不同分子生物學(xué)方法在H5亞型禽流感病毒檢測中的應(yīng)用比較

尚佳靜，羅 娟，于曉慧，房立春，亓麗紅，孟 鴿，封瑩潔，蔣文明，劉華雷，劉冠慧，李 陽

（1. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；2. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250199）

禽流感（avian influenza，AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一類急性、熱性、高度接觸性疾病。AIV屬于正黏病毒科，為單股負(fù)鏈RNA病毒，有囊膜，主要通過呼吸道、消化道或者直接接觸傳播[1]。根據(jù)HA蛋白差異，AIV可分為16個血清型（H1～16），其中H5-AIV被歸類于高致病性禽流感病毒（high pathogenic avian influenza virus，HPAIV）[2]。高致病性禽流感（high pathogenic avian influenza，HPAI）是世界動物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health，WOAH）規(guī)定的法定報告疫病，我國將其列為一類動物疫病。2019—2022年，H5-AIV一直在歐洲、非洲和亞洲的禽類中流行，使全球禽類病例從3 430例增加至25萬例[3-5]。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部官方網(wǎng)站報道，2022年全球60多個國家和地區(qū)的家禽和野鳥中暴發(fā)了H5-AI疫情，超1.31億只家禽死亡或被撲殺；2023年以來，H5-AIV在歐洲、美洲、亞洲和非洲的40多個國家和地區(qū)傳播，導(dǎo)致超過3 700萬只家禽死亡或被撲殺。此外，哺乳動物（如貂、水獺、狐貍和海獅）感染H5-AIV的病例也不斷出現(xiàn)[6-8]。盡管AIV通常在鳥類中傳播，但哺乳動物感染H5N1-AIV的病例也在持續(xù)增加。在生物學(xué)上，哺乳動物比鳥類更接近人類，這更加引發(fā)了人們關(guān)于病毒可能適應(yīng)新變化，從而對人類感染性更強(qiáng)甚至引發(fā)全球大流行的擔(dān)憂。因此，建立快速且準(zhǔn)確可靠的檢測方法對H5-AI防控具有重要意義。

目前，實(shí)驗(yàn)室常見的H5-AIV檢測方法主要有反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）[9]、熒光定量PCR（RT-qPCR）[10]、病毒分離[11]、血凝和血凝抑制（HA/HI）試驗(yàn)等，為H5-AI疫情防控提供了有力支撐。但這些方法因操作復(fù)雜、耗時長、對場地要求高等局限性難以被廣泛應(yīng)用。重組酶輔助擴(kuò)增技術(shù)（RAA）與成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas）是近年來新興的核酸檢測技術(shù)，可以在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對病原的快速檢測[12-13]。本研究使用RT-PCR、RT-qPCR、反轉(zhuǎn)錄重組酶輔助擴(kuò)增（RT-RAA）、RT-RAA結(jié)合側(cè)流層析試紙條（RTRAA-LFD）、RT-RAA-簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白結(jié)合側(cè)流層析試紙條（RT-RAACRISPR Cas13a-LFD）等5種檢測技術(shù)對構(gòu)建的H5-AIV cRNA標(biāo)準(zhǔn)品和臨床樣本進(jìn)行檢測，旨在對目前已建立的5種H5-AIV檢測方法進(jìn)行比較分析，以期為H5-AIV感染的檢測與防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及臨床樣本 本研究所用的H5-AIV毒株，均由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測室保存?zhèn)溆茫?0份臨床家禽肛拭子、咽拭子樣本，采集自山東、湖南、廣東等地。

1.1.2 儀器與耗材 熒光定量PCR儀，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；恒溫金屬浴，購自莫納生物科技有限公司；振蕩混勻儀、恒溫核酸擴(kuò)增儀，購自江蘇奇天生物科技有限公司；瓊脂糖、TAE緩沖液，購自青島睿博興科生物技術(shù)有限公司；RT-RAA、RAA恒溫擴(kuò)增試劑盒（熒光型）、一次性核酸檢測試紙條（顯線法/消線法），購自杭州眾測生物科技有限公司；RNA/DNA核酸提取試劑盒，購自濟(jì)凡生物科技（青島）有限公司；pEASY?-T1 Cloning Kit，購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；膠回收試劑盒，購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒，購自天根生化科技有限公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit、RNase抑制劑，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Evo M-MLV一步法RT-qPCR檢測試劑盒Ⅱ（探針法），購自艾科瑞生物科技有限公司；LWaCas13a，購自金斯瑞生物科技股份有限公司；T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、T7 RNA聚合酶、NTP，購自NEB公司；MgCl2、HEPES，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 引物及探針序列 本研究所用引物及探針序列見表1。

表1 引物和探針名稱及序列

1.2 病毒核酸提取

根據(jù)濟(jì)凡生物科技（青島）有限公司RNA/DNA通用核酸提取試劑盒說明書，進(jìn)行H5-AIV及臨床樣本核酸提取。

1.3 cRNA標(biāo)準(zhǔn)品制備

以H5-AIV核酸為模板，使用HA-F/HA-R引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定條帶大小無誤后進(jìn)行回收純化；將純化產(chǎn)物連接至T載體，然后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)熱激、冰浴后，向其中加入LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)1 h；將菌液涂布于含有Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)4 h；進(jìn)行菌落PCR，將鑒定為陽性的菌液送至睿博興科生物技術(shù)有限公司測序；提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，使用DNA回收試劑盒對目的基因回收，再經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得cRNA，最后以Rneasy MiNi Kit純化，測定純化后的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度并置于-80 ℃保存。

1.4 RT-PCR檢測

分別以不同拷貝數(shù)濃度梯度的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，以RT-PCR-F/RT-PCR-R為引物，按照RT-PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；90 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，于照膠儀中觀察結(jié)果。

1.5 RT-qPCR檢測

分別以不同拷貝數(shù)濃度梯度的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，以RT-qPCR-F/RT-qPCR-R為引物，以RTqPCR-P為探針，按照一步法RT-qPCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：42 ℃ 5 min，95 ℃30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，35個循環(huán)。

1.6 RT-RAA檢測

分別以不同拷貝數(shù)濃度梯度的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，以RT-RAA-F/RT-RAA-R為引物，以RTRAA-P為探針，按照RT-RAA恒溫擴(kuò)增試劑盒（熒光型）說明書配制反應(yīng)體系。配制完成后將反應(yīng)單元放于振蕩混勻儀，37 ℃反應(yīng)5 min，然后轉(zhuǎn)移至恒溫核酸擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，37 ℃反應(yīng)20 min，記錄檢測結(jié)果。

1.7 RT-RAA-LFD檢測

分別以不同拷貝數(shù)濃度梯度的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，以RT-RAA-LFD-F/RT-RAA-LFD-R為引物，以RT-RAA-LFD-P為探針，按照RT-RAA恒溫擴(kuò)增試劑盒（熒光型）說明書配制反應(yīng)體系，將不含B Buffer的反應(yīng)混合溶液加入試劑盒反應(yīng)干粉中，隨后在反應(yīng)管蓋加入2.5 μL B Buffer，輕輕混勻后將反應(yīng)單元置于恒溫金屬浴中，37 ℃反應(yīng)15 min。待擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，吸取10.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入含有60 μL PBS緩沖液的離心管中，將試紙條放入離心管，5 min內(nèi)觀察結(jié)果并記錄。

1.8 RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD檢測

分別以不同拷貝數(shù)濃度梯度的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，以Cas13a-F/Cas13a-R為引物，按照RTRAA恒溫擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)法）說明書配制RTRAA反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。待擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入到45 μL CRISPR Cas13a檢測體系中，體系如表2所示。

表2 RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD反應(yīng)體系

將上述體系充分混勻后，立即放入恒溫金屬浴中，37 ℃反應(yīng)20 min（注意避光），反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)體系放入照膠儀中觀察結(jié)果并拍照。

1.9 臨床樣本檢測及數(shù)據(jù)處理

利用上述5種方法對80份臨床樣本進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果應(yīng)用SPSS軟件分析符合率和Kappa值。符合率即不同方法檢測結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果相同數(shù)占樣本總數(shù)的比例；Kappa值為一致性統(tǒng)計指標(biāo)，Kappa值≥0.75說明兩種方法檢測結(jié)果具有良好一致性，0.4≤Kappa值＜0.75說明一致性一般，Kappa值＜0.4說明一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 靈敏度比較

2.1.1 RT-PCR檢測 測得cRNA標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為39.4 ng/μL，經(jīng)換算，拷貝數(shù)濃度為4.1×1010copies/μL，將其稀釋為1×1010copies/μL，經(jīng)10倍倍比稀釋后，以108～101copies/μL的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果（圖1）顯示，RT-PCR方法可檢測到100 copies/μL的H5-AIV cRNA標(biāo)準(zhǔn)品。

圖1 RT-PCR方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 RT-qPCR檢測 以103～10-1copies/μL的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，評估該方法的靈敏度。結(jié)果（圖2）顯示，RT-qPCR方法可檢測到10-1copies/μL的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品。

圖2 RT-qPCR方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 RT-RAA檢測 以103～10-1copies/μL的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行RT-RAA檢測。結(jié)果（圖3）顯示，RT-RAA方法可檢測到1 copies/μL的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品。

圖3 RT-RAA方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 RT-RAA-LFD檢測 以105～10-1copies/μL的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行RT-RAA-LFD檢測。結(jié)果（圖4）顯示，RT-RAA-LFD方法可檢測到1 copies/μL的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品。

圖4 RT-RAA-LFD方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD檢測以106～10-2copies/μL的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，以ddH2O為陰性對照，進(jìn)行RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD檢測。結(jié)果（圖5）顯示，RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD方法可檢測到10-1copies/μL的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品。

圖5 RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.2 臨床應(yīng)用比較

利用RT-qPCR方法對本研究中所收集的80份臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果共鑒定出38份H5-AIV陽性樣本，42份H5-AIV陰性樣本。隨后使用4種方法進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析比較。結(jié)果（表3）顯示：RT-PCR、RT-RAA、RT-RAALFD、RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD與RT-qPCR結(jié)果的符合率分別85.00%、93.75%、88.75%、91.25%，與RT-qPCR相比，上述4種方法的Kappa值分別為0.74、0.87、0.77、0.82，提示RT-PCR一致性符合率最低。

表3 不同檢測方法與RT-qPCR在臨床樣本檢測的比較

3 討論

由H5-AIV引起的HPAI不僅嚴(yán)重影響著我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，還對公共衛(wèi)生安全造成了威脅。我國是養(yǎng)殖業(yè)第一大國，鑒于動物和人類H5-AIV感染病例的不斷出現(xiàn)，加強(qiáng)對其檢測，防止進(jìn)一步傳播至關(guān)重要。

當(dāng)前，針對H5-AIV常用的實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要有RT-PCR、病毒分離及RT-qPCR。RT-PCR已被廣泛用于AIV檢測，相較于RT-qPCR，其成本較低，便于操作，但擴(kuò)增產(chǎn)物需進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，這增加了檢測時間，且顯影劑對人體傷害較大[14]；RT-qPCR雖靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，但由于熒光定量PCR儀及試劑昂貴，且需專業(yè)人員進(jìn)行操作等問題，無法滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。應(yīng)在生物安全三級實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）或更高等級的設(shè)施中處理HPAIV，這使得試驗(yàn)開展具有一定的局限性，成本較高，增加了試驗(yàn)難度[15]。恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)與CRISPR技術(shù)具有特異性好，靈敏度高的特點(diǎn)，同時結(jié)合側(cè)流層析試紙條可實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的可視化。本研究選用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)RT-PCR、RT-qPCR方法及新興RAA與CRISPR技術(shù)，對H5-AIV檢測的靈敏度和臨床應(yīng)用效果進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示：RT-qPCR方法靈敏度更高，但與RT-PCR方法一樣檢測時間需1～2 h，不僅耗時長還需精密儀器及專業(yè)人員操作，無法滿足現(xiàn)場快速檢測需求；RT-RAA、RT-RAA-LFD與RTRAA-CRISPR Cas13a-LFD均可在恒溫條件下進(jìn)行病毒核酸擴(kuò)增，且RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD與WOAH推薦的RT-qPCR檢測靈敏度一致，臨床檢測符合率較高，是值得推廣的一項(xiàng)技術(shù)。但本研究中RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD擴(kuò)增為兩步法，即RT-RAA擴(kuò)增一步，CRISPR一步，存在造成氣溶膠污染的風(fēng)險。因此，為進(jìn)一步縮短檢測時間并降低氣溶膠污染風(fēng)險，應(yīng)將RT-RAA擴(kuò)增與CRISPR于一管中反應(yīng)。綜上，RT-qPCR作為WOAH推薦的確認(rèn)樣本中是否存在病毒核酸的方法之一，靈敏度高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但需昂貴儀器，難以被廣泛應(yīng)用；RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD與RT-qPCR方法靈敏度一致，較優(yōu)于其余3種。臨床樣本檢測結(jié)果表明，RT-RAA、RT-RAA-LFD、RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD與RT-qPCR臨床診斷的符合率較高，高于RT-PCR的檢出率。5種方法整體對H5-AIV檢測結(jié)果良好，但對儀器設(shè)備要求有所差異，檢測人員可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。

總之，本研究使用不同分子生物學(xué)方法對H5-AIV的檢測結(jié)果進(jìn)行了比較和分析，以期為H5-AIV感染的防控提供可靠的技術(shù)支撐。