中藥刺五加葉質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

孫 悅，張楠淇，杜 銳，趙 巖

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130000）

刺五加葉為五加科植物刺五加［Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim） Harms］的干燥葉片，具有補(bǔ)益肝腎，益精壯骨之功效，適用于短暫性腦缺血、腦動(dòng)脈硬化、腦栓塞等，亦可用于冠心病、心絞痛、以及神經(jīng)衰弱、更年期綜合癥等?！逗邶埥≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)（2001 年版）》記載刺五加葉化學(xué)成分包括刺五加苷I，K，L，M 以及金絲桃苷［1］，然而刺五加苷I，K，L，M 在五加屬植物中廣泛存在。基于一種或多種成分測(cè)定的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)通常不能說明中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的特異性和專屬性。針對(duì)上述存在的問題，本研究基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Quality marker，Q-marker）理論［2］，對(duì)刺五加葉的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)測(cè)，為刺五加葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 基于化學(xué)組分和成分轉(zhuǎn)移證據(jù)的質(zhì)量標(biāo)志物分析

中藥的質(zhì)量要求是傳統(tǒng)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中的重要組成部分。中藥化學(xué)成分是發(fā)揮其功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，能夠客觀的反映中藥質(zhì)量實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。在中藥中存在的有效成分不同于一般化合物，是來自于多組分交互作用的天然產(chǎn)物［3］。因此，刺五加葉質(zhì)量標(biāo)志物的篩選應(yīng)通過化學(xué)物質(zhì)組成及成分傳遞確定。

1.1 化學(xué)物質(zhì)

目前，國內(nèi)外學(xué)者已從刺五加葉中鑒別出來200 多種化學(xué)成分，主要包括有黃酮、三萜、苯丙素、有機(jī)酸以及微量元素等［4-23］。刺五加葉含有豐富的黃酮及其苷類，目前已發(fā)現(xiàn)該類成分46 種，以黃酮醇苷和黃酮苷為主。三萜類成分是刺五加葉中重要次級(jí)代謝產(chǎn)物，以羽扇豆烷型、齊墩果烷型、烏蘇烷型和木栓型三萜居多，多以皂苷形式存在于植物體內(nèi)，目前已發(fā)現(xiàn)該類成分125 種。刺五加葉中的苯丙素類化合物包含簡(jiǎn)單苯丙素類、香豆素、木脂素類化合物，目前已發(fā)現(xiàn)該類成分50 種。刺五加葉中還含有有機(jī)酸、類固醇、甾體、氨基酸等多種有機(jī)化合物及Ca、Mg、Ba、Na 等微量元素。具體信息見表1~3。

表1 刺五加葉中黃酮類化合物Tab.1 Flavonoids in Acanthopanax senticosus leaves

表2 刺五加葉中三萜類化合物Tab.2 Triterpenes in Acanthopanax senticosus leaves

表3 刺五加葉中苯丙素類化合物Tab.3 Phenylpropanoids in Acanthopanax senticosus leaves

1.2 基于血清藥物化學(xué)證據(jù)的質(zhì)量標(biāo)志物分析

中藥血清藥物化學(xué)是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口服給藥后的血清為研究對(duì)象，借助傳統(tǒng)天然藥物化學(xué)的研究方法和現(xiàn)代技術(shù)應(yīng)用發(fā)展起來的，研究血清中的移行成分與中藥傳統(tǒng)療效之間的關(guān)系，闡明物質(zhì)在體內(nèi)的代謝學(xué)和動(dòng)力學(xué)［24］，以期為刺五加葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供證據(jù)。Wang［25］等在對(duì)給藥刺五加葉的清醒缺血性中風(fēng)大鼠血漿和海馬中與治療效果相關(guān)的活性化合物分析過程中發(fā)現(xiàn)金絲桃苷、槲皮素、槲皮苷和咖啡酸可以通過血腦屏障，槲皮素比槲皮苷和金絲桃苷需要更長(zhǎng)的攝取時(shí)間，但通過率更高。Yamauchi 等［26］在對(duì)刺五加葉提取物改善大鼠記憶能力研究中發(fā)現(xiàn)，灌胃給藥后血液和大腦中移行物質(zhì)包括刺五加苷M、刺五加皂苷C3、B 和A1，并驗(yàn)證了刺五加苷M、刺五加皂苷C3、B的增強(qiáng)識(shí)別記憶活性。通過上述分析，從刺五加葉的原有成分到血中移行成分的系統(tǒng)標(biāo)識(shí)，刺五加葉中金絲桃苷、槲皮素、槲皮苷和咖啡酸，刺五加苷M、刺五加皂苷C3、B 和A1 可以考慮作為刺五加葉候選質(zhì)量標(biāo)志物。

2 基于植物親緣學(xué)相關(guān)證據(jù)的質(zhì)量標(biāo)志物分析

刺五加是小型灌木，為五加科五加屬植物。在我國五加屬植物中能夠藥用的植物種類較多，應(yīng)用歷史悠久。目前在全球范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)37 種五加屬植物（不包括變種），主要分布于亞洲地區(qū)。我國的五加屬植物資源豐富，廣泛分布于長(zhǎng)江流域，共有26 種18 變種，其中最常見的是細(xì)柱五加、刺五加和紅毛五加［27］。五加屬植物葉片的主要次生代謝產(chǎn)物為三萜類化合物，且以羽扇豆烷型三萜為主，如chiisanogenin 和chiisanoside 等［28］。將chiisanogenin、chiisanoside 等裂環(huán)羽扇豆烷型三萜作為五加科五加屬葉類分類依據(jù)具有重要植物資源研究意義。

3 基于中藥有效性證據(jù)的質(zhì)量標(biāo)志物分析

中藥質(zhì)量控制的根本目的是確保臨床用藥過程中的有效性和安全性，同時(shí)也是建立質(zhì)量標(biāo)志的核心內(nèi)容。中藥藥性和藥效是中醫(yī)藥理論的核心，反映了中醫(yī)藥在不同層面和方式下對(duì)人類疾病所產(chǎn)生的療效。刺五加葉質(zhì)量標(biāo)志物的研究應(yīng)包括對(duì)刺五加葉的藥性和藥效的認(rèn)識(shí)，以此來反映中藥質(zhì)量的完整性［29］?！侗窘?jīng)》［30］中曾提到“入腹則知其性，入口則知其味”，中藥的本質(zhì)與其功效的性質(zhì)和屬性有關(guān)，并取決于中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，將中藥藥性納入刺五加葉的質(zhì)量指標(biāo)，使中藥性質(zhì)與化學(xué)基團(tuán)密切連接。

刺五加葉味辛、苦，性平，歸肝、腎經(jīng)。“辛”為五味之一，能散、能行、能通、能溫、能升、能潤(rùn)、能化，其物質(zhì)基礎(chǔ)多為揮發(fā)油、苷類、生物堿和氨基酸成分。目前在刺五加葉中檢測(cè)到多種揮發(fā)性成分，其中以紅沒藥醇、石竹烯以及氧化石竹烯含量最高［31］；刺五加葉中含有多種黃酮苷類成分，主要包括槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷等，以及少量三萜皂苷刺如五加皂苷A-E、chiisanoside等［32］；而生物堿成分在刺五加葉中少量存在，近年來僅發(fā)現(xiàn)兩種生物堿類成分Pheophorbide A 和Pyropheophorbide A［33］；此外，在刺五加葉中還檢測(cè)出多種氨基酸，其中以天冬氨酸和谷氨酸含量較高。中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的基本目的是患者在服用中藥后對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的療效。因此，刺五加葉質(zhì)量標(biāo)志物重要的依據(jù)之一是探究刺五加葉的多種藥理活性。

3.1 對(duì)心腦血管的作用

刺五加葉可用于治療短暫性腦出血、腦動(dòng)脈硬化、腦栓塞、冠心病等心腦血管疾病，皂苷類化合物為其主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究發(fā)現(xiàn)，刺五加葉皂苷能夠減少大鼠心肌缺血-再灌注損傷（Myocardial infarction/reperfusion injury， MI/RI）模型的心肌梗死面積，通過激活ERK1/2 途徑減少心肌細(xì)胞凋亡；3，4-裂環(huán)羽扇豆烷型三萜皂苷chiisanoside、divaroside等能夠緩解BaCl2引起的室性心律失常［34-35］。刺五加葉具有神經(jīng)保護(hù)作用，并且對(duì)缺血性腦卒中具有一定的療效?？诜涛寮尤~能明顯降低缺血性腦卒中動(dòng)物模型的腦含水量和腦指數(shù)，緩解血清和腦組織中的神經(jīng)遞質(zhì)含量異常變化；并能通過減少機(jī)體的氧化應(yīng)激和炎癥損傷，在一定程度上治療缺血性腦卒中［26，36］。刺五加葉能夠調(diào)節(jié)小鼠的認(rèn)知功能。通過對(duì)小鼠進(jìn)行一系列的學(xué)習(xí)和記憶測(cè)試發(fā)現(xiàn)，刺五加葉皂苷能夠增強(qiáng)小鼠的記憶能力，通過AGE-RAGE 和PI3K-Akt 信號(hào)通路發(fā)揮中樞神經(jīng)保護(hù)作用［23，36］。刺五加葉中三萜皂苷元chiisanogenin能夠有效抑制血小板聚集，其皂苷提取物能明顯改善實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠血液流變學(xué)和血小板功能的異常變化［37-38］。

3.2 對(duì)機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)作用

刺五加葉能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝功能，刺五加苷E 能夠調(diào)節(jié)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因表達(dá)和代謝物，并且影響脂肪酸合成、β-氧化和脂肪分解過程。刺五加葉可以有效抑制脂肪酶的活性，能促進(jìn)線粒體脂肪酸氧化和CPT 的活化，減輕高脂飲食引起的小鼠血漿TG水平升高［39-42］。

3.3 鎮(zhèn)靜催眠作用

刺五加葉提取物能夠抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，改善小鼠中樞神經(jīng)興奮。有研究發(fā)現(xiàn)，刺五加葉水提物的鎮(zhèn)靜催眠活性優(yōu)于醇提物，刺五加葉乙醇提取物對(duì)氯苯丙氨酸（4-Chloro-DL-phenylalanine， p-CPA）誘導(dǎo)的失眠小鼠有明顯的拮抗作用，不僅以劑量依賴的方式縮短睡眠潛伏期，而且還增加了小鼠海馬體中5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine， 5-HT）和 γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid ， GABA）的表達(dá)［4，43］。

3.4 抗腫瘤作用

刺五加葉中的皂苷類化合物能抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。有文獻(xiàn)報(bào)道，刺五加葉皂苷對(duì)小鼠食管癌移植瘤和腎癌細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)凋亡及抗增殖作用，其機(jī)制可能與凋亡基因bax 蛋白表達(dá)增加、bcl-2 蛋白表達(dá)下降有關(guān)［44-45］。刺五加葉中含有的chiisanoside 對(duì)H22 荷瘤小鼠表現(xiàn)出抗癌活性，苷元chiisanogenin 對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性。

3.5 免疫抗炎作用

刺五加葉具有良好的抗炎效果。研究發(fā)現(xiàn)，刺五加葉中提取的水溶性多糖具有顯著的免疫生物學(xué)活性［46-47］。刺五加葉中分離出的多種皂苷在脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）刺激的骨髓衍生樹突狀細(xì)胞（Bone marrow-derived dendritic cells， BMDCs）中表現(xiàn)出顯著的抗炎活性，能夠顯著抑制白細(xì)胞介素12（Interleukin-12， IL-12）的產(chǎn)生［46-47］。

3.6 其他

刺五加葉具有抗菌和胃黏膜保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，刺五加苷K 可通過降低毒力來抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus， MRSA）引起的感染［48］。chiisanoside、chiisanogenin 和金絲桃苷對(duì)G（+）和G（-）具有廣泛、中度的抗菌活性，最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration， MIC）在50~100 MIC g/ml 范圍內(nèi)［49］。刺五加葉還能保護(hù)急性胃黏膜損傷，可明顯減輕C48/80 誘導(dǎo)的黏液耗竭和胃黏膜炎癥反應(yīng)，通過抗凋亡機(jī)制減少胃黏膜的炎癥和氧化應(yīng)激［50］。

綜上，刺五加葉中裂環(huán)羽扇豆烷型三萜類化合物chiisanoside、divaroside、chiisanogenin，苯丙素苷類化合物刺五加苷E、K，以及黃酮苷類化合物金絲桃苷等成分可考慮作為刺五加葉的候選質(zhì)量標(biāo)志物。

4 基于化學(xué)成分可測(cè)性的質(zhì)量標(biāo)志物分析

中藥化學(xué)成分的可測(cè)性是建立刺五加葉質(zhì)量評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)，同時(shí)也是刺五加葉質(zhì)量標(biāo)志物篩選的基本原則之一。中藥成分復(fù)雜不能全部滿足與中藥相關(guān)的專屬性要求，只有通過現(xiàn)代技術(shù)方法定性或定量要求的化合物才可以被納入到質(zhì)量標(biāo)志物之中。

4.1 定性分析

刺五加葉化學(xué)成分的定性分析和鑒別方法主要包括多種色譜、光譜方法及色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，常用的方法包括TLC、NMR、MS、HPLC-MS。匡海學(xué)課題組［18-20］通過UV、NMR 和MS 等光譜學(xué)分析手段從刺五加葉中定性鑒別出包括綠原酸、阿魏酸在內(nèi)的15 種酚酸類化合物和以蘆丁為代表的5 種黃酮類化合物。王知斌等［15］利用NMR和MS光譜學(xué)分析方法從刺五加葉中鑒定了包括金絲桃苷、槲皮素在內(nèi)的9 個(gè)黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)。李仁杰［51］以chiisanoside 和金絲桃苷為對(duì)照品建立了刺五加葉的TLC 鑒別方法。Liu 等［4］使用UPLC-Q/TOF-MS 聯(lián)用技術(shù)從刺五加葉中鑒定出75 種化合物。陳宏昌等［11］采用UPLC-QTOF-MS/MS 法對(duì)刺五加葉中的化學(xué)成分進(jìn)行分析，指認(rèn)出30個(gè)化學(xué)成分。

4.2 定量分析

針對(duì)刺五加葉中活性組分的理化性質(zhì)，學(xué)者們建立了刺五加葉活性組分的定量分析方法。其定量方法以分光光度法、HPLC 法為主，涉及到的活性物質(zhì)包括總黃酮、總皂苷等有效部位及以chiisanoside 為代表的裂環(huán)羽扇豆烷型三萜類、金絲桃苷等黃酮類、綠原酸等苯丙素類有效成分。李仁杰［51］建立了刺五加葉的總黃酮、裂環(huán)羽扇豆烷型總?cè)圃碥沼行Р课坏淖贤?可見分光光度含量測(cè)定方法及chiisanoside、chiisanogenin、金絲桃苷、木犀草苷和槲皮素的HPLC 含量測(cè)定方法，并闡明了上述有效物質(zhì)在刺五加葉中的積累規(guī)律。修成［52］利用高光譜無損成像技術(shù)，建立了刺五加冠層葉片中類黃酮含量的分類和預(yù)估方法，實(shí)現(xiàn)了避免環(huán)境影響和化學(xué)檢測(cè)破壞冠層葉片的快速、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確類黃酮定量分析。關(guān)欣等［53］利用一測(cè)多評(píng)技術(shù)建立了適用于刺五加葉中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷等5 種成分含量的同時(shí)測(cè)定的HPLC方法。

綜上，基于化學(xué)成分可測(cè)性可將以chiisanoside和chiisanogenin 為代表的裂環(huán)羽扇豆烷型三萜皂苷類，以金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素、槲皮苷為主的黃酮類，以綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸等苯丙素類成分作為刺五加葉的候選質(zhì)量標(biāo)志物。

5 結(jié)語

刺五加在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，其葉具有補(bǔ)益肝腎，益精壯骨的功效，主要用于治療心腦方面的疾病，現(xiàn)如今廣泛地應(yīng)用于中藥復(fù)方和藥食同源的保健品，有巨大的市場(chǎng)需求量。產(chǎn)品原料的質(zhì)量及制劑的生產(chǎn)質(zhì)量與其臨床療效和安全性直接相關(guān)，雖然目前已針對(duì)部分刺五加葉中的化學(xué)成分建立了定性和定量分析方法，但這些化學(xué)成分的選擇依據(jù)及范圍仍欠缺系統(tǒng)性和全面性。采用系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)邏輯選定刺五加葉的質(zhì)量標(biāo)志物迫在眉睫。本文基于質(zhì)量標(biāo)志物的理論指導(dǎo)［54-55］，從刺五加葉原有成分到移行成分的系統(tǒng)標(biāo)識(shí)篩選出3種黃酮類、3種三萜皂苷類成分和2種苯丙素類成分作為候選質(zhì)量標(biāo)志物；基于植物親緣學(xué)的相關(guān)證據(jù)將chiisanoside 和chiisanogenin 為代表的羽扇豆烷型三萜類納入到刺五加葉的質(zhì)量標(biāo)志物行列；再從刺五加葉的傳統(tǒng)藥性理論和現(xiàn)代藥效學(xué)依據(jù)篩選出3種三萜類、2 種苯丙素類和1 種黃酮類成分；最后通過定性分析和定量分析的角度篩選出刺五加葉中的2 種三萜類、3 種苯丙素類和4 種黃酮類成分。最終確定三萜類成分chiisanoside、chiisanogenin，黃酮類成分金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素，苯丙素類成分刺五加苷E、綠原酸、咖啡酸作為刺五加葉的候選質(zhì)量標(biāo)志物。上述質(zhì)量標(biāo)志物可作為刺五加葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的參考，為建立全面系統(tǒng)的刺五加葉質(zhì)量控制體系，確保臨床療效和用藥安全提供依據(jù)。