響應(yīng)面法優(yōu)化黃精活性成分的提取工藝*

沈良洪，翟欣欣，李鵬飛，郭信東

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥民族藥資源研究院，貴州貴陽 550025）

黃精（Polygonati rhizoma）為百合科黃精屬植物，其根莖可入藥，為“藥食同源”中藥，具有極高的開發(fā)使用價(jià)值，主要用于脾胃氣虛、體倦乏力、胃陰不足、口干食少、肺虛燥咳、勞嗽咳血、精血不足、腰膝酸軟、須發(fā)早白、內(nèi)熱消渴等癥狀[1，2]。黃精的化學(xué)成分豐富，主要含有多糖、皂苷、黃酮、多酚等活性成分，具有降血糖、抗病毒、抗腫瘤、提高免疫力、抗衰老、抑制炎癥因子等功效[3，4]。

黃精在藥品、保健品等領(lǐng)域用途廣泛，市場(chǎng)需求量呈逐年上升趨勢(shì)。隨著野生黃精的過度采挖，種植黃精呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)[5，6]。2020 年貴州省黃精累計(jì)種植面積達(dá)16.36 萬畝，同比增長(zhǎng)84.82%；當(dāng)年產(chǎn)量為2.67 萬t，同比增長(zhǎng)89.73%；當(dāng)年產(chǎn)值為4.65 億元，同比增長(zhǎng)139.80 %，其中，天柱縣是貴州省最大的黃精種苗培育基地，2022 年全縣已種植6000 余畝，綜合產(chǎn)值超過3300 萬元[7]。雖然黃精的規(guī)范化種植已深入人心，但系統(tǒng)優(yōu)化其活性成分提取工藝的研究仍未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選擇黃精多糖、皂苷、黃酮、多酚進(jìn)行了單因素篩選，并在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法系統(tǒng)優(yōu)化黃精活性成分提取工藝，得到了優(yōu)化的黃精活性成分提取方法，以期為中藥黃精的合理開發(fā)使用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與藥材

UV-2700 型紫外可見分光光度計(jì)（島津儀器蘇州有限公司）；SB25-12DTD 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；EL104 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

葡萄糖對(duì)照品（批號(hào):DKW1-3099）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào): 110704-201122），中國食品藥品檢定研究院；蘆丁對(duì)照品（批號(hào):0080-9705 中國藥品生物制品檢定所）；沒食子酸對(duì)照品（批號(hào):AF20050701 成都埃法生物科技有限公司）；蒽酮（批號(hào): 20191024）、濃H2SO4（批號(hào): 20210901）、HClO4（批號(hào): 20170113）、苯（批號(hào): 20111017），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸（批號(hào): 20180501）、乙酸乙酯（批號(hào): 2101041）、正丁醇（批號(hào): 2104041），上海申博化工有限公司；甲醇（批號(hào): 20220528 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（批號(hào):20220401）、石油醚（批號(hào): 20200601），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；以上試劑均為分析純。

黃精購于四川鑫仁泰藥業(yè)有限責(zé)任公司（批號(hào):202001，生品1）和安順市西秀區(qū)鈺霖種養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社（批號(hào):20210401，生品2）。

炮制品黃精 酒黃精購于安徽尚德中藥飲片有限公司（批號(hào): 200202，炮制品1）；酒黃精購于貴州同源中藥發(fā)展有限公司（批號(hào):180401，炮制品2）；酒黃精購于上海萬仕誠藥業(yè)有限公司（批號(hào): 200207-1，炮制品3）；酒黃精購于重慶眾景中藥飲片有限責(zé)任公司（批號(hào):191120，炮制品4）。

1.2 方法

1.2.1 供試品的制備 取黃精飲片，60℃烘干，粉碎后過6 號(hào)篩，精密稱定5g 置于150mL 錐形瓶中，加入70%乙醇50mL，溫度設(shè)置為25～70℃，超聲時(shí)間為10～60min，超聲頻率為16～36kHz，料液比（g∶mL）為1∶5～1∶20，總計(jì)20 份供試品提取過濾后，用70 %乙醇定容至100mL 容量瓶中備用。

1.2.2 黃精多糖、皂苷、黃酮和多酚的分離 取供試品溶液80mL 置于蒸發(fā)皿中水浴蒸去乙醇，加入10mL 熱水后，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，依次使用石油醚、苯、乙酸乙酯、正丁醇4 種溶劑分3 次萃取，每次20mL。石油醚去除葉綠素等脂溶性成分后，分別得到黃精總酚、總黃酮、總皂苷以及水層中總多糖組分，將4 個(gè)組分分別轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中水浴蒸干。使用甲醇溶解黃精總酚、總黃酮并定容至5mL 容量瓶中；甲醇溶解黃精總皂苷定容至50mL 容量瓶中，取其中1mL 稀釋液轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶中；使用熱水溶解黃精多糖定容至100mL 容量瓶中，取1mL 多糖溶液稀釋至50mL 容量瓶中，搖勻即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 建立含量測(cè)定方法

分別以葡萄糖、人參皂苷Rb1、蘆丁、沒食子酸配置對(duì)照品溶液，選擇蒽酮-硫酸比色法、香草醛-冰醋酸比色法、福林酚比色法和三氯化鋁-醋酸-醋酸鈉比色法分別顯色并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[8-12]（詳見表1）。

表1 對(duì)照品線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab.1 Result of reference standard curve table,correlation coefficient and linear range

精密量取黃精多糖組分0.25mL、黃精皂苷組分1mL，分別以水和甲醇為空白對(duì)照，使用蒽酮-硫酸比色法和香草醛-冰醋酸比色法測(cè)定總多糖和總皂苷含量；精密量取多酚組分和黃酮組分各1.5mL 置于25mL 和10mL 容量瓶中，均以甲醇為空白對(duì)照，分別使用福林酚比色法和三氯化鋁-醋酸-醋酸鈉比色法測(cè)定總酚和總黃酮的含量。

由表1 可見，建立的黃精4 類成分含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可靠、線性范圍廣，可應(yīng)用于黃精中多糖、皂苷、多酚及黃酮類成分的含量計(jì)算。同時(shí)，為黃精中活性成分的提取工藝優(yōu)化及其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.2 單因素考察

本實(shí)驗(yàn)選取影響提取效率的4 個(gè)主要因素進(jìn)行研究，分別為超聲時(shí)間，超聲溫度、超聲頻率和液料比。單因素考察結(jié)果見圖1。

由圖1 可見，黃精多糖、皂苷、總酚和黃酮類成分的提取時(shí)長(zhǎng)設(shè)置在10～50min 內(nèi)能夠得到最大的提取率。4 類成分在31～54℃之間存在最適超聲溫度；在24～32kHz 之間存在最優(yōu)的超聲頻率；料液比設(shè)置在1∶5～1∶15 之間存在最佳的吸光度。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

2.3.1 基于中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化液料比和超聲頻率根據(jù)單因素考察結(jié)果，選擇超聲頻率（C）、液料比（D）為自變量，以總多糖、總皂苷、總黃酮和總酚為響應(yīng)值進(jìn)行兩因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化（見表2），根據(jù)中心組成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理以超聲頻率（kHz）24.00、28.00、32.00 和液料比（mL∶g）5.00、10.00、15.00 代替編碼水平設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果見表3。對(duì)13 次正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)活性成分含量較高且相近，距離中心點(diǎn)較遠(yuǎn)的活性成分含量較低，說明中心組成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)集中，能夠得出較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab.2 Factor level table for orthogonal experimental design

表3 正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Tab.3 Orthogonal test and results

2.3.2 以總黃酮為例對(duì)建立的回歸模型進(jìn)行方差分析 經(jīng)Design expert 8.0.6 對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析后，以總黃酮為例進(jìn)行方差分析（詳見表4），建立模型P值＜0.01 具有極顯著性，失擬項(xiàng)P值＞0.05 不顯著,表明所建立模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合情況良好；且D、CD、C2和D2對(duì)總黃酮提取有極顯著影響（P值＜0.01），同時(shí)可以體現(xiàn)兩因素對(duì)總黃酮提取的影響大小為:液料比＞超聲頻率。

表4 總黃酮響應(yīng)面回歸模型方差分析結(jié)果Tab.4 Results of analysis of variance with total flavonoids response surface regression model

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析 總多糖、總皂苷、總黃酮和總酚響應(yīng)面交互作用分析見圖2。由圖2（A）可見，黃精多糖響應(yīng)面三維立體圖比黃精皂苷、黃酮和多酚響應(yīng)面三維立體圖弧度小，表明黃精多糖受液料比和超聲頻率影響較小。圖2（B）、2（C）和2（D）的響應(yīng)面三維立體圖弧度較大，表明黃精皂苷、黃酮和多酚受液料比和超聲頻率影響較大。綜合圖2 可知，液料比對(duì)黃精活性成分的提取率較超聲頻率影響更顯著。同時(shí)，4 類成分均隨液料比和超聲頻率的增加先增加后減小, 反映出上述建立的模型對(duì)于黃精活性成分提取存在正向最優(yōu)值，表明該模型交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖2 吸光度隨液料比和超聲頻率的變化情況Fig.2 Absorbance changes with liquid-solid ratio and ultrasonic frequency

2.3.4 提取參數(shù)的確定 經(jīng)Design Expert 8.0.5 對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合分析，得出優(yōu)化后的4 類成分的提取參數(shù): 黃精多糖超聲頻率和液料比分別為24.00kHz 和10.35；黃精皂苷超聲頻率和液料比分別為27.60kHz 和12.44；黃精黃酮超聲頻率和液料比分別為28.40kHz 和10.71；黃精多酚超聲頻率和液料比為28.00kHz 和10.84。綜合考慮4 類成分的提取工藝后確定最終提取參數(shù)為：超聲頻率為24.80kHz，液料比為10.62。

2.5 優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證

隨機(jī)選取6 批次黃精樣品，將優(yōu)化的提取工藝應(yīng)用于黃精藥材和黃精炮制品中，按1.2、2.1 和2.3項(xiàng)下方法提取并測(cè)定黃精中多糖、皂苷、多酚和黃酮的含量，結(jié)果見表5。

由表5 可見，通過對(duì)6 批次黃精樣品響應(yīng)面優(yōu)化、單因素優(yōu)化、未優(yōu)化提取工藝比較發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)面法優(yōu)化的黃精提取工藝較單因素優(yōu)化的黃精提取工藝具有較大提升；而單因素優(yōu)化的黃精提取工藝較未優(yōu)化的提取工藝也具有較大提升。

圖3 為生品1 在未優(yōu)化時(shí)、單因素優(yōu)化后和響應(yīng)面法優(yōu)化后4 類成分的含量對(duì)比圖。圖3（A）是以黃精多糖和皂苷成分為橫坐標(biāo)，以每g 生品1 中檢測(cè)出多糖和皂苷的含量為縱坐標(biāo)建立的柱狀圖。圖3（B）是以黃精多酚和黃酮成分為橫坐標(biāo)，以每g 生品1 中檢測(cè)出多酚和黃酮的含量為縱坐標(biāo)建立的柱狀圖。

圖3 不同提取方法對(duì)生品1 中4 類成分提取率的影響Fig.3 Effect of different extraction methods on extraction rate of 4 components in raw 1

由圖3 可見，響應(yīng)面法優(yōu)化后的黃精多糖提取率較單因素法優(yōu)化黃精多糖提取率提升了1.51 倍，較未優(yōu)化時(shí)增加了11.07 倍；響應(yīng)面法優(yōu)化后的黃精皂苷提取率較單因素法優(yōu)化后的黃精提取率提升了3.65 倍，較未優(yōu)化時(shí)增加了5.94 倍；響應(yīng)面法優(yōu)化后的黃精多酚提取率較單因素法優(yōu)化后的黃精提取率提升了2.03 倍，較未優(yōu)化時(shí)增加了4.74 倍；響應(yīng)面法優(yōu)化后的黃精黃酮提取率較單因素法優(yōu)化后的黃精提取率提升了1.89，較未優(yōu)化時(shí)增加了2.05 倍。從而驗(yàn)證了響應(yīng)面優(yōu)化黃精提取率＞單因素優(yōu)化黃精提取率＞未優(yōu)化的黃精提取率。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以黃精多糖、皂苷、多酚和黃酮為研究對(duì)象，運(yùn)用單因素篩選、響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)，結(jié)合黃精中4 類活性成分的提取率，確定提取的超聲頻率為24.80kHz，料液比為1∶10.62，此時(shí)，黃精活性成分的提取率達(dá)到最佳。

將建立的提取工藝應(yīng)用于黃精藥材，發(fā)現(xiàn)實(shí)際值與預(yù)期值無顯著差異。同時(shí)，擴(kuò)大優(yōu)化工藝應(yīng)用于炮制品黃精及其他黃精飲片。結(jié)果顯示，響應(yīng)面法比單因素考察優(yōu)化效果理想，提取效率顯著增加。同時(shí)，擴(kuò)大應(yīng)用范圍至4 批次炮制品黃精后，黃精活性成分的提取率得到了較大的提升。由此可知，建立的優(yōu)化工藝模型可靠穩(wěn)定、適用范圍廣。同時(shí)，可為中藥黃精的開發(fā)及合理利用提供理論支持。此外，本文建立模型的思路還可為其他中藥材的開發(fā)提供指導(dǎo)性意見。