“相火寄在肝膽，有瀉無補(bǔ)，故龍膽之益肝膽之氣，正以其能瀉肝膽之邪熱也”?！侗窘?jīng)逢原》記載“龍膽草……專瀉肝膽之火……凡屬肝經(jīng)邪熱為患，用之神妙?！魄逑陆?jié)駸帷?。龍膽草，味苦，性寒，歸肝、膽經(jīng)，既能瀉肝膽實(shí)火，又能利肝經(jīng)濕熱，瀉火除濕，兩善其功，切中鼻淵病機(jī)。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討霍膽鼻淵丸中君藥藿香-龍膽草的有效成分和作用靶點(diǎn)，旨在揭示霍膽鼻淵丸治療慢性鼻竇炎的藥效機(jī)制。

1 材料

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和軟件 中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)TCMSP（http://lsp，nwu.edu.cn/tcmsp.php）；有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）；結(jié)構(gòu)相似度預(yù)測(cè)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch）；全球蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫Uniprot（http：//www.uniprot.org/）；基因數(shù)據(jù)庫GeneCards（https://www.genecards.org/）、人類在線孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM（https://www.omim.org/）、人類疾病相關(guān)基因和突變數(shù)據(jù)庫DisGent（https://www.disgenet.org）平臺(tái)；繪圖軟件Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；檢索已知蛋白和預(yù)測(cè)蛋白互作關(guān)系平臺(tái)String（https://string-db.org/）；Cytoscape3.8.2軟件；Metascape（http://metascape.org/）平臺(tái)；R語言軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：202302210009；動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004；實(shí)驗(yàn)期間大鼠均飼養(yǎng)于同一環(huán)境下，保持室溫（24.0±1.0）℃，空氣濕度為55%～65%，環(huán)境安靜，大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，明、暗12 h循環(huán)飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的大鼠均為麻醉后脫頸椎處死，實(shí)驗(yàn)操作符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：LL2023022210。

1.3 藥物與試劑 藿香（批號(hào)：221102）、龍膽草（批號(hào)：2208099）均由岳陽市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)藥劑科張禹主任藥師鑒定為藥物成分完全的道地藥材?？死顾仄ㄉ綎|新華制藥股份有限公司，0.25 g/片，批號(hào)：H19990225）。脂多糖（lipopolysa ccharide，LPS）（批號(hào)：L2880）購(gòu)自美國(guó)sigma公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-R2856c）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-M0037c）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0015c）均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；白介素-17（IL-17）ELISA試劑盒（批號(hào)：ml059373）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；IL-17C一抗（批號(hào)：ER1911-25）、NF-κB p65一抗（批號(hào)：ET1603-12）、TNF-α一抗（批號(hào)：ER65189）和IL-6一抗（批號(hào)：R1412-2）均購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司；IL-1β一抗（批號(hào)：SAB5700678）購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；二抗IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG（H+L）（批號(hào)：D30110-05）購(gòu)自美國(guó)Licor公司；三氯乙醛水合物（批號(hào)：C804539）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.4 主要儀器 Odyssey CLX型多功能熒光成像儀（美國(guó)Licor公司）；ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（美國(guó)BioTek公司）；JY-ZY5型蛋白轉(zhuǎn)印電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；WD-9405B型水平搖床（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)

2.1.1 藥物化學(xué)成分與靶點(diǎn)搜集 通過TCMSP平臺(tái)搜尋藿香成分，設(shè)置口服生物利用度（Oral Availability，OB）≥30%，類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18，得到有效成分后通過其MOL.ID號(hào)搜尋藥物成分作用靶點(diǎn)。同時(shí)，將龍膽草成分名稱導(dǎo)入Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得成分SMILES（Simplified Molecular Input Line Entry System）及化學(xué)結(jié)構(gòu)式，將所得到的結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入到結(jié)構(gòu)相似度預(yù)測(cè)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫Swiss Target Prediction預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

2.1.2 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析 利用Uniprot數(shù)據(jù)庫下載化合物Excel數(shù)據(jù)表格，運(yùn)用“TRIM”函數(shù)優(yōu)化數(shù)據(jù)，使用“VLOOKUP”函數(shù)匹配靶點(diǎn)基因名，并通過查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充未匹配到的基因名稱，對(duì)得到的藥物化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行注釋。將化合物基因“Network”文件和“Type”文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)Degree值（基因的連接數(shù)量）調(diào)整靶點(diǎn)圖形、顏色、透明度和大小，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

2.1.3 疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 以鼻竇炎的英文“nasosinusitis”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards、OMIM、DisGent平臺(tái)獲取疾病相關(guān)靶點(diǎn)，設(shè)置對(duì)象為“human”，使用“VLOOKUP”函數(shù)匹配靶點(diǎn)基因名。應(yīng)用Venny軟件獲取中藥活性化合物作用靶點(diǎn)與疾病的交集靶點(diǎn)，作為藥物治療鼻竇炎的潛在靶點(diǎn)。

2.1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?將交集基因?qū)隨tring平臺(tái)，得到蛋白互作關(guān)系。結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?。隨后，把下載好的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape軟件作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein-protein interaction，PPI）。

2.1.5 GO和KEGG富集分析 運(yùn)用R語言軟件對(duì)核心藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析。設(shè)置H. sapiens，選擇P＜0.05，按P值繪制成柱狀圖，作可視化分析。同時(shí)，根據(jù)所屬通路將各靶點(diǎn)進(jìn)行歸類，將信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 藥物制備 根據(jù)藿膽鼻淵丸[9]的處方組成，每劑處方中藿香8 g、龍膽草10 g，即人的劑量約為257 mg/kg。稱取藿香40 g、龍膽草50 g，加蒸餾水煎煮2次，將2次的煎煮液混勻，紗布過濾藥渣，放于冷凍干燥器中得到生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL的濃縮液?？死顾嘏R用時(shí)以生理鹽水溶解并配制成相應(yīng)濃度。

2.2.2 動(dòng)物分組與造模 將24只SPF級(jí)雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、藿香-龍膽草組、陽性藥組，每組6只。對(duì)照組常規(guī)飼料和蒸餾水飼養(yǎng)，不作其他處理。其余各組大鼠建立鼻竇炎模型[15-16]，腹腔注射10%三氯乙醛水合物（0.01 mL/kg）使大鼠麻醉，用鑷子取2.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小的鼻腔止血海綿塞入大鼠一側(cè)鼻腔內(nèi)，隨后同側(cè)鼻腔內(nèi)滴入1 mg/L的LPS 100 μL；對(duì)照組大鼠鼻腔內(nèi)滴生理鹽水200 μL。

2.2.3 動(dòng)物給藥與取材 根據(jù)人與動(dòng)物間等效劑量[17]換算出各組給藥劑量。造模4周后，藿香-龍膽草組大鼠灌胃1 586 mg/kg藿香-龍膽草藥液2 mL；陽性藥組大鼠灌胃43 mg/kg克拉霉素片溶液2 mL；對(duì)照組和模型組大鼠灌胃2 mL生理鹽水。1次/d，連續(xù)給藥4周。末次給藥后12 h，10%三氯乙醛水合物麻醉大鼠，用血清分離管收集大鼠全血標(biāo)本，并取新鮮鼻黏膜組織，備用。

2.2.4 觀察指標(biāo)

2.2.4.1 ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-6水平將收集的大鼠全血標(biāo)本放于室溫靜置2 h，1 000×g，離心20 min，取上清液，將上清液置于-80 ℃保存，備用。按照TNF-α、IL-1β、IL-17和IL-6的ELISA試劑盒說明書分別測(cè)定大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-6的含量。本次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.4.2 Western blotting法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB p65和IL-17C蛋白相對(duì)表達(dá)量 新鮮大鼠鼻黏膜組織研磨成粉末狀后，加組織蛋白裂解液處理30 min，獲取組織蛋白，參考胡晶等[18]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、顯影，檢測(cè)并分析信號(hào)值，TNF-α（抗體稀釋比例1∶1 000）、IL-1β（抗體稀釋比例1∶1 000）、NF-κB p65（抗體稀釋比例1∶1 000）和IL-17C（抗體稀釋比例1∶1 000）表達(dá)。二抗使用IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG（H+L）（抗體稀釋比例1∶20 000）。本次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 中藥有效成分篩選及基因名的轉(zhuǎn)換 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選，刪除未匹配到靶點(diǎn)的成分，得到10個(gè)中藥活性成分，其中龍膽草3個(gè)，藿香7個(gè)，最后共得到相關(guān)作用靶點(diǎn)258個(gè)，去除重復(fù)值后，得到163個(gè)藥物作用靶點(diǎn)。（見表1）

表1 中藥“成分-靶點(diǎn)”表

3.2 疾病和交集基因的獲取 經(jīng)GeneCards、OMIM、Durgback平臺(tái)獲取鼻竇炎靶點(diǎn)3 852個(gè)，其中最大score評(píng)分為94.51，最小評(píng)分為0.14，最后得到2 644個(gè)疾病靶點(diǎn)。（見圖1）中藥靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，刪除重復(fù)值，得到交集基因110個(gè)。

圖1 “中藥-疾病靶點(diǎn)”韋恩圖

3.3 構(gòu)建“中藥成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵化合物篩選 將基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，得到“中藥成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，共421個(gè)節(jié)點(diǎn)（nodes)，730條邊（edges）。（見圖2）根據(jù)Degree值得到排名靠前的主要成分化合物為槲皮素、龍膽堿、龍膽苦苷。（見表2）

圖2 “中藥成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表2 藥物關(guān)鍵化合物

3.4 PPI網(wǎng)絡(luò)制作和核心蛋白的獲取 將交集基因?qū)隨tring平臺(tái)，設(shè)置對(duì)象為（homo sapiens）、取最高置信度0.900，隱藏游離基因節(jié)點(diǎn)，得到247個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 110條邊，平均節(jié)度點(diǎn)為9.28。下載TSV文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.2后經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，把Degree值的二倍中位數(shù)以上，介度中心值（Betweenness Centrality，BC）和緊密中心值（Closeness Centrality，CC）的中位數(shù)上靶點(diǎn)作為中藥藥對(duì)的核心作用靶點(diǎn)，排名前6靶點(diǎn)基因分別為AKT1、TP53、IL-6、VEGEA、TNF、IL-1β。隨著Degree值和連接分?jǐn)?shù)的增高，節(jié)點(diǎn)的形狀越大，顏色越鮮明、線條越粗，蛋白越重要。（見圖3）

圖3 PPI 蛋白互作圖

3.5 GO與KEGG Pathway富集分析 經(jīng)Metascape平臺(tái)分析，GO分析結(jié)果顯示：生物過程（biological processes，BP）4 893條，通過LogP值和基因數(shù)的百分?jǐn)?shù)比重對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行排名，排名靠前的為對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)等。分子功能（molecular function，MF）668條，主要涉及核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、血紅素結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體配體活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。細(xì)胞成分（cellular components，CC）共379條，主要由膜筏、突觸后膜、受體復(fù)合體、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等構(gòu)成。（見圖4）

圖4 GO 富集分析圖

將交集基因?qū)隡atescape平臺(tái)進(jìn)行分析，得到279條KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果，設(shè)置FDR＜0.01篩選前20條途徑。（見圖5）根據(jù)所屬通路將各靶點(diǎn)進(jìn)行歸類，將信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中構(gòu)建“中藥成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。（見圖6）

圖5 KEGG 信號(hào)通路富集分析圖

圖6 “中藥成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

KEGG通路富集分析結(jié)果表明，主要涉及的通路有脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。IL-17信號(hào)通路是介導(dǎo)多種炎癥疾病的發(fā)生經(jīng)典信號(hào)通路，與鼻竇炎的炎癥反應(yīng)過程密切相關(guān)[19]。根據(jù)PPI蛋白互作圖可知，排名前6的中藥核心靶點(diǎn)中有3個(gè)是IL-17信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)（IL-6、TNF、IL-1β）。上述結(jié)果提示，藿膽鼻淵丸中藿香-龍膽草藥對(duì)可能影響炎癥反應(yīng)過程來發(fā)揮治療作用，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將選取IL-17信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。IL-17信號(hào)通路詳細(xì)信息見圖7。

圖7 IL-17 信號(hào)通路詳解圖

3.6 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，藿香-龍膽草組和陽性藥組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與陽性藥組比較，藿香-龍膽草組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖8）

圖8 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-17水平比較 （，n=6）

3.7 各組大鼠鼻黏膜組織中IL-17/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB p65、IL-6、IL-17C蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，藿香-龍膽草組和陽性藥物組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17C蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與陽性藥組比較，藿香-龍膽草組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17C蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（見圖9～10）

圖9 各組大鼠鼻黏膜組織中IL-17/NF-κB 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖10 各組大鼠鼻黏膜組織中IL-17/NF-κB 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （，n=6）

4 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)藿膽鼻淵丸中藿香-龍膽草藥對(duì)治療鼻竇炎的靶點(diǎn)和潛在機(jī)制進(jìn)行了分析，得到10個(gè)中藥有效活性成分，其中3個(gè)核心活性成分分別為槲皮素、龍膽堿、龍膽苦苷。彭煒等[20]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能通過調(diào)節(jié)大鼠變應(yīng)性鼻炎Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡減輕大鼠變應(yīng)性鼻炎鼻部癥狀，改善鼻黏膜炎癥程度。盧志賓等[16]證實(shí)了槲皮素具有改善鼻竇炎癥狀的作用，并發(fā)現(xiàn)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)形成的副鼻竇炎模型小鼠經(jīng)過槲皮素治療后，副鼻竇炎病理形態(tài)學(xué)明顯改善，其機(jī)制是調(diào)節(jié)高爾基應(yīng)激抑制TNF-α和IL-6等炎癥因子表達(dá)。此外，槲皮素還可通過負(fù)調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞表面分子（CD80、CD86和MHCI/II類）和促炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12p70）的表達(dá)，達(dá)到抗炎作用[21]。龍膽堿和龍膽苦苷都是龍膽草的主要活性成分。龍膽苦苷屬于環(huán)烯醚萜苷類，分子式為C16H20O；龍膽堿屬于吡啶類生物堿，分子式為C10H9NO2。研究表明，龍膽堿和龍膽苦苷均具有顯著的抗炎作用[22]。KWAK W J等[23]以雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，發(fā)現(xiàn)龍膽堿可以抑制LPS誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)。龍膽堿還可以通過抑制IL-8、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[24]。ZHAO L等[25]研究表明龍膽苦苷可以通過調(diào)節(jié)IL-1β信號(hào)通路中p38、ERK和JNK蛋白的表達(dá)，抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。龍膽苦苷可以抑制大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-1β釋放達(dá)到減輕大鼠急性胰腺炎的作用，其作用機(jī)制與抑制NF-κB p65蛋白的表達(dá)有關(guān)[26]。葛珊等[27]研究發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷、木蘭花堿可以通過降低炎癥因子TNF-ɑ、IL-1β分泌，抑制IKKβ/NF-κB/COX-2信號(hào)通路異常激活而發(fā)揮抗炎作用。龍膽苦苷也可顯著降低C57BL/6小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α等促炎性細(xì)胞因子的釋放水平[28]。李鑫波等[29]研究發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷可通過抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎活性。槲皮素、龍膽堿、龍膽苦苷均是藿香-龍膽草治療鼻竇炎的核心成分，提示藿香-龍膽草藥對(duì)治療疾病具有多成分發(fā)揮藥效的特點(diǎn)。

本研究通過對(duì)藿香-龍膽草藥對(duì)治療鼻竇炎的PPI網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT）、猴腫瘤蛋白p53（TP5）3、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor a，VEGFA）、TNF等靶點(diǎn)是主要作用靶標(biāo)。這些靶點(diǎn)蛋白在鼻竇炎的發(fā)生發(fā)展過程扮演著重要的角色。AKT1是絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）中的其中一個(gè)亞型，參與細(xì)胞多種生物過程。ZHOU X C等[30]通過生物信息學(xué)和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了AKT1與慢性鼻竇炎伴鼻息肉的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)；TP53 GOF突變體異位表達(dá)在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[31]。據(jù)葉帆[32]報(bào)道，MiR-155可以通過靶向TP53INP1 3’UTR抑制TP53INP1表達(dá)，從而調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎中免疫細(xì)胞ILC2的功能。VEGFA作為效果突出的促血管生成因子，在參與新血管的調(diào)節(jié)和生成過程中釋放多種生長(zhǎng)因子和炎癥因子[33]。如范雋等[34]發(fā)現(xiàn)慢性鼻-鼻竇炎患者的炎癥因子IL-6表達(dá)水平顯著升高，且HIF-1α及VEGF在組織中同時(shí)呈高表達(dá)，其機(jī)制與p38MAPK密切相關(guān)。近年來，隨著對(duì)鼻竇炎發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步探索，眾多研究[35-43]均表明，IL-6、TNF在急慢性鼻竇炎的發(fā)病過程中均為重要的促炎性細(xì)胞因子，其發(fā)病機(jī)制涉及到多種信號(hào)通路。

KEGG富集主要涉及的通路有脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。其中IL-17信號(hào)通路在急性和慢性鼻竇炎癥中都起著至關(guān)重要的作用。多個(gè)研究[44-46]已證實(shí)，IL-17最顯著的作用是其參與誘導(dǎo)和介導(dǎo)促炎癥反應(yīng)。IL-17通過相應(yīng)受體激活下游通路，包括核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、MAPK、AP-1，以誘導(dǎo)許多細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)（例如IL-6、G-CSF、GM-CSF、IL-1β、TNF-α）。本研究以大鼠鼻竇炎為模型，采用ELISA和Western blotting方法對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平明顯高于對(duì)照組，提示這些炎癥相關(guān)因子在鼻竇炎發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用；經(jīng)藿香-龍膽草治療后，大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平明顯降低，表明藿香-龍膽草可以抑制炎癥相關(guān)因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17）的表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示，模型組大鼠鼻黏膜組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB p65、IL-6、IL-17C蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），藿香-龍膽草組和陽性藥物組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17C蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于模型組（P＜0.01）；同時(shí)NF-κB p65蛋白水平也發(fā)生了變化；然而，藿香-龍膽草組大鼠鼻黏膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17蛋白相對(duì)表達(dá)量高于陽性藥組，而NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量低于陽性藥組。藿香-龍膽草和陽性藥物均可能對(duì)IF-17/NF-κB信號(hào)通路有調(diào)控作用。

綜上所述，藿香-龍膽草可能是通過IL-17激活NF-κB，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子的產(chǎn)生，從而達(dá)到治療鼻竇炎的效果。