UPLC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定地膽草中黃酮類成分含量*

雒江菡

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江哈爾濱 150076）

地膽草（Elehantopus scaber Linn） 為菊科（Compositae）地膽草屬植物，別名苦地膽、土公英等，廣泛分布在廣東、廣西、貴州、云南等地，含有黃酮類、倍半萜內(nèi)酯類、三萜類、甾醇類以及有機(jī)酸類等有效成分，可用于治療風(fēng)熱感冒、扁桃體炎、咳嗽等癥[1-3]。黃酮類化合物是地膽草的重要活性成分，目前，對(duì)其質(zhì)量分析及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究鮮有報(bào)道[4]。21 世紀(jì)初，高效液相色譜、氣相色譜等分離技術(shù)以及紫外光譜、質(zhì)譜等檢測(cè)技術(shù)已普遍用于化學(xué)物質(zhì)和活性成分分析等方面[5]。近年來，由于液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS）聯(lián)用新技術(shù)的不斷出現(xiàn)，LC-MS/MS 已成為現(xiàn)代分析手段中必不可少的組成部分[6-8]。本實(shí)驗(yàn)以地膽草為原料，采用醇提法進(jìn)行總黃酮的提取，利用大孔樹脂純化和薄層色譜法進(jìn)行初步鑒定，采用液質(zhì)聯(lián)用手段進(jìn)行化學(xué)成分的定量和定性分析，可為地膽草的綜合開發(fā)利用及藥效物質(zhì)的篩選提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Q-trap 4500 型串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB 公司）；舒美牌KQ-250DE 型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；T6 型新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)（北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司）。

木犀草素、山奈酚、兒茶素、芹菜素、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（合肥博美生物科技有限公司）；甲酸、乙腈，色譜純，美國(guó)MERCK 試劑有限公司；硅膠薄層預(yù)制板（青島海洋化工有限公司）；地膽草（北京同仁堂）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 地膽草總黃酮樣品液制備 精密稱取地膽草粉末（過20 目篩）50g，置冷凝回流裝置中，加入80%乙醇500mL，80℃加熱回流2h，取出放冷，抽濾，將濾液濃縮、干燥，用甲醇溶解、定容至50mL，用0.45μm微孔濾膜濾過，備用。

1.2.2 薄層色譜條件 使用甲醇將木犀草素、山奈酚、兒茶素、芹菜素、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為0.5mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液，備用。

將高效硅膠G 薄層板在105℃烘箱活化1h，用毛細(xì)管分別將地膽草總黃酮樣品液、木犀草素、山奈酚、兒茶素、芹菜素、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在距硅膠板下沿1cm 處點(diǎn)樣，選擇不同比例的乙酸丁酯-甲醇-水-甲酸為展開劑，將點(diǎn)樣后的硅膠板置于展開劑中，當(dāng)展開劑離硅膠板的上緣大約1cm 時(shí)，取出硅膠板，用吹風(fēng)機(jī)吹干，在紫外燈下（365nm）觀察不同樣品的遷移距離，做好標(biāo)記，測(cè)量并計(jì)算相對(duì)遷移率（Rf）值[9]。

1.2.3 高效液相混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的配制 分別將木犀草素、山奈酚、兒茶素、芹菜素、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈配制成1mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃避光冷藏保存。臨用時(shí)，用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水（15∶85，V/V）溶液逐級(jí)稀釋木犀草素、山奈酚、兒茶素、芹菜素、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作液按實(shí)驗(yàn)需要用流動(dòng)相稀釋相應(yīng)質(zhì)量濃度[10]。

1.2.4 UPLC-MS/MS 檢測(cè)方法

1.2.4.1 色譜檢測(cè) 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C181.7μm，2.1mm×50mm；

流動(dòng)相：A 為1%甲酸的水溶液，B 為1%甲酸的乙腈溶液；流速為0.2mL·min-1；梯度洗脫程序見表1；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為1μL。

表1 UPLC-MS/MS 梯度洗脫方法Tab.1 UPLC-MS/MS gradient elution methods

1.2.4.2 質(zhì)譜檢測(cè) 電噴霧離子源；正離子掃描；離子化電壓（IS）5500V；去溶劑氣溫度（TEM）500℃；噴霧氣（GS1）55psi；輔助加熱器（GS2）55psi；噴撞氣（CAD）Medium；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)方法Tab.2 Multiple reaction monitoring（MRM）methods of mass spectrometry

2 結(jié)果與討論

2.1 薄層色譜初步鑒定

根據(jù)樣品的揮發(fā)性、極性及溶解度等因素，篩選展開劑的種類和比例。為了使地膽草黃酮類活性成份能夠在高效硅膠G 層析板上充分展開，就需要選取對(duì)活性成分溶解性好的展開劑。經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終選擇兩種溶劑極性相差較大、對(duì)活性成分溶解度較高、按不同配制比例的體系作為展開劑，分別為1a（乙酸乙酯-甲醇-甲酸=7∶1.8∶1）、1b（乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸=5.5∶2∶1∶1），利用這兩種體系作為展開劑進(jìn)行薄層層析，結(jié)果見圖1。

圖1 薄層層析結(jié)果Fig.1 Results of thin layer chromatography

由圖1 可見，粗提液在兩個(gè)展開系統(tǒng)中分出了5 個(gè)斑點(diǎn)，相對(duì)遷移率分別為0.74、0.83、0.90、0.87、0.79，依次與芹菜素、山奈酚、兒茶素、木犀草素、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品色譜在相應(yīng)位置上呈現(xiàn)相同的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)分離明顯，薄層色譜行為良好。

2.2 UPLC-MS/MS 檢測(cè)方法評(píng)估

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的檢測(cè) 分別用針泵以7μL·min-1的流速注入0.1mg·L-1木犀草素、山奈酚、兒茶素、芹菜素、蘆丁，在ESI 正離子模式下對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，確定木犀草素、山奈酚、兒茶素、芹菜素、蘆丁的母離子、定量離子、定性離子。優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數(shù)，采用優(yōu)化后的參數(shù)對(duì)木犀草素、山奈酚、兒茶素、芹菜素、蘆丁標(biāo)樣進(jìn)行檢測(cè)后，多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）圖譜見圖2（a～e）。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)檢測(cè)色譜Fig.2 Multiple reaction detection chromatography of standards

由圖2（a～e）可見，5 種標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間分別為4.31、4.58、2.39、4.53、3.59min，因此，能夠被分別檢測(cè)出來。

2.2.2 線性方程、線性范圍和檢出限 配制一系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析[12]，由實(shí)驗(yàn)得出的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表3。采用空白樣品中添加目標(biāo)化合物的方法，按樣品前處理方法進(jìn)行處理和檢測(cè)，以3 倍信噪比為方法檢出限（MDL），以10倍信噪比為方法定量限（LOQ），檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 方法的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Tab.3 Linear equation, linear range, correlation coefficient, MDL and LOQ of the method

由表3 可見，5 種黃酮類物質(zhì)相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99 以上，檢出限為10.0～40.0μg·kg-1，定量限為30.0～120.0μg·kg-1，檢出限和定量限較小，能夠滿足地膽草中黃酮類化合物的檢測(cè)。

2.2.3 回收率和精密度測(cè)定結(jié)果 為了提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確率，將制備的地膽草總黃酮樣品液分成3 份平行樣，添加不同水平的木犀草素、山奈酚、兒茶素、芹菜素、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其回收率、精密度結(jié)果見表4。

表4 地膽草中黃酮類化合物各組分回收率與精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of recovery and precision for 6 replicate determinations in flavonoids from Elephantopus scaber（n=6）

木犀草素的加標(biāo)回收率為92.6%～97.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～4.4%；山奈酚的平均加標(biāo)回收率為90.1%～98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～4.3%；兒茶素的加標(biāo)回收率為91.2%～96.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～5.4%；芹菜素的加標(biāo)回收率為90.3%～95.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～4.8%；蘆丁的平均加標(biāo)回收率為93.3%～98.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～3.3%，由此可以看出，回收率和精密度較高，適合地膽草黃酮類化合物的檢測(cè)。

由圖2（a～e）和表3、4 可以看出，在1.2.4 操作條件下，木犀草素、山奈酚、兒茶素、芹菜素、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物保留時(shí)間有一定差異，回歸方程的相關(guān)系數(shù)較高，檢出限和定量限較低，回收率和精密度較高，因此，通過評(píng)估可以看出，1.2.4 的檢測(cè)方法能夠用于實(shí)際樣品中上述5 種黃酮的含量檢測(cè)。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用已建立的方法對(duì)地膽草提取液中黃酮類化合物進(jìn)行了分析測(cè)定，物種樣品中均含有木犀草素、山奈酚、兒茶素、芹菜素、蘆丁5 種化合物，其平均含量（g·kg-1）分別為：木犀草素8.75g·kg-1、山奈酚0.86g·kg-1、兒茶素4.29g·kg-1、芹菜素2.43g·kg-1、蘆丁10.71g·kg-1。由此可以看出，地膽草中黃酮類化合物種類豐富，其中，蘆丁含量較高，山奈酚含量較低。

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定地膽草中5 種黃酮類成分的含量，結(jié)果顯示，地膽草中不同黃酮類成分含量差異較大，表現(xiàn)為蘆丁＞木犀草素＞兒茶素＞芹菜素＞山奈酚。該方法可快速富集其中微量的黃酮類化合物，并能夠準(zhǔn)確測(cè)定其含量，此研究方法可有效提高目標(biāo)成分的分離度，消除雜質(zhì)的干擾，靈敏度高，且方法簡(jiǎn)便，溶劑使用量少，檢驗(yàn)成本較低，適用性強(qiáng)，可為建立地膽草中黃酮類成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。