木犀草苷抑制SNHG14表達(dá)改善SW1353骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)研究*

王曉戈，張靖笛，李 月，田林強(qiáng)

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院創(chuàng)傷與骨科研究所，河南 新鄉(xiāng) 453000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是最常見(jiàn)的肌肉骨骼系統(tǒng)疾病，是導(dǎo)致老年人殘疾和生活能力喪失的常見(jiàn)原因。OA病理特征是軟骨退變和丟失、軟骨下骨損傷和硬化，主要以行動(dòng)受限及關(guān)節(jié)疼痛為主要臨床癥狀[1]。研究[2]表明，在發(fā)達(dá)國(guó)家中OA產(chǎn)生了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，其治療費(fèi)用占國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值的1.0%～2.5%。目前骨關(guān)節(jié)炎傳統(tǒng)的治療主要包括健康教育、疼痛管理、藥物治療和手術(shù)治療[3-4]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）在表觀遺傳等多種層面上對(duì)靶基因調(diào)控，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡等作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG14能通過(guò)刺激miR-4673調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和抑制凋亡[5]。但是，lncRNA SNHG14在骨關(guān)節(jié)炎中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

木犀草苷(Cynaroside, Cy)，是植物中廣泛存在的一種黃酮苷類化合物[3]。Cy具有抗腫瘤[6]、抗炎[7]、抗糖尿病[8]和抗氧化[9]等藥理活性。研究[10]表明，Cy是能夠發(fā)揮抗炎作用的主要化合物之一，但Cy對(duì)人軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究在體外構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型，并探討Cy對(duì)骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，旨在為臨床治療提供新的藥物選擇。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及細(xì)胞 木犀草苷（批號(hào)：SC8790）購(gòu)自北京索萊寶公司；SW1353人軟骨肉瘤細(xì)胞系（GDC0621）由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院王磊教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：AD1002）購(gòu)自河南省普諾易生物制品研究院有限公司；胎牛血清（批號(hào)：16140089）購(gòu)自購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；0.25%胰蛋白酶（批號(hào)：C125C1）購(gòu)自新賽美生物科技有限公司；PBS緩沖液（批號(hào)：BL302A）購(gòu)自蘭杰柯科技有限公司；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（批號(hào)：200-01B）購(gòu)自美國(guó)派普泰克生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：KR116-02）、熒光定量試劑盒（批號(hào)：FP209-02）購(gòu)自天根生化科技有限公司；無(wú)水乙醇（批號(hào)：20201112）購(gòu)自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；RIPA裂解液（批號(hào)：P0013B）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；羊抗兔一抗基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）（批號(hào)：39012）、兔抗人一抗二型膠原（COL2a1）（批號(hào)：Ab34712）、兔抗人一抗聚集蛋白聚糖（ACAN）（批號(hào)：Ab194594）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（批號(hào)：7076S）、二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號(hào)：7074S）、兔抗人一抗GAPDH（批號(hào)：2118S）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；CCK8試劑盒（批號(hào)：C0042）購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司。Multiskan酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；電泳儀（上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）、Real-Time PCR儀（Roche lightcycler 480）；培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）（中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；化學(xué)發(fā)光儀（上海勤祥科學(xué)儀器有限公司）；倒置顯微鏡（德國(guó)徠卡生物系統(tǒng)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 SW1353細(xì)胞培養(yǎng) 將SW1353細(xì)胞置于含10%胎牛血清及雙抗的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，并放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Cy溶液配制 將Cy（20 mg）用1 mL培養(yǎng)基進(jìn)行溶解，配置成20 mg/mL母濃縮液，放置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞毒性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1353細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入1×105個(gè)細(xì)胞，當(dāng)80%～90%細(xì)胞貼壁后給予0.1%二甲基亞砜（DMSO）及不同濃度（0、10、20、30、40、50μmol/mL）的Cy處理24 h。在每孔加入CCK-8試劑10 μL繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)的OD值。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組 確定Cy及IL-1β的干預(yù)濃度后，將SW1353細(xì)胞分為4組。（1）正常對(duì)照組：SW1353細(xì)胞不進(jìn)行任何處理；（2）IL-1β組：采用10 ng/mL IL-1β處理SW1353細(xì)胞24 h；（3）木犀草苷低劑量組：采用10 ng/mL IL-1β+10 μmol/mL Cy處理SW1353細(xì)胞24 h；（4）木犀草苷高劑量組：采用10 ng/mL IL-1β+20 μmol/mL Cy處理SW1353細(xì)胞24 h。

2.5 RT-qPCR 檢測(cè)MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA、COL2a1 mRNA、ACAN mRNA、SNHG14 mRNA表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1353細(xì)胞接種于6孔板中，按照“2.4”分組處理。收集各組細(xì)胞，采用Trizol法進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，以10 cm皿為例加入Trizol 1 mL孵育3～5 min；加入200 μL氯仿劇烈震蕩，充分混勻。采用Multiskan酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA的濃度及純度；使用Fastking RT kit（with gDNase）試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；將合成的cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序如下，95 ℃3 min，95 ℃10 s，60 ℃10 s，循環(huán)40次。將所得的結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。所使用的引物均由上海生物工程有限公司合成。目的基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列

2.6 Western blotting檢測(cè)MMP-13、COL2a1、ACAN蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1353細(xì)胞接種于6孔板中，按照“2.4”分組處理。收集各組細(xì)胞，采用RIPA試劑將細(xì)胞進(jìn)行裂解，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，提取SW1353細(xì)胞的總蛋白，選取1.0 mm的孔進(jìn)行加樣，每孔上樣量為10 μL，經(jīng)SDS-PAGE電泳1.5 h，轉(zhuǎn)膜至甲醇浸泡過(guò)的PVDF膜，轉(zhuǎn)膜2.5 h，之后采用5%脫脂奶粉封閉1 h，敷單克隆兔抗人一抗（1∶1 000）4 ℃冰箱搖床過(guò)夜。T-BST洗膜30 min（3次），室溫加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的酶二抗孵育（1∶10 000）1 h，T-BST洗膜30 min（3次），化學(xué)發(fā)光成像顯影。將所得結(jié)果采取ImageJ進(jìn)行分析整理。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布且滿足方差齊性，計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度的Cy對(duì)SW1353細(xì)胞活性的影響 與正常對(duì)照組比較，10、20 μmol/mL Cy處理24 h后SW1353細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)（P＜0.05），50 μmol/mL Cy可明顯抑制細(xì)胞活性（P＜0.01）。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用木犀草苷（Cy）濃度10、20 μmol/mL進(jìn)行。（見(jiàn)圖1）

圖1 CCK-8 檢測(cè)不同濃度Cy 對(duì)SW1353 細(xì)胞活性的影響（，n=3）

3.2 各組SW1353細(xì)胞MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA、ACAN mRNA、COL2a1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 IL-1β組MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組，ACAN mRNA、COL2a1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Cy低、高劑量組MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于IL-1β組，ACAN mRNA、COL2a1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于IL-1β組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明IL-1β誘導(dǎo)處理SW1353細(xì)胞能提高M(jìn)MP-13 mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)，抑制胞外基質(zhì)ACAN mRNA、COL2a1 mRNA表達(dá)，且經(jīng)Cy處理能逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。（見(jiàn)圖2）

圖2 各組SW1353 細(xì)胞MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA、ACAN mRNA、COL2a1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （，n=3）

3.3 各組SW1353細(xì)胞lncRNA SNHG14 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 IL-1β組lncRNA SNHG14 mRNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Cy低、高劑量組lncRNA SNHG14 mRNA表達(dá)水平低于IL-1β組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明IL-1β誘導(dǎo)處理SW1353細(xì)胞能提高lncRNA SNHG14 mRNA表達(dá)，且經(jīng)Cy處理能逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。（見(jiàn)圖3）

圖3 各組SW1353 細(xì)胞lncRNA SNHG14 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （，n=3）

3.4 各組SW1353細(xì)胞MMP-13蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 IL-1β組MMP-13蛋白相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Cy低、高劑量組MMP-13蛋白相對(duì)表達(dá)量低于IL-1β組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)處理SW1353細(xì)胞能提高M(jìn)MP-13蛋白表達(dá)水平，且經(jīng)Cy處理能逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。（見(jiàn)圖4～5）

圖4 各組SW1353 細(xì)胞MMP-13、ACAN、COL2a1 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖5 各組SW1353 細(xì)胞MMP-13、ACAN、COL2a1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （，n=3）

3.5 各組SW1353細(xì)胞外基質(zhì)ACAN、COL2a1相對(duì)表達(dá)量比較 IL-1β組細(xì)胞外基質(zhì)ACAN、COL2a1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Cy低、高劑量組細(xì)胞外基質(zhì)ACAN、COL2a1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于IL-1β組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)處理SW1353細(xì)胞能降低細(xì)胞外基質(zhì)ACAN、COL2a1蛋白表達(dá)水平，且經(jīng)Cy處理能逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。（見(jiàn)圖4～5）

4 討論

Cy（木犀草素-7-0-葡萄糖苷）是廣泛存在于植物中的黃酮類化合物。Cy具有鄰二酚羥基的結(jié)構(gòu)，使其能產(chǎn)生獨(dú)特的藥理作用[3]。Cy主要的功效包括抗炎、抗菌、清除自由基、抗氧化和抗腫瘤[10]。此外，研究[3]表明，較高濃度的Cy（25、50、75、100 μmol/mL）會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒副作用，因此本研究采用CCK-8法檢測(cè)了不同濃度的Cy對(duì)SW1353細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cy在30 μmol/mL時(shí)細(xì)胞活性有所下降，所以本研究選取10、20 μmol/mL的Cy作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理濃度。

促炎因子的表達(dá)在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮著重要的作用，其中IL-1β是促炎性細(xì)胞因子，可以通過(guò)誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解酶[如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶（ADAMTSs）]及其他分解代謝因子和前列腺素E2（PGE2）的上調(diào)而加速骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[11-12]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)處理后，SW1353細(xì)胞MMP-13 mRNA、MMP-13蛋白及IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著增高，但是在加入Cy后其表達(dá)水平明顯下降。結(jié)果表明，Cy可以抑制軟骨基質(zhì)降解酶和相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。

軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的進(jìn)行性和過(guò)度降解，是OA的主要特征之一[13-15]。其主要由Ⅱ型膠原（COL2a1）和蛋白聚糖（如聚集蛋白聚糖）組成；它們可為軟骨提供高度的結(jié)構(gòu)完整性，并吸收壓縮力和沖擊力[16-17]。本研究結(jié)果表明，IL-1β誘導(dǎo)處理后，SW1353 細(xì)胞外基質(zhì)COL2a1 mRNA、ACAN mRNA、COL2a1蛋白、ACAN蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，但是在加入Cy后其表達(dá)量明顯上升。結(jié)果表明，Cy可以通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，發(fā)揮軟骨保護(hù)作用。

lncRNA是長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼轉(zhuǎn)錄物，其異常表達(dá)與多種人類疾病有關(guān)。在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展過(guò)程中，多種lncRNA參與了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解和隨后的關(guān)節(jié)軟骨損傷[18]。lncRNA在調(diào)節(jié)OA的基因表達(dá)中具有重要作用[19]。研究表明，lncRNA SNHG14可通過(guò)靶向抑制miR-136-5p上調(diào)ROCK1表達(dá)[20-21]，從而促進(jìn)MCAO/R誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷和炎癥反應(yīng)[5]。lncRNA SNHG14在各種炎癥的發(fā)生發(fā)展中同樣有著重要的作用[22-24]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)處理后，SW1353細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG14的表達(dá)明顯上調(diào)，但經(jīng)Cy處理后其lncRNA SNHG14的表達(dá)顯著下降。表明Cy可以通過(guò)抑制lncRNA SNHG14的表達(dá)來(lái)發(fā)揮減輕炎癥和軟骨保護(hù)的作用。

綜上所述，Cy能夠改善骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)降解，其作用機(jī)制可能是抑制lncRNA SNHG14表達(dá)。但本研究?jī)H是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，尚缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的證據(jù)進(jìn)行支持。這將是本研究下一步的研究方向，具體的作用機(jī)制也需要進(jìn)一步的研究才能夠闡明。