月芐三甲氯銨和過(guò)硫酸鉀復(fù)合鹽對(duì)犬瘟熱病毒和犬細(xì)小病毒消毒效果的比較

譚 越，孫少輝，白東寧，張 剛，劉 姣，馬妮妮，萬(wàn) 進(jìn)，戴銀娣，王 聰，高鐘鎬

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東省新獸藥創(chuàng)制協(xié)同創(chuàng)新中心，山東青島 266109；2. 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100070；3.西安市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西西安 716100；4. 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司黃岡動(dòng)物藥品廠，湖北黃岡 438021；5. 中牧南京動(dòng)物藥業(yè)有限公司，江蘇南京 210012；6. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050）

犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病對(duì)犬類健康造成嚴(yán)重威脅。犬瘟熱的發(fā)病率和死亡率高達(dá)80%以上，其病原犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）是一種帶有囊膜的單鏈負(fù)鏈RNA病毒，對(duì)高溫、紫外線及有機(jī)溶劑較敏感，對(duì)酸堿抵抗力不強(qiáng)[1-2]，易與細(xì)菌和其他病毒發(fā)生繼發(fā)或混合感染[3]。犬細(xì)小病毒病病原犬細(xì)小病毒（canine parvovirus，CPV）是一種無(wú)囊膜的單鏈DNA病毒，其對(duì)物理消毒和化學(xué)消毒方式具有較強(qiáng)的抵抗力，在低溫下仍具有侵襲性[4]。對(duì)于犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病的防治，不僅要做好免疫預(yù)防，也要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，搞好犬舍清潔衛(wèi)生[5-6]，及時(shí)隔離病犬并加強(qiáng)環(huán)境消毒。

月芐三甲氯銨消毒劑是一種陽(yáng)離子表面活性劑，具有抗菌和抗病毒活性，它通過(guò)聚集在包膜病毒表面來(lái)改變病毒生物膜的通透性和完整性，繼而滲透進(jìn)病毒體內(nèi)，使其蛋白質(zhì)變性[7-9]。過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合鹽可在水中進(jìn)行鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生次氯酸、新生態(tài)氧等，通過(guò)氯化和氧化病原體，干擾病原體DNA或RNA合成，使其蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而干擾病原體酶系統(tǒng)，影響其代謝；此外過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合鹽還會(huì)增加細(xì)胞膜的通透性，造成酶和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失，使病原體溶解破裂，進(jìn)而殺滅病原體[10-12]。本試驗(yàn)使用這兩種消毒劑對(duì)CDV、CPV進(jìn)行體外滅活試驗(yàn)，比較不同消毒劑的滅活作用，從而客觀反映這兩種消毒劑的實(shí)際臨床消毒效果，以期為犬病毒性疾病防控中消毒劑的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

消毒劑1（10%月芐三甲氯銨溶液+有機(jī)微量元素）、消毒劑2（月芐三甲氯銨溶液）和消毒劑3（過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合鹽消毒粉），均為國(guó)內(nèi)市售產(chǎn)品。試驗(yàn)所用病毒株為CDV QN-1株、CPV QN株，細(xì)胞為Vero細(xì)胞和F81細(xì)胞，均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，購(gòu)自美國(guó)Cytiva公司；Trypsin-EDTA，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清，購(gòu)自美國(guó)BI公司；D-PBS，購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒擴(kuò)增及懸液制備 CDV采用異步接毒法，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層后棄掉培養(yǎng)基，將病毒接入，37 ℃吸附1 h后更換維持液繼續(xù)培養(yǎng)。具體方法如下：待細(xì)胞瓶?jī)?nèi)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到70%～80%時(shí)，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基上清并用PBS沖洗3次，加入適量CDV，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后棄掉病毒液，用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液維持培養(yǎng)，每隔24 h觀察細(xì)胞病變（CPE），待80%～90%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收毒，收毒時(shí)將細(xì)胞瓶置于-80 ℃冰箱反復(fù)凍融3次，1 200 r/min離心5 min，收集上清，將其分裝于1.5 mL保存管，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩PV采用同步接毒法，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層后棄掉培養(yǎng)基，將病毒接入，同時(shí)加入維持培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在此期間不更換培養(yǎng)基。具體方法如下：待T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中F81細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)，棄掉原培養(yǎng)基，用PBS沖洗3遍，吸取1 mL CPV加至細(xì)胞瓶中，再向細(xì)胞瓶中加入11 mL含2%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待80%～90%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收毒，收毒步驟同CDV。

1.2.2 病毒滴度測(cè)定 分別用Vero細(xì)胞和F81細(xì)胞鋪板，待T25培養(yǎng)瓶細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用胰酶消化后沖懸于細(xì)胞瓶中，計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)，以5×104個(gè)接種于96孔板中，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。稀釋CDV QN-1株和CPV QN株，待96孔細(xì)胞板內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)至單層后，棄掉原培養(yǎng)液，用PBS沖洗2～3遍，用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液將CDV和CPV進(jìn)行10倍倍比稀釋（10-1～10-10），按每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞板中（CDV接種于鋪滿Vero細(xì)胞的96孔板上，CPV接種于鋪滿F81細(xì)胞的96孔板上），做8個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，待出現(xiàn)CPE后觀察記錄結(jié)果，用Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

1.2.3 最高病毒滴度接種量確定 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%～90%時(shí)，將CDV和CPV病毒液按照細(xì)胞培養(yǎng)體積0.02%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%的比例分別接種Vero和F81細(xì)胞[13]，然后將其置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待CPE達(dá)到80%～90%時(shí)收毒。將收獲的病毒液按照1.2.2中的方法分別測(cè)定TCID50，比較不同接毒量的TCID50，確定能產(chǎn)生最高病毒滴度的接毒量。

1.2.4 消毒劑毒性測(cè)定 用細(xì)胞維持液把消毒劑稀釋100倍，分別將已稀釋的消毒劑再次進(jìn)行倍比稀釋（10-1～10-3），接種于96孔板中，設(shè)置重復(fù)以及陰性對(duì)照，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后在顯微鏡下觀察不會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生影響的消毒劑使用濃度。

1.2.5 消毒劑的體外消殺作用 用滅菌水將消毒劑進(jìn)行100倍稀釋，選用最高病毒滴度的CDV和CPV毒株，分別將消毒劑與病毒等比例混合于平皿中，室溫作用0、1、3、10、24 h后接種細(xì)胞，根據(jù)CPE計(jì)算病毒滴度和殺滅指數(shù)。殺滅指數(shù)=消毒劑與病毒作用后的TCID50/病毒陽(yáng)性TCID50[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒感染細(xì)胞觀察

從圖1可觀察到CDV感染Vero細(xì)胞不同時(shí)間形態(tài)的改變：接毒24 h時(shí)，少量細(xì)胞變圓，縮小；48 h時(shí)，大部分細(xì)胞變圓，出現(xiàn)明顯CPE；72 h時(shí)，細(xì)胞大量脫落，呈拉絲狀懸浮在細(xì)胞液中。

圖1 CDV感染Vero細(xì)胞觀察結(jié)果

從圖2能觀察到CPV感染F81細(xì)胞不同時(shí)間形態(tài)的改變：接毒24 h時(shí)，CPE不顯著；48 h時(shí)80%以上細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞變得細(xì)長(zhǎng)，CPE顯著；72 h細(xì)胞出現(xiàn)拉絲脫落，飄浮在細(xì)胞培養(yǎng)基中。

圖2 CPV感染F81細(xì)胞觀察結(jié)果

2.2 病毒滴度測(cè)定

根據(jù)表1～2數(shù)據(jù)，用Reed-Muench法計(jì)算出CDV和CPV的TCID50分別為10-5.5/0.1 mL和10-5.8/0.1 mL。

表1 CDV滴度的測(cè)定結(jié)果

表2 CPV滴度的測(cè)定結(jié)果

2.3 最高病毒滴度接種量確定

接毒結(jié)果（圖3～4）顯示：CDV接毒量占細(xì)胞培養(yǎng)基總量的2%時(shí)，培養(yǎng)滴度最高為10-5.5/0.1 mL；CPV接毒量占細(xì)胞培養(yǎng)基總量的1%時(shí)，培養(yǎng)滴度最高為10-5.8/0.1 mL。

圖3 CDV異步接毒結(jié)果

圖4 CPV同步接毒結(jié)果

2.4 消毒劑毒性測(cè)定

通過(guò)顯微鏡觀察到，3種消毒劑10-1稀釋均對(duì)Vero細(xì)胞和F81細(xì)胞有較大的毒性作用，因此在10-1稀釋的基礎(chǔ)上再次進(jìn)行10倍倍比稀釋。結(jié)果（圖5～6）顯示：當(dāng)10-1稀釋時(shí)，細(xì)胞死亡；當(dāng)10-2和10-3稀釋時(shí)，細(xì)胞形態(tài)正常，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。因此，計(jì)算消毒劑與病毒作用后的TCID50時(shí)，從10-2稀釋時(shí)開始計(jì)算CPE孔數(shù)。

圖5 3種消毒劑對(duì)Vero細(xì)胞的毒性觀察結(jié)果

圖6 3種消毒劑對(duì)F81細(xì)胞的毒性觀察結(jié)果

2.5 消毒劑殺滅效果

2.5.1 消毒劑與病毒作用后的TCID50選用最高病毒含量的CDV（TCID50= 10-5.5/0.1 mL）和CPV（TCID50 = 10-5.8/0.1 mL）病毒原液，分別與100倍稀釋后的3種消毒劑等比例混合于平皿中，室溫作用不同時(shí)間后接種細(xì)胞，記錄出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)根據(jù)2.4中的結(jié)果舍棄10-1稀釋，從10-2稀釋開始計(jì)算CPE孔數(shù)。消毒劑與病毒作用結(jié)果（表3～4）顯示：在室溫下3種消毒劑與CDV作用24 h就可將其完全滅活，而與CPV作用24 h未能將其徹底滅活。

表3 消毒劑與CDV作用后結(jié)果（TCID50）

表4 消毒劑與CPV作用后結(jié)果（TCID50）

2.5.2 消毒劑殺滅指數(shù) 3種消毒劑與CDV（TCID50= 10-5.5/0.1 mL）、CPV（TCID50= 10-5.8/0.1 mL）作用后的殺滅指數(shù)如表5～6所示。可以看出：3種消毒劑中，消毒劑3對(duì)CDV和CPV的殺滅作用最強(qiáng)，其次是消毒劑1，最后為消毒劑2。

表5 消毒劑與CDV作用殺滅指數(shù)

表6 消毒劑與CPV作用的殺滅指數(shù)

3 討論

隨著寵物行業(yè)的不斷發(fā)展，一些傳染性疾病如犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病等的發(fā)病率和死亡率不斷上升，對(duì)于此類病毒病的防控，消毒劑起到了尤為重要的作用，通過(guò)正確使用消毒劑可以切斷病原傳播途徑，控制傳染病流行，從源頭上阻斷病原微生物傳播[14-15]。雖然目前市場(chǎng)上消毒劑種類繁多，但它們大多以滅菌效果作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)病毒的滅活效果研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上反映了月芐三甲氯銨和過(guò)硫酸鉀復(fù)合鹽對(duì)犬類病毒性疾病的臨床應(yīng)用效果，為寵物行業(yè)消毒劑的選擇提供了參考。

病毒的抵抗力介于細(xì)菌和芽孢體之間，而囊膜病毒和非囊膜病毒在體外滅活難易程度上有明顯差異。通過(guò)本試驗(yàn)可以看出，月芐三甲氯銨和過(guò)硫酸鉀復(fù)合鹽消毒劑對(duì)CDV的殺滅效果更好，以此驗(yàn)證了親脂性消毒劑對(duì)囊膜病毒更有效。張浩等[16]以豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗和偽狂犬病病毒活疫苗作為RNA/DNA病毒模型，檢測(cè)了過(guò)硫酸鉀復(fù)合鹽消毒劑對(duì)兩種病毒的降解效果，發(fā)現(xiàn)過(guò)硫酸鉀復(fù)合鹽消毒劑能100%降解RNA和DNA病毒核酸。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)硫酸鉀復(fù)合鹽消毒劑（消毒劑3）與CDV（有囊膜RNA病毒）作用24 h可將其完全殺滅，但卻不能完全殺滅CPV（無(wú)囊膜DNA病毒），造成此差異的原因可能與不同毒株毒力的強(qiáng)弱以及病毒結(jié)構(gòu)有關(guān)。CPV直徑小，無(wú)囊膜包被，但有蛋白質(zhì)衣殼，因而對(duì)消毒劑有較高抵抗力，一般消毒劑很難將其殺滅。然而有研究[17]發(fā)現(xiàn)與次氯酸作用15 min可以使CPV在細(xì)胞上完全喪失感染性。因此，在選擇消毒劑時(shí)要充分考慮病毒性質(zhì)及結(jié)構(gòu)。目前月芐三甲氯銨消毒劑主要應(yīng)用于細(xì)菌病防控。鄧同煒等[18]的研究表明，月芐三甲氯銨消毒劑對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的殺滅率均可達(dá)到100%。然而此類消毒劑在犬類病原微生物感染的防控過(guò)程中應(yīng)用較少。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，月芐三甲氯銨消毒劑對(duì)犬類病毒有一定的滅活效果，且安全性高，因此在臨床中也會(huì)有一定的應(yīng)用價(jià)值。從CDV、CPV與消毒劑體外作用時(shí)間上看，延長(zhǎng)與消毒劑的作用時(shí)間可以增強(qiáng)消毒效果；從生物安全角度出發(fā)，為避免耐藥性產(chǎn)生，應(yīng)定期更換消毒劑，在消毒劑選擇上既要考慮其消毒效果，也要考慮其對(duì)動(dòng)物的傷害，在此基礎(chǔ)還需要考慮外界環(huán)境因素對(duì)消毒劑的影響，以充分發(fā)揮其消毒效果。