產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

楊夷平，李海利，楊 帆，楊 康，段進(jìn)剛，張國(guó)新，李 斌，馬春江

（哈密市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，新疆哈密 839000）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens，Cp）因在動(dòng)物體內(nèi)能分解糖類(lèi)產(chǎn)出大量氣體且能形成莢膜而得名，是梭菌屬的一種條件性致病厭氧菌。該菌分布廣泛，可通過(guò)食物、飲用水感染動(dòng)物，是引起羔羊痢疾和羊、牛犢等動(dòng)物猝死、腸毒血癥、壞死性腸炎的主要病原之一。Cp感染后，動(dòng)物發(fā)病急且往往無(wú)明顯臨床癥狀，在數(shù)分鐘或幾小時(shí)內(nèi)死亡。Cp感染需經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)或毒素鑒定才可確診，嚴(yán)重危害了畜牧業(yè)的健康發(fā)展[1-4]。Cp的致病性源于其產(chǎn)生的外毒素，此外毒素侵襲力強(qiáng)、種類(lèi)多，包含α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν等12種。根據(jù)外毒素的種類(lèi)差別，可將Cp分為A、B、C、D、E、F、G 7個(gè)型[5-6]。在各種毒素中，α毒素（磷脂酶C）是Cp最為重要的致死性毒素之一，A—G型Cp均可分泌α毒素，且不同型Cp編碼α毒素的cpa基因具有相似的核苷酸序列。cpa基因位于Cp染色體上，在各個(gè)型之間相對(duì)保守[7-9]。

目前Cp的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)以細(xì)菌學(xué)檢查、細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR分型鑒定為主，這些檢測(cè)方法存在依靠主觀(guān)判斷、耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)，不足以應(yīng)對(duì)該病突發(fā)時(shí)的快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查[10]。本研究針對(duì)Cp α毒素編碼基因的保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，通過(guò)優(yōu)化擴(kuò)增條件，并對(duì)其特異性、敏感性等進(jìn)行評(píng)估，建立了一種TaqMan熒光定量PCR方法，為Cp的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

Cp A型（CVCC2011）、B型（CVCC1146）、C型（CVCC3831）和D型（CVCC1167），均由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心研究員孫雨惠贈(zèng)；多殺性巴氏桿菌（ATCC12945）、沙門(mén)氏菌（ATCC14028）、大腸桿菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、腐敗梭菌（BNCC327578）等，均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)。

1.2 主要試劑和儀器

2×TaqMan Fast qPCR預(yù)混液，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；動(dòng)物病毒DNA/RNA快速提取試劑盒，購(gòu)自西安天隆科技有限公司；Cp熒光PCR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自某生物公司；其他常規(guī)試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。核酸提取儀，購(gòu)自西安天隆科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（QuantStudioTM3），購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 引物、探針設(shè)計(jì)與合成

參照NCBI GenBank中收錄的Cpcpa基因的完整cds序列（序列號(hào)L43548.1），以其作為靶基因，進(jìn)行Blast同源性搜索。通過(guò)ClustalX軟件進(jìn)行比對(duì)，篩選出特異性、保守性較高的區(qū)域，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物及探針，引物、探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物、探針信息見(jiàn)表1。

表1 引物、探針序列信息

1.4 熒光定量PCR方法建立及擴(kuò)增條件優(yōu)化

以A型Cp DNA為檢測(cè)模板，參照一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量探針試劑盒說(shuō)明書(shū)建立反應(yīng)體系（20.0 μL）：one step RT- qPCR Probe Mix（2×）10.0 μL，DNA模板2.0 μL，DNF Buffer 2.0 μL，不同組合濃度的上下游引物和TaqMan探針各0.5 μL，最后補(bǔ)充RNase free H2O 4.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，在退火階段收集熒光信號(hào)。設(shè)置不同的退火溫度（58、59、60、61、62 ℃），篩選出最適退火溫度。將引物、探針濃度稀釋至10 μmol/L，設(shè)置上下游引物濃度和探針濃度分別為0.20、0.25、0.30、0.40 μmol/L，并進(jìn)行矩陣組合，篩出最佳引物、探針濃度組合。

1.5 敏感性、特異性及重復(fù)性試驗(yàn)

1.5.1 敏感性試驗(yàn) 提取A型Cp基因組DNA，測(cè)定核酸質(zhì)量濃度，然后將提取的核酸進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?00～10-6）。以7個(gè)稀釋度的核酸作為模板（編號(hào)1～7），應(yīng)用本研究建立的熒光定量PCR和普通PCR方法分別進(jìn)行檢測(cè)，比較二者的敏感性。

1.5.2 特異性試驗(yàn) 分別提取A—D型Cp、多殺性巴氏桿菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腐敗梭菌等DNA樣本，以蒸餾水為陰性對(duì)照，應(yīng)用本研究建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 選取3個(gè)稀釋度的A型Cp基因組DNA為模板，按優(yōu)化的條件分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，計(jì)算Ct的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，評(píng)估該方法的組內(nèi)和組間重復(fù)性。

1.6 臨床樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法與商品熒光PCR檢測(cè)試劑盒，以A型Cp基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水為陰性對(duì)照，對(duì)24份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

保持其他條件不變，取A型Cp DNA樣本2.0 μL作為反應(yīng)模板，選擇不同的退火溫度（58、59、60、61、62 ℃）進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在60 ℃時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（S形），因此確定最適退火溫度為60 ℃。當(dāng)加入上下游引物和探針各0.25 μmol/L時(shí)，可獲得最低的Ct值和較高的熒光強(qiáng)度增加值。因此，最終確定熒光PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：one step RT- qPCR Probe Mix（2×）10.0 μL，DNA模板2.0 μL，上下游引物和TaqMan探針（濃度均為0.25 μmol/L）各0.5 μL，DNF Buffer 2.0 μL，RNase free H2O 4.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，在退火階段收集熒光信號(hào)。

2.2 敏感性試驗(yàn)

經(jīng)檢測(cè)，A型Cp基因組DNA質(zhì)量濃度為0.91×105pg/μL。將7個(gè)稀釋度的A型Cp基因組DNA作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，應(yīng)用建立的熒光PCR方法能檢測(cè)出5個(gè)稀釋度（編號(hào)1～5）的基因組DNA模板，擴(kuò)增曲線(xiàn)呈S形，最低檢測(cè)限為0.91×101pg/μL（圖1），而普通PCR檢測(cè)的最低檢測(cè)限為0.91×103pg/μL（圖2）。結(jié)果表明，建立的熒光定量PCR方法比普通PCR敏感100倍。

圖1 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖2 普通PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 特異性試驗(yàn)

結(jié)果（圖3）顯示，該方法能擴(kuò)增A—D型Cp，但對(duì)多殺性巴氏桿菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腐敗梭菌等病原菌及陰性對(duì)照均無(wú)特異性擴(kuò)增。結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性。

圖3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，組內(nèi)和組間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.4，表明該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表2 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測(cè)

本研究建立的Cp α毒素?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的判定標(biāo)準(zhǔn)：Ct值小于35，擴(kuò)增曲線(xiàn)有良好的線(xiàn)性關(guān)系（S形），則判定為陽(yáng)性；Ct值為35～38，需進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，若2次試驗(yàn)擴(kuò)增有良好的線(xiàn)性關(guān)系（S形），則判定為陽(yáng)性；Ct值大于38，判定為陰性。應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法與商品試劑盒，對(duì)24份疑似Cp感染的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，檢測(cè)出陽(yáng)性樣品5份，且兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為100%。隨后對(duì)5份陽(yáng)性樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，并比對(duì)分析測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)5份擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與編碼Cp α毒素基因片段同源性均為100%，證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物中含有cpa基因核酸，表明本研究建立的方法可應(yīng)用于Cp臨床檢測(cè)。

3 討論

Cp多存在于動(dòng)物腸道內(nèi)，一般不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體發(fā)病死亡，只有當(dāng)畜體免疫力低下或受到不良因素影響時(shí)才會(huì)大量繁殖并產(chǎn)生各類(lèi)毒素，引起畜禽多種疫病。該菌可引起豬、禽、犢牛壞死性腸炎以及羔羊痢疾、羊腸毒血癥、羊猝疽、羊猝死等。α毒素是多種類(lèi)型Cp均可產(chǎn)生的外毒素，引起的疫病大多發(fā)病急，缺乏有效的治療手段[11-12]，提前預(yù)防和早日確診顯得尤為重要。

目前，在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方面，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我國(guó)對(duì)Cp α毒素檢測(cè)方法的研究也比較成熟，如檢測(cè)α毒素各類(lèi)型的ELISA方法[13-14]，普通PCR檢測(cè)方法[15-16]，雙重或多重PCR分型檢測(cè)方法[17-19]等，但操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與普通PCR技術(shù)相比有一定技術(shù)優(yōu)勢(shì)，其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好、耗時(shí)短、成本相對(duì)較低，可為產(chǎn)氣莢膜梭菌病的防控提供一定幫助[20-22]。本研究選取編碼Cp α毒素的基因片段為靶基因，其相對(duì)于其他物種高度特異。經(jīng)序列比對(duì)后篩選出1對(duì)特異性引物，引物片段大小控制在25 bp左右，Tm值相差僅0.1 ℃，這使得在同樣退火溫度下各目的片段都能夠獲得較好的擴(kuò)增效率。探針加入后，不僅上下游引物要與模板匹配，探針也需與模板匹配，與引物和探針序列都匹配后擴(kuò)增的產(chǎn)物才能產(chǎn)生熒光信號(hào)，這跟傳統(tǒng)引物相比提升了檢測(cè)特異性。從靈敏度來(lái)看，對(duì)于一些低拷貝和低濃度樣品，隨著循環(huán)數(shù)的增加，容易出現(xiàn)引物二聚體，后者因不是目的片段，沒(méi)有探針結(jié)合位點(diǎn)，所以不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，更體現(xiàn)了探針?lè)晒舛縋CR的高準(zhǔn)確性和高靈敏度。

本研究建立的TaqMan探針熒光定量PCR方法，一方面可通過(guò)檢測(cè)Cp核酸，判斷導(dǎo)致家畜突然死亡的主要致死因素，降低臨床診斷的誤診率和生化試驗(yàn)的工作量，縮短檢測(cè)周期，為疫病防控爭(zhēng)取時(shí)間；另一方面可降低檢測(cè)成本，尤其適合經(jīng)費(fèi)不足的基層檢測(cè)部門(mén)，從而為產(chǎn)氣莢膜梭菌病的快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供有效的技術(shù)支撐。