非洲豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型三重PCR檢測方法的建立

俄廣曉，孫少輝，鄧 金，萬 進(jìn)，閆才杰，韓 峰，馬妮妮，戴銀娣，楊秋實(shí)，張少南，王 聰，張振東

（1. 江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212018；2. 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100070；3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；4. 中牧南京動物藥業(yè)有限公司，江蘇南京 210012）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，是唯一通過節(jié)肢動物媒介傳播的DNA病毒[1]。病毒粒子直徑為175～215 nm，呈正二十面體對稱結(jié)構(gòu)，具有囊膜。豬感染后表現(xiàn)為高燒、呼吸困難以及各組織器官廣泛性出血等臨床癥狀，發(fā)病率和病死率最高可達(dá)100%[2]。目前仍無有效藥物和疫苗可對其進(jìn)行治療和預(yù)防。

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）是一種堿基數(shù)少、呈圓環(huán)狀、無包膜的單鏈DNA病毒，是目前已知最小的動物病毒之一。目前已經(jīng)確定了4種PCV（PCV1～4），豬感染后可出現(xiàn)體重增長緩慢、消瘦、呼吸困難、腹瀉以及先天性震顫和繁殖障礙等一系列臨床癥狀[3-4]，其中PCV2和PCV3感染最為常見。PCV單獨(dú)感染時(shí)并不容易導(dǎo)致豬出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，但與其他病原的混合感染以及對感染豬產(chǎn)生免疫抑制所造成的繼發(fā)性感染，一直是養(yǎng)豬業(yè)面臨的難題。自2018年我國發(fā)生非洲豬瘟疫情以來，實(shí)驗(yàn)室檢測被廣泛普及與應(yīng)用，是監(jiān)督、復(fù)核與驗(yàn)證群體免疫和生物安全水平是否合格及豬群健康管理的有效工具，給我國豬病診斷與防控帶來了巨大幫助。本研究基于ASFV、PCV2、PCV3 3種DNA病毒，建立了一種可同時(shí)檢測3種病原的三重PCR方法，為上述病毒感染的臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查及科學(xué)防控提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病原核酸及質(zhì)粒

PCV2、PCV3、豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）、偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）等病毒核酸，均由江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；ASFVVP72基因部分序列，由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

1.2 主要試劑

Simply P病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自杭州博日科技有限公司；MagZol Reagent一步法RNA抽提試劑，購自Magen生物科技有限公司；2×TaqMaster Mix（Dye Plus）和HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒，購自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；pMD19-T載體，購自TaKaRa公司；TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，由江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

圖1 退火溫度優(yōu)化結(jié)果

圖2 引物濃度優(yōu)化結(jié)果

圖3 循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GeneBank上登陸的ASFV、PCV2及PCV3相關(guān)基因序列，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 ASFV、PCV2和PCV3擴(kuò)增引物信息

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

根據(jù)Simply P病毒DNA/RNA提取試劑盒使用說明書，分別提取PCV2和PCV3基因組DNA；以提取的DNA為模板，分別使用設(shè)計(jì)的引物對靶序列進(jìn)行擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物回收純化后，通過酶切等手段連接至pMD19-T載體。以合成的ASFVVP72基因部分序列為模板，使用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，隨后同樣連接至pMD19-T載體。將3種連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板后隨即對陽性克隆菌篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)，提取目標(biāo)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增、測序鑒定。在成功構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品后，根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式可得出3種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原始拷貝數(shù)，再分別稀釋至1×1010copies/μL，隨即分別進(jìn)行10倍倍比稀釋，取1×108～1×101copies/μL的陽性質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 三重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

以3種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用設(shè)計(jì)好的3對高特異性引物在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見表2。

表2 三重PCR反應(yīng)體系

對退火溫度（溫度分別設(shè)定為51、53、55、57、59和61 ℃）、上下游引物濃度（終濃度分別取0.125、0.250、0.375、0.500、0.625和0.750 pmol/μL）以及循環(huán)數(shù)（分別設(shè)定為25、30、35和40個(gè)循環(huán)）進(jìn)行優(yōu)化。其他反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，退火20 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增相應(yīng)循環(huán)數(shù)；72 ℃延伸5 min。

1.6 特異性試驗(yàn)

分別以ASFVVP72基因部分序列以及PCV2、PCV3、PRV、PPV基因組DNA為模板，以ddH2O為陰性對照，對建立的三重PCR方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.7 敏感性試驗(yàn)

根據(jù)質(zhì)粒拷貝數(shù)計(jì)算公式（質(zhì)粒質(zhì)量濃度×9.12×1020/質(zhì)粒堿基數(shù)），分別計(jì)算3種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品等比例混合，以10倍倍比稀釋至1×108～1×100copies/μL的梯度區(qū)間，按上述已優(yōu)化的三重PCR方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)選取同一拷貝數(shù)濃度的3種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，將其等比例混合，確定終濃度為1×105copies/μL，連續(xù)進(jìn)行多次重復(fù)性檢測，對所建立的三重PCR方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

使用設(shè)計(jì)的上下游引物分別擴(kuò)增出目的片段，并將其克隆至pMD19-T載體，測序后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增序列與所選區(qū)域基因序列完全一致，表明3種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品成功構(gòu)建。使用微量紫外分光光度計(jì)，測得3種陽性質(zhì)粒質(zhì)量濃度分別為174.23、214.67、153.89 ng/μL。

2.2 退火溫度優(yōu)化

退火溫度優(yōu)化結(jié)果（圖1）顯示：6個(gè)退火溫度均可擴(kuò)增得到清晰的、符合目的片段大小的條帶；除在51 ℃時(shí)可擴(kuò)增出1條小于100 bp的雜帶外，其他退火溫度下均未見明顯雜帶；在61℃時(shí)，擴(kuò)增所得的3條目的條帶相比于其他退火溫度亮度更高，提示在該溫度下擴(kuò)增所得的產(chǎn)物濃度最大，因此選取61 ℃作為最佳退火溫度。

2.3 引物濃度優(yōu)化

在20 μL的三重PCR反應(yīng)體系中，固定退火溫度為61 ℃，對引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果（圖2）顯示，所有待測濃度的引物均可擴(kuò)增出單一的目的條帶，且未見明顯雜帶；當(dāng)引物濃度為0.375 pmol/μL時(shí)，對ASFV、PCV2和PCV3擴(kuò)增出的條帶亮度最高，因此引物最佳終濃度確定為0.375 pmol/μL。

2.4 循環(huán)數(shù)優(yōu)化

在退火溫度61 ℃和引物終濃度0.375 pmol/μL的基礎(chǔ)上，建立20 μL的三重PCR反應(yīng)體系，對擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果（圖3）顯示，當(dāng)循環(huán)數(shù)為35或40時(shí)，擴(kuò)增所得條帶最為清晰明亮，且無雜帶產(chǎn)生，可對3種擴(kuò)增片段進(jìn)行有效區(qū)分。由于擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為35時(shí)，整體所需的反應(yīng)時(shí)間更短，因此確定最佳循環(huán)數(shù)為35。

2.5 特異性試驗(yàn)

采用建立的三重PCR方法對ASFV、PCV2、PCV3、PRV和PPV基因組DNA進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法的特異性。結(jié)果（圖4）顯示，ASFV、PCV2和PCV3 DNA混合樣品及單一樣品均可擴(kuò)增出與目的片段大小符合的單一條帶，而PRV與PPV DNA樣品均未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。結(jié)果表明，所建立的三重PCR方法與PPV和PRV不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。

2.6 敏感性試驗(yàn)

分別將ASFV、PCV2和PCV3重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，使其終濃度梯度為1×108～1×100copies/μL，然后進(jìn)行單重PCR檢測。結(jié)果（圖5-A、B、C）顯示，ASFV、PCV2和PCV3重組質(zhì)粒的檢出下限均為1×104copies/μL。將3種重組質(zhì)粒等比例混合后，以10倍倍比稀釋至終濃度梯度為1×108～1×100copies/μL，進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示（圖5-D），3者混合后的檢出下限為1×104copies/μL。

圖5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

將終濃度均為1×107copies/μL的3種重組質(zhì)?；旌虾笞鳛槟０?，其他反應(yīng)條件不變，進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增檢測。結(jié)果（圖6）顯示，5次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致，均能擴(kuò)增出與目的片段大小相同的單一條帶，表明本方法具有良好的重復(fù)性。

圖6 三重PCR重復(fù)性試驗(yàn)

3 討論

2018年非洲豬瘟傳入我國，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大打擊。在近5年時(shí)間里，研究人員及一線工作者不斷探索與實(shí)踐，總結(jié)出一套較為行之有效的防控方案，而這其中，實(shí)驗(yàn)室檢測是最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。2020年以來，ASFV毒株多樣性不斷增加，部分地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)基因I型毒株以及基因Ⅱ型變異毒株和重組毒株。新型毒株的毒力明顯減弱，潛伏期變長，臨床感染豬的癥狀也愈發(fā)不明顯，這使非洲豬瘟防控面臨著更加嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[5-6]。

豬傳染性疾病的多重感染和混合感染已經(jīng)成為當(dāng)前疫病的主要流行形式。夏道倫[7]研究顯示，80%以上的發(fā)病豬均存在2種及以上病原體混合感染，這也導(dǎo)致了病豬臨床癥狀的復(fù)雜化。當(dāng)前豬場中PCV2和PCV3流行十分普遍，其對豬的致死率很低，但可引起感染豬的免疫功能抑制。因此，PCV與其他病原的混合感染一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)的重要難題，而建立一種快速、高效且成本低廉的檢測方法十分必要[8]。

PCR檢測方法憑借其特異性強(qiáng)、敏感性高以及成本低廉等綜合優(yōu)點(diǎn)，在生產(chǎn)一線的病原學(xué)檢測中一直發(fā)揮著重要作用。目前針對ASFV和PCV的PCR檢測技術(shù)研究已有諸多報(bào)道。早在20世紀(jì)90年代初，Steiger等[9]就建立了ASFV的PCR檢測方法，可對細(xì)胞、脾臟以及血液中的ASFV進(jìn)行檢測。近年來，李云燦等[10]和曾少靈等[11]分別針對ASFVVP72和VP73基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了相應(yīng)PCR檢測方法，且建立的方法具有良好的特異性和敏感性。此外，分別針對PCV2、PCV3和PCV4的PCR檢測方法也已成功建立。但是，普通PCR方法僅可對單一病原進(jìn)行檢測，而多重PCR方法通過在同一反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，可同時(shí)檢測多種病原，在病原混合感染的大背景下具有更廣闊的應(yīng)用前景。分別針對ASFV和PCV的多重PCR檢測方法也有諸多報(bào)道，如王瑩等[12]建立了可同時(shí)檢測ASFV、尼帕病毒（NiV）、豬水皰病病毒（SVDV）以及口蹄疫病毒（FMDV）的多重PCR檢測方法。分別針對PCV2與PCV3、PCV2與PCV4以及PCV3與PCV4的雙重PCR鑒別檢測方法也已建立，而針對PCV2、PCV3和PCV4的三重PCR檢測方法也已得到應(yīng)用[13]。

本研究采用了基于TaqDNA聚合酶的2×PCR Mix反應(yīng)體系，其中包含了除引物和擴(kuò)增模板之外PCR反應(yīng)所需的所有材料，僅需要對引物濃度、退火溫度以及擴(kuò)增循環(huán)數(shù)等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，大大簡化了試驗(yàn)操作。在優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，引物濃度是影響多重PCR擴(kuò)增結(jié)果的關(guān)鍵因素，這與其他學(xué)者研究[14-15]結(jié)論一致。多重PCR試驗(yàn)的成敗與特異性引物的設(shè)計(jì)密切相關(guān)，所擴(kuò)增的不同病毒目的片段大小要易于區(qū)分，且退火溫度要相近。本試驗(yàn)中，設(shè)計(jì)的3對特異性引物的退火溫度相近，在61 ℃時(shí)可同時(shí)擴(kuò)增出3種病原的單一目的條帶，且擴(kuò)增的3種基因片段大小分別為873、530和217 bp，差異明顯易區(qū)分。以構(gòu)建的10倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，檢驗(yàn)所建立的三重PCR方法的敏感性，發(fā)現(xiàn)該方法對ASFV、PCV2和PCV3的檢出下限均為1×104copies/μL，這也與其他多重PCR檢測方法的靈敏度相似[16]。特異性檢測結(jié)果顯示，本研究所建立的方法與豬場常見病原PRV和PPV均不能產(chǎn)生交叉反應(yīng)，證明其具有良好的特異性。并且，該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，這為豬場ASFV和PCV感染的監(jiān)測與防控提供了可靠的技術(shù)手段。