PLIN2在氧化型低密度脂蛋白誘導的泡沫細胞脂噬中的作用*

譚艷美,陳三俊,譚玉林,吳 智,蒙國照,譚艷飛

(1.湘南學院基礎醫(yī)學院,湖南 郴州 423000;2.湘南學院生物醫(yī)藥微生物組學重點實驗室,湖南 郴州 4230003.郴州市第一人民醫(yī)院疼痛科,湖南 郴州 423000;4.郴州市第一人民醫(yī)院內分泌糖尿病科,湖南 郴州 423000)

脂噬是一種選擇性的自噬進程,能有效識別并調控脂質代謝,選擇性地將脂滴包裹在細胞溶酶體中,脂滴在溶酶體中被酸性脂肪酶降解后送至細胞外的高密度脂蛋白(HDL)中,進而促進膽固醇流出,維持脂質代謝的穩(wěn)態(tài)[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn),脂噬減弱會促進動脈粥樣硬化(AS)、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展[3],也就是說,AS的發(fā)生很有可能與細胞內脂噬的減弱有關。

圍脂滴蛋白(perilipin2,PLIN2)是PAT家族中的成員之一,在AS發(fā)展進程中具有重要作用。有研究證明,PLIN2也可通過激活自噬和刺激膽固醇的外流影響人類對AS的易感性[4],同時在PLIN2缺陷的心肌細胞中,脂噬減弱引起細胞內甘油三酯蓄積[5]。

脂質的異常蓄積是AS發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié),因此研究脂質蓄積的機制對防治AS具有重要意義。結合課題組前期對PLIN2在AS發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究,本研究擬探討PLIN2在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的泡沫細胞形成過程中是否有抑制脂噬的作用,以期為AS的防治和機制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 RAW264.7巨噬細胞購自中科院上海細胞生物學研究所細胞庫;DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco,8122691);特級胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司,164210);oxLDL(廣州奕元生物技術有限公司,YB-002);油紅O(Sigma,SHBL1039);LC3A/B兔mAb(Cell Signaing Technology,12741);SQSTM1/p62 抗體(Cell Signaing Technology,5114);兔PLIN2的單克隆(Abcam,ab108323);GAPDH多克隆抗體(Proteintech,10494-1-AP);辣根過氧化物酶(HRP)-偶聯(lián)親和純山羊抗兔IgG(proteintech,SA00001-2);特超敏電化學發(fā)光(ECL)試劑盒(Beyotime,P0018AM);LipofectamineTM3000(Thermo Fisher,L3000001);si-musPLIN2(HonorGene)。

1.2方法

1.2.1泡沫細胞模型建立 取對數(shù)生長期RAW264.7巨噬細胞接種于6孔板中,每孔含完全培養(yǎng)基2 mL,加入終濃度為100 μg/mL的ox-LDL處理12、24、48 h,油紅O染色觀察細胞內脂質蓄積情況。

1.2.2小干擾RNA的構建和轉染 NCBI基因數(shù)據(jù)庫查找鼠源 PLIN2蛋白編碼區(qū)序列,設計合成小干擾 RNA,具體序列為正義鏈:5′-GUUCAGAAGCCGAGCAACUAU-3′;反義鏈5′-AUAGUUGCUCGGCUUCUGAAC-3′。

轉染前1 d將細胞接種至培養(yǎng)板中,預計轉染時細胞匯片達到70%～90%。轉染時,按說明書先用無血清培養(yǎng)基稀釋LipofectamineTM3000和siRNA,充分混勻,再在每管已稀釋的LipofectamineTM3000試劑中按1∶1比例加入稀釋的siRNA,室溫孵育10～15 min,最后將siRNA-脂質復合物加入細胞中,孵育2～4 d,分析轉染細胞。

1.2.3分組 為研究PLIN2敲減后ox-LDL誘導的泡沫細胞內脂噬基因的變化情況,將細胞分為5組,分別為對照組、空質粒組、ox-LDL處理組、siPLIN2組和siPLIN2+ox-LDL處理組。

1.2.4油紅O染色 避光條件下配備油紅O工作液,去離子水與油紅O儲備液比例為2∶3,混勻后用0.2 μm濾膜過濾3次備用。將已做處理的12孔板取出,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,每次10 min,每孔加入4%多聚甲醛1 mL固定細胞30 min,固定完畢,PBS洗滌3次。每孔加入1 mL油紅O工作液染色30 min,顯微鏡下觀察細胞脂滴染色情況,PBS洗滌3次。每孔加入蘇木素1 mL染核5 s,PBS洗滌3次,顯微鏡觀察染核情況。載玻片滴適量甘油,取出孔板中蓋玻片,待表面液體蒸發(fā)將其覆于甘油上,封片保存拍照。

1.2.5Western blot 細胞裂解法提取細胞總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳后濕轉至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉2 h,稀釋后的一抗(PLIN2、LC3、p62、GAPDH)孵育,4 ℃過夜,TBST洗膜3次,每次10 min,HRP標記二抗室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,采用ECL試劑盒顯影。

2 結 果

2.1泡沫細胞模型構建 隨著ox-LDL處理時間延長,細胞內脂質顆粒逐漸增加,處理12 h脂質顆粒少量增加,處理24 h脂質顆粒增加明顯,處理48 h脂質顆粒相對24 h時略多,但細胞形態(tài)也變得不規(guī)則,提示ox-LDL處理時間過長會改變細胞形態(tài),后續(xù)泡沫細胞模型構建實驗選擇100 μg/mL的oxLDL處理24 h。見圖1。

注:A.無ox-LDL處理;B.ox-LDL處理12 h;C.ox-LDL處理24 h;D.ox-LDL處理48 h。

2.2泡沫細胞內PLIN2和脂噬相關基因表達情況 PLIN2在ox-LDL處理的細胞內隨著時間延長蛋白含量逐漸增加,48 h增加顯著。LC3在泡沫細胞中隨著脂質增加呈現(xiàn)遞增趨勢,48 h達到高峰;而p62蛋白表達量與對照組相比是下降的,在ox-LDL處理24 h時降至最低,48 h略有增加。見圖2。也就是說,隨著泡沫細胞內脂質的增多,PLIN2和LC3在細胞內的蛋白表達量也是增加的,而p62則呈先下降后增加的趨勢,提示脂噬在泡沫細胞形成時隨著細胞內脂質蓄積增多是先增強后減弱的。

注:1為對照組;2為ox-LDL處理12 h;3為ox-LDL處理24 h;4為ox-LDL處理48 h。與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

2.3轉染 按步驟轉染siPLIN2后48 h檢測細胞內PLIN2蛋白含量,當轉染濃度為30 pmol/μL時轉染效率最高,達到60%以上;當轉染濃度為20 pmol/μL和50 pmol/μL時,轉染效率在50%以下,見圖3。說明轉染濃度為30 pmol/μL時,PLIN2基因在RAW264.7細胞內沉默效果最佳。

注:1為對照組;2為20 pmol/μL(siPLIN2);3為30 pmol/μL(siPLIN2);4為50 pmol/μL(siPLIN2)。與對照組比較,aP<0.01,bP<0.001。

2.4沉默PLIN2脂噬相關基因變化 PLIN2基因敲除的巨噬細胞內LC3的蛋白表達量明顯降低,但在PLIN2基因敲除的泡沫細胞內LC3并沒有明顯的變化。然而,p62在PLIN2敲除的巨噬細胞內沒有明顯變化,但在PLIN2敲除的泡沫細胞內卻有明顯的升高,見圖4。說明PLIN2影響了泡沫細胞內脂噬基因p62的表達。

注:1為對照組;2為空質粒組;3為ox-LDL處理組;4為siPLIN2處理組;5為siPLIN2+ox-LDL處理組。與對照組比較,aP<0.05;與空質粒組比較,bP<0.05;與ox-LDL處理組比較,cP<0.05。

3 討 論

近年來,自噬在AS發(fā)生發(fā)展中的作用得到了廣泛的關注,有研究表明,促進內皮細胞自噬可延緩AS斑塊的形成,進而治療相關疾病[6]。那么,脂噬作為一種特殊類型的選擇性自噬,可在細胞內選擇性降解脂滴維持細胞內脂質代謝平衡,而且當細胞內的脂噬不足或過度脂噬時都會引起機體脂代謝紊亂導致疾病的發(fā)生[7]。有文獻報道,在AS保護作用中脂噬在巨噬細胞自噬中發(fā)揮了重要作用[8],體內和體外選擇性激活和追蹤脂噬,充分了解AS中的脂噬機制,確定巨脂噬和微脂噬在AS脂代謝中的作用,發(fā)現(xiàn)脂噬在治療AS相關疾病的治療潛力是研究者的目的[9]。本研究以PLIN2與細胞內脂質蓄積的關系為切入點,初步探討PLIN2在ox-LDL誘導的巨噬細胞源性泡沫細胞脂噬中的作用,為發(fā)現(xiàn)脂噬在AS中的治療潛力提供依據(jù)。

PLIN2是JIANG等[10]在1992年利用差別雜交篩選技術在脂肪細胞中分離提取到的一種蛋白,后來發(fā)現(xiàn)其與脂肪代謝密切相關,不僅促使細胞內脂質蓄積,還抑制細胞內膽固醇的外流,有學者將PLIN2認為是細胞內脂質蓄積的標志物[11]。有研究表明,PLIN2在AS發(fā)展進程中一方面可促進巨噬細胞內炎癥反應發(fā)生;另一方面其也可加速泡沫細胞內脂質的蓄積[12-13]。近年有文獻報道,在心肌細胞中PLIN2缺乏會下調細胞內脂噬,從而引起心肌細胞胞內脂質蓄積[4],說明PLIN2與細胞內脂噬有關,那么在AS的泡沫細胞脂噬中PLIN2是否也發(fā)揮了作用。本研究表明,在ox-LDL誘導的泡沫細胞中,脂噬相關蛋白LC3的蛋白表達量會隨著胞內脂質的增加而增加,此趨勢與PLIN2蛋白表達量變化是一致的,而脂噬相關蛋白p62則隨著脂質的增多呈先下降后增加的趨勢,與LC3相反,表明在ox-LDL誘導的RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞形成過程中脂噬是先增強后減弱的,這與鄭舒展等[14]發(fā)現(xiàn)的ox-LDL誘導的THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞形成24 h內,LC3比值升高、p62水平降低、脂噬增強,24 h后LC3比值降低、p62水平升高、脂噬減弱存在一致性。

另外,本研究還發(fā)現(xiàn),在RAW264.7巨噬細胞中敲除PLIN2后LC3蛋白表達量降低,提示PLIN2可能有影響LC3表達的作用。有文獻提示,在PLIN2缺乏的心肌細胞中溶酶體和脂滴共定位減少,脂噬減弱[4],這與本研究中PLIN2敲除后LC3蛋白表達量下降的結果一致,說明PLIN2有調控脂噬的作用。

同時,本研究還發(fā)現(xiàn),在ox-LDL誘導的RAW264.7泡沫細胞中敲除PLIN2后LC3蛋白表達量變化不明顯,但p62蛋白表達量增加,提示PLIN2在泡沫細胞脂噬中有下調p62蛋白表達,增強脂噬的作用。而有文獻報道,白藜蘆醇可通過上調人脂肪變性HHL-5細胞的PLIN2表達,促進脂噬相關分子LC3β和Rab7的表達,從而增強脂噬緩解細胞內脂質蓄積[15],與本研究中泡沫細胞內PLIN2增強脂噬的結果一致。但是,PLIN2調節(jié)泡沫細胞內脂噬的機制尚不清楚,有待進一步研究。

綜上所述,本研究證明了在RAW264.7巨噬細胞內PLIN2有調控脂噬的作用,在ox-LDL誘導的泡沫細胞形成過程中,脂噬隨著細胞內脂質增加先增強后減弱,同時,在PLIN2敲除的泡沫細胞內,p62蛋白表達量明顯增加,脂噬減弱。在AS發(fā)生發(fā)展過程中,泡沫細胞的形成是重要的一環(huán),若能通過增強脂噬,延緩泡沫細胞和AS斑塊的形成速度,那么在治療冠心病、腦血管疾病和糖尿病等AS相關疾病的方法和手段上便可以提供更多的可能。