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    lncRNA NEAT1 促進(jìn)膿毒癥誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究

    2023-12-15 01:45:04曹紀(jì)玲胡志青
    局解手術(shù)學(xué)雜志 2023年12期
    關(guān)鍵詞:熒光素酶膿毒癥外周血

    曹紀(jì)玲,孫 堅(jiān),吳 勇,胡志青

    (1. 南京江北醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室,江蘇 南京 210048;2. 南京江北醫(yī)院急診醫(yī)學(xué),江蘇 南京210048;3. 南京江北醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué),江蘇 南京 210048)

    膿毒癥是由感染引起的致命性疾病,可誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory reaction syndrome,SIRS)。目前,膿毒癥患者的病死率為25%~30%[1-2],但尚無(wú)特異且有效的膿毒癥相關(guān)肝損傷的治療干預(yù)措施[3]。因此,深入研究膿毒癥的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

    miRNA 是一大類(lèi)短鏈非編碼RNA 分子,其靶向mRNA 并抑制基因的翻譯。miRNA 參與許多生物學(xué)過(guò)程,包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡等。膿毒癥患者存在miRNA 水平失調(diào)或差異性表達(dá)[4]。有研究表明,miR-129-5p 可以減輕膿毒癥引起的肺損傷[5]。然而,炎癥條件下miR-129-5p 是否在膿毒癥引起的肝損傷中起關(guān)鍵作用目前尚不清楚。lncRNA 是長(zhǎng)度超過(guò)200 nt 的非編碼RNA,參與多個(gè)生物過(guò)程。lncRNA 和miRNA 可以相互結(jié)合,進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。lncRNA 核旁斑組裝轉(zhuǎn)錄本1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其過(guò)表達(dá)與癌癥患者的不良預(yù)后有關(guān)[6]。此外,lncRNA NEAT1 在膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷患者中明顯上調(diào),其上調(diào)與膿毒癥患者急性腎損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)[7]。然而,lncRNA NEAT1 在膿毒癥引起的肝損傷中的作用仍不清楚。

    本研究通過(guò)分析lncRNA NEAT1 對(duì)miR-129-5p 及其預(yù)測(cè)的靶基因Toll樣受體4(Toll-like receptor 4 gene,TLR4)的調(diào)控作用,探討膿毒癥誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 臨床標(biāo)本

    收集我院重癥監(jiān)護(hù)室15 例膿毒癥致肝損傷患者的外周血和體檢的15例健康者的外周血,分別設(shè)為膿毒癥組和健康組。根據(jù)《赫爾辛基宣言》,本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)(2021046),每個(gè)受試者均簽署對(duì)本研究的知情同意書(shū)。

    1.2 NCTC1469細(xì)胞培養(yǎng)

    小鼠正常肝細(xì)胞NCTC1469 購(gòu)于武漢普諾賽生命科學(xué)有限公司。將NCTC1469 細(xì)胞置于含2 mmol/L 谷氨酰胺的無(wú)血清RPMI 1640 培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco 公司)中,并在37 °C、5%CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

    NCTC1469 細(xì)胞用100 mmol/L 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)單獨(dú)刺激24 h,建立體外膿毒癥模型,待細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)顯著上調(diào),表明LPS 誘導(dǎo)的體外模型成功建立,將其設(shè)為L(zhǎng)PS 組。將未處理的NCTC1469細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。

    轉(zhuǎn)染前將NCTC1469細(xì)胞接種于12孔板中培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%~90%時(shí),使用Lipofectamine 2000試劑(美國(guó)Invitrogen 公司)轉(zhuǎn)染6 h 后,更換培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞和細(xì)胞上清,用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。單獨(dú)轉(zhuǎn)染mimic NC、mimic、inhibitor NC、inhibitor 質(zhì)粒載體(上海吉瑪公司)的NCTC1469細(xì)胞分別設(shè)為mimic NC組、mimic組、inhibitor NC組、inhibitor組。

    另外,當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%~90% 時(shí),使用Lipofectamine 2000 試劑轉(zhuǎn)染6 h 后更換培養(yǎng)基,用100 mmol/L LPS 刺激細(xì)胞24 h,或者LPS 聯(lián)合45 mg/L TLR4重組蛋白(英國(guó)Abcam 公司)刺激細(xì)胞24 h,收集細(xì)胞和細(xì)胞上清,用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將LPS刺激下轉(zhuǎn)染mimic NC、mimic、siNC、siNEAT1 質(zhì)粒載體的細(xì)胞分別設(shè)為L(zhǎng)PS+mimic NC 組、LPS+mimic 組、LPS+siNC 組和LPS+siNEAT1 組,將LPS、siNEAT1、TLR4 重組蛋白聯(lián)合處理的細(xì)胞設(shè)為L(zhǎng)PS+siNEAT1+TLR4 組,將LPS、mimic、TLR4 重組蛋白聯(lián)合處理的細(xì)胞設(shè)為L(zhǎng)PS+mimic+TLR4組。

    1.4 RNA提取和qPCR分析

    將健康組、膿毒癥組的外周血及處理好的NCTC1469細(xì)胞置于冰上,加入TRIzol試劑(美國(guó)ThermoFisher 公司)裂解5~10 min,將液體排入EP 離心管,加入1/5 體積的氯仿;液體混合后在4 ℃下放置10~15 min,隨后離心15 min;取出400~500 μL上清液并放入新的EP 管中。加入等體積的異丙醇,在4 ℃下孵育10 min,然后以12 000 r/min 離心10 min。所得顆粒用75%乙醇洗滌,干燥后加入50 μL DEPC水完全溶解顆粒,然后于-80 ℃下儲(chǔ)存。根據(jù)說(shuō)明書(shū),用TRIzol 試劑提取血液或細(xì)胞總RNA。在溴化乙錠染色的1%瓊脂糖凝膠上電泳確認(rèn)RNA的完整性。使用PrimeScriptTMRT 試劑盒(日本Takara 公司)逆轉(zhuǎn)錄1 μg 總RNA。用于擴(kuò)增的引物序列見(jiàn)表1。GAPDH 用于內(nèi)參基因。

    表1 引物序列

    1.5 Western blot

    使用RIPA裂解緩沖液制備用于裂解的全細(xì)胞裂解物,然后在SDS-PAGE凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用TLR4、GAPDH一抗和適當(dāng)?shù)睦备^(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗進(jìn)行蛋白免疫印跡分析,然后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白表達(dá),并使用光密度測(cè)定法進(jìn)行量化。

    1.6 ELISA法

    NCTC1469 細(xì)胞在96 孔板中用含10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng),以5 000個(gè)/孔的密度在37 °C、5%CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCTC1469 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。分離外周血血清后,按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)外周血中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

    1.7 5'-脫氧朊啶核苷酸末端標(biāo)記(TdT-mediatedd UTP Nick-End Labeling,TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

    各組NCTC1469 細(xì)胞用PBS 洗滌,然后用4%多聚甲醛固定。實(shí)驗(yàn)根據(jù)TUNEL 試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞視為凋亡。使用熒光顯微鏡(德國(guó)蔡司Axio Vert A1)獲得熒光圖像。顯微鏡下以TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

    1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

    將含預(yù)測(cè)的miR-129-5p 結(jié)合位點(diǎn)或相應(yīng)突變片段的lncRNA NEAT1/TLR4 基因片段克隆到pGL3 基本載體中。mimic 的寡核苷酸用于miR-129-5p 過(guò)表達(dá)。在轉(zhuǎn)染過(guò)程中,pGL3、miRNAoligos和pRL質(zhì)粒與Lipofectamine3000(美國(guó)ThermoFisherScientific 公司)以1∶3(DNA:Lipofectamine)的比例共轉(zhuǎn)染到NCTC1469 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后,使用測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)(美國(guó)普洛麥格公司)檢測(cè)海腎熒光素酶活性和螢火蟲(chóng)熒光素酶活性,計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性的比值。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    使用Graph Pad Prism 83.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析,LSD-t法分析兩兩比較的差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 lncRNA NEAT1、miR-129-5p、TLR4 和炎癥因子在膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷患者體內(nèi)的表達(dá)

    qPCR 結(jié)果顯示,與健康組相比,膿毒癥組外周血中l(wèi)ncRNA NEAT1和TLR4的表達(dá)明顯升高(P<0.05),而miR-129-5p的表達(dá)明顯降低(P<0.05),見(jiàn)圖1a。miR-129-5p表達(dá)與lncRNA NEAT1、TLR4 表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),lncRNA NEAT1 表達(dá)與TLR4 表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05),見(jiàn)圖1b。膿毒癥組外周血中TNF-α、IL-6 和IL-1β的表達(dá)比健康組分別高1.5、3.0、38.0倍(P<0.05),且ELISA獲得了類(lèi)似的結(jié)果(P<0.05),見(jiàn)圖1c、d。

    圖1 膿毒癥組和健康組外周血中l(wèi)ncRNA NEAT1、miR-129-5p、TLR4及炎癥因子的表達(dá)

    2.2 LPS 刺激下沉默lncRNA NEAT1 對(duì)miR-129-5p表達(dá)的影響

    與對(duì)照組比較,LPS 組lncRNA NEAT1 的表達(dá)增加,miR-129-5p 的表達(dá)減少(P<0.01);與LPS 組、LPS+siNC 組比較,LPS+siNEAT1 組中l(wèi)ncRNA NEAT1 的表達(dá)降低,miR-129-5p的表達(dá)增加(P<0.01),見(jiàn)圖2。

    圖2 LPS刺激下沉默lncRNA NEAT1對(duì)miR-129-5p的影響

    2.3 LPS 刺激下lncRNA NEAT1 通過(guò)調(diào)控TLR4 對(duì)肝細(xì)胞炎癥和凋亡的作用

    與對(duì)照組比較,LPS+siNC 組中TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P<0.05);與LPS+siNC 組比較,LPS+siNEAT1 組中TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05);與LPS+siNEAT1 組比較,LPS+siNEAT1+TLR4 組中TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖3a、b。與對(duì)照組比較,LPS+siNC 組中細(xì)胞凋亡率上調(diào)(P<0.05);與LPS+siNC 組比較,與LPS+siNEAT1 組中細(xì)胞凋亡率下調(diào)(P<0.05);LPS+siNEAT1 組比較,LPS+siNEAT1+TLR4 組中細(xì)胞凋亡率上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖3c。與對(duì)照組比較,LPS+siNC 組中TNF- α、IL-6 和IL-1β 的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05);與LPS+siNC 組比較,LPS+siNEAT1 組中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的表達(dá)均下調(diào)(P<0.05);與LPS+siNEAT1 組比較,LPS+siNEAT1+TLR4 組中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖3d、e。

    圖3 LPS通過(guò)上調(diào)lncRNA NEAT1促進(jìn)TLR4的表達(dá)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷

    2.4 lncRNA NEAT1/miR-129-5p 及miR-129-5p/TLR4的相互作用

    經(jīng)生物信息學(xué)軟件TargetScan 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),lncRNA NEAT1和miR-129-5p之間存在結(jié)合堿基區(qū)(圖4a)。雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示,在野生型(NEAT1-WT)中,與mimic NC 組比較,mimic 組的熒光素酶活性降低(P<0.05);在突變型(NEAT1-MUT)中,與mimic NC組比較,mimic組的熒光素酶活性變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖4a。miR-129-5p 與lncRNA NEAT1存在相互作用。qPCR分析顯示,siNEAT1沉默了lncRNA NEAT1 并增加了miR-129-5p 的表達(dá)(P<0.01),見(jiàn)圖4b、c。

    圖4 lncRNA NEAT1/miR-129-5p及miR-129-5p/TLR4的相互作用

    進(jìn)一步分析miR-129-5p 與TLR4 的相互作用。生物信息學(xué)軟件TargetScan 預(yù)測(cè)miR-129-5p 和TLR4 有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(圖4d)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,miR-129-5p 與TLR4 之間存在靶向關(guān)系。mimic明顯降低了TLR4野生型(WT)細(xì)胞的熒光素酶活性(P<0.01),而對(duì)TLR4 突變型(MUT)細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)影響(P>0.05),見(jiàn)圖4e。與mimic NC 組比較,mimic組中miR-129-5p的表達(dá)增加,TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05);與inhibitor NC 組比較,inhibitor 組中miR-129-5p 的表達(dá)下調(diào),TLR4 的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖4f~h。

    2.5 lncRNA NEAT1 通過(guò)miR-129-5p 靶向TLR4 調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

    qPCR 結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,LPS+mimic NC 組TNF-α、IL-6 和IL-1β 的mRNA 表達(dá)增加(P<0.05);與LPS+mimic NC 組比較,LPS+mimic 組TNF-α、IL-6 和IL-1β的mRNA表達(dá)降低(P<0.05);與LPS+mimic組比較,LPS+mimic+TLR4 組TNF-α、IL-6 和IL-1β 的mRNA表達(dá)增加(P<0.05),見(jiàn)圖5a~c。ELISA 實(shí)驗(yàn)所觀察到的TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)結(jié)果與qPCR 的結(jié)果相似(P<0.05),見(jiàn)圖5d~f。因此,TLR4 作為miR-129-5p 的下游效應(yīng)分子調(diào)節(jié)LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。TUNEL 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,LPS+mimic NC 組的細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05);與LPS+mimic NC 組比較,LPS+mimic 組的細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與LPS+mimic組比較,LPS+mimic+TLR4 組的細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05),見(jiàn)圖5g。

    圖5 miR-129-5p表達(dá)可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷

    3 討論

    膿毒癥是一種全身性炎癥反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致器官功能障礙和/或循環(huán)障礙[7]。失調(diào)的炎癥反應(yīng)在膿毒癥引起的肝損傷中起關(guān)鍵作用[8]。之前的研究證實(shí)了多種microRNA 和lncRNA 與炎癥反應(yīng)都有關(guān)[9-11],然而,其在調(diào)節(jié)膿毒癥引起的肝損傷中的具體作用尚未明確。本研究根據(jù)TargetScan 軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),lncRNA NEAT1 與miR-129-5p 之間存在相互作用,這可能與膿毒癥患者的嚴(yán)重程度和預(yù)后不良有關(guān)。此外,本研究觀察到膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷患者體內(nèi)的TNF-α、IL-6、IL-1β、lncRNA NEAT1 和TLR4 的表達(dá)均增加,但miR-129-5p 的表達(dá)水平降低。進(jìn)一步證明了lncRNA NEAT1 可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-129-5p 的表達(dá),靶向TLR4 來(lái)調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。這些研究結(jié)果為膿毒癥引起肝損傷的治療提供了一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

    研究表明,lncRNA NEAT1 在膿毒癥患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào),其在膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷中也扮演著重要角色[12-13]。本研究結(jié)果顯示,在膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷患者中,lncRNA NEAT1 表達(dá)也升高,這與之前的研究一致。另外,lncRNA NEAT1 的升高還伴隨著miR-129-5p的抑制、TLR4的激活以及炎癥反應(yīng)的顯著增加。本研究結(jié)果顯示,miR-129-5p 與lncRNA NEAT1、TLR4 均呈負(fù)相關(guān),而lncRNA NEAT1 與TLR4呈正相關(guān)。之前研究也指出,lncRNA NEAT1 可通過(guò)與miR-129-5p 的結(jié)合,抑制miR-129-5p 的表達(dá)從而促進(jìn)酒精性脂肪肝的肝纖維化[14]。因此,本研究在膿毒癥中證實(shí)了lncRNA NEAT1、miR-129-5p 和TLR4 在介導(dǎo)膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷中具有顯著的相關(guān)性。

    在實(shí)驗(yàn)性膿毒癥模型中,LPS 通常用于研究膿毒癥期間的炎癥反應(yīng)[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn),與膿毒癥引起肝損傷患者的lncRNA NEAT1表達(dá)上調(diào)結(jié)果一致,LPS刺激后肝細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1 的表達(dá)上調(diào),而沉默lncRNA NEAT1 則降低了LPS 誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子水平。此外,用TLR4 重組蛋白上調(diào)TLR4 的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA NEAT1 對(duì)細(xì)胞凋亡和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的抑制作用,這表明miR-129-5p 和TLR4 在lncRNA NEAT1的下游扮演重要角色。

    本研究結(jié)果還顯示,lncRNA NEAT1/miR-129-5p和miR-129-5p/TLR4直接結(jié)合,這可能是lncRNA的內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA機(jī)制發(fā)揮的作用[18-19]。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)lncRNA NEAT1與miR-129-5p可直接結(jié)合,并且證實(shí)TLR4是miR-129-5p的靶基因,TLR4可以被miR-129-5p 靶向抑制。因此,本研究認(rèn)為在LPS 刺激下,lncRNA NEAT1 的表達(dá)顯著上調(diào),隨后與miR-129-5p 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,使細(xì)胞中miR-129-5p 的表達(dá)顯著降低,提示lncRNA NEAT1 扮演了內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA,從而激活被miR-129-5p 抑制的靶基因TLR4,TLR4被激活后刺激下游信號(hào)傳導(dǎo),導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)肝損傷。

    綜上,lncRNA NEAT1 在膿毒癥引起的肝損傷中具有重要的生物學(xué)功能,其在膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào),且與miR-129-5p 競(jìng)爭(zhēng)并調(diào)節(jié)TLR4,以促進(jìn)肝損傷。揭示了lncRNA NEAT1/miR-129-5p/TLR4軸在膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷中的重要功能,為膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

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