miR-214對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制

盛秀云，張磊，王艷軍

聊城市第二人民醫(yī)院血液腫瘤科，山東 聊城 252600

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種起源于骨髓漿細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，約占血液系統(tǒng)腫瘤疾病的10%，MM 發(fā)生在骨髓中，每年約有80 000 例患者被新診斷為MM［1］。盡管MM 的化療和單克隆抗體治療取得一定進(jìn)展，但由于MM 復(fù)發(fā)率高，多數(shù)患者預(yù)后不佳［2］。此外，MM細(xì)胞生長(zhǎng)失控使疾病仍無法治愈。細(xì)胞遺傳學(xué)的異常變化是MM 發(fā)生進(jìn)展的重要原因［3］。然而，MM的發(fā)病和進(jìn)展機(jī)制尚未明確。近年來，微小RNA（miRNA）被認(rèn)為是腫瘤診斷和治療的重要標(biāo)志物和靶點(diǎn)，成為關(guān)注熱點(diǎn)。miRNA 是高度保守的長(zhǎng)度約22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前多種miRNAs 在惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制中的致癌或抗癌作用已被報(bào)道。在已發(fā)現(xiàn)眾多的miRNA 中，miR-214 被發(fā)現(xiàn)在部分實(shí)體腫瘤中異常表達(dá)，參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。但目前miR-214 在MM 發(fā)生進(jìn)展中的作用機(jī)制尚不明確。2022 年1 月—2023 年1月，我們探討了MM 細(xì)胞中miR-214 表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響及其可能機(jī)制，以期為MM的發(fā)病機(jī)制和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人MM 細(xì)胞株IM-9、U266、Lp-1、H929及人正常漿細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生科院細(xì)胞資源中心。TRIzol試劑、LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；miR-214 mimics 和NC-mimics 購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司；RIPA 裂解液、CCK-8 增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V/FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司；FOXM1、HRP 標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。Light Cycler 480 PCR 儀購(gòu)自瑞士ROCHE公司；NanoDrop ND-2000超微量分光光度儀購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；BD-LSR-Ⅱ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將IM-9、U266、Lp-1、H929 細(xì)胞置于含10 %胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)液中，正常漿細(xì)胞置于含10 %胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2的飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)，采用0.25%胰酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取U266 細(xì)胞，隨機(jī)分為miR-214 mimics組和mimics-NC組。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，按照LipofectamineTM2000 試劑盒說明書提供的操作流程，分別將miR-214 mimics 或NC-mimics 轉(zhuǎn)染至miR-214 mimics 組和mimics-NC 組U266 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 miR-214 表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR 法。用TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，NanoDrop ND-2000 超微量分光光度儀檢測(cè)總RNA 的濃度及純度。取總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，按照RT-qPCR 試劑盒說明書配制反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40 個(gè)循環(huán)。引物序列如下：miR-214 正向引物：5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3'；反向引物：5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'；內(nèi)參U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-214相對(duì)表達(dá)量。

1.5 集落形成能力檢測(cè) 采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。收集轉(zhuǎn)染處理48 h后的U266細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后重懸成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×103/mL，以500 個(gè)/皿的密度接種，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)14 d，隔日更換培養(yǎng)基，出現(xiàn)肉眼可見的集落，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌后，多聚甲醇固定、染色、晾干并拍照記錄結(jié)果，計(jì)算集落形成數(shù)。

1.6 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)。收集轉(zhuǎn)染處理48 h 后的U266 細(xì)胞接種于96 孔板，每孔6×103個(gè)細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，避光孵育2 h，后用自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（OD450）值。

1.7 細(xì)胞凋亡率測(cè)算 收集轉(zhuǎn)染處理48 h 后的U266 細(xì)胞，PBS 液清洗2 次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。取細(xì)胞懸液400 μL，避光條件加入PI 5 μL和Annexin V/FITC 5 μL，繼續(xù)孵育25 min，然后立即用BD-LSR-Ⅱ流式細(xì)胞儀測(cè)算細(xì)胞凋亡率。

1.8 細(xì)胞周期檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染處理48 h 后的U266細(xì)胞，PBS洗滌后加入75%預(yù)冷乙醇固定，4 ℃過夜，PBS 洗滌后重懸細(xì)胞，加入適量RNaseA 和碘化丙啶。37 ℃孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。

1.9 FOXM1 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用 Western blotting法。收集轉(zhuǎn)染處理48 h后的U266細(xì)胞，RIPA裂解液冰上裂解20 min，離心取含全蛋白的上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白上樣，10 % SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜后5% 脫脂牛奶里室溫封閉2 h，TBST 洗膜3 次，加入FOXM1 和GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜， TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，應(yīng)用ECL顯色劑顯影保存，Image J軟件分析條帶的灰度值。1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以±s表示，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MM 細(xì)胞中miR-214 表達(dá) RT-qPCR 結(jié)果顯示，IM-9、U266、Lp-1、H929 及人正常漿細(xì)胞中miR-214的相對(duì)表達(dá)量分別為0.48 ± 0.16、0.29 ± 0.09、0.36 ± 0.10、1.06 ± 0.03，與正常漿細(xì)胞相比，MM細(xì)胞株IM-9、U266、Lp-1、H929 中miR-214 表達(dá)降低（t分別為8.727、19.881、16.423，P均＜0.05），U266中miR-214 表達(dá)最低，因此選擇U266 細(xì)胞株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。

2.2 轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞miR-214表達(dá)比較 RT-qPCR結(jié)果顯示，miR-214 mimics 組和mimics-NC 組U266細(xì)胞中miR-214 的相對(duì)表達(dá)量分別為6.30 ±0.25、0.99 ± 0.06，miR-214 mimics 組U266 細(xì)胞中miR-214 表達(dá)高于NC-mimics 組（t=50.591，P＜0.05）。

2.3 轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞集落形成能力比較 miR-214 mimics 組和mimics-NC 組U266 細(xì)胞集落形成數(shù)目分別為（130 ± 22）、（213 ± 29）個(gè)，miR-214 mimics組U266 細(xì)胞的集落形成數(shù)目少于NC-mimics 組（t=5.585，P＜0.05）。

2.4 轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞增殖活性比較 miR-214mimics 組U266 細(xì)胞24、48、72、96 h 時(shí)OD 值均低于NC-mimics組（P均＜0.05）。

表1 兩組U266細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)OD值比較（± s）

表1 兩組U266細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)OD值比較（± s）

組別NC-mimics組miR-214 mimics組t P OD值24 h 0.69 ± 0.11 0.45 ± 0.09 4.136＜0.05 48 h 1.42 ± 0.22 0.78 ± 0.13 6.135＜0.05 72 h 2.29 ± 0.30 1.23 ± 0.19 7.312＜0.05 96 h 3.56 ± 0.36 2.14 ± 0.25 7.936＜0.05

2.5 轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞凋亡率比較 miR-214 mimics組和mimics-NC組U266細(xì)胞凋亡率分別為（28.40 ±5.11）%、（5.23 ± 1.43）%，miR-214 mimics 組細(xì)胞凋亡率高于NC-mimics組（t=10.700，P＜0.05）。

2.6 轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞周期比較 miR-214 mimics組U266細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞占比高于NC-mimics組（P＜0.05），而S 期和G2/M 期占比低于NC-mimics 組（P均＜0.05）。見表2。

表2 兩組U266細(xì)胞周期占比比較（%，± s）

表2 兩組U266細(xì)胞周期占比比較（%，± s）

組別miR-214 mimics組NC-mimics組t P G0/G1期67.21 ± 8.43 48.77 ± 6.88 4.151＜0.05 S期18.90 ± 3.29 30.28 ± 5.74 4.213＜0.05 G2/M期13.89 ± 3.07 20.95 ± 6.10 2.532＜0.05

2.7 轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞FOXM1蛋白表達(dá)比較 miR-214 mimics 組和mimics-NC 組U266 細(xì)胞中FOXM1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.45 ± 0.16、1.29 ± 0.12，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.288，P＜0.05）。

3 討論

MM 是一種病因復(fù)雜的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其特征是骨髓中漿細(xì)胞的異常擴(kuò)增生長(zhǎng)，患者會(huì)出現(xiàn)貧血、骨痛、疲勞等非特異性癥狀。盡管目前人們對(duì)MM 的病理生理學(xué)有了更多了解，且在該疾病治療方面取得了一定進(jìn)展，但MM 患者易對(duì)治療產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致MM復(fù)發(fā)和進(jìn)展。

近年研究表明，miRNA 通過調(diào)節(jié)參與增殖、細(xì)胞周期控制、凋亡、細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移，在惡性腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，研究miRNA 在MM 中的生物學(xué)作用可能有助于確定MM 的新診斷標(biāo)志物和治療方案。向譜等［5］通過RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MM患者血漿微小RNA-17-5p 表達(dá)明顯升高，可作為MM 發(fā)生發(fā)展?fàn)顟B(tài)相關(guān)的血漿分子標(biāo)志物。CHEN等［6］研究發(fā)現(xiàn)，miR-218 在MM 細(xì)胞中降低，能調(diào)控MM 細(xì)胞對(duì)硼替佐米的耐藥性。WU 等［7］近期報(bào)道，上調(diào)MM 細(xì)胞miR-182 表達(dá)，可能通過增強(qiáng)AKT 磷酸化而產(chǎn)生耐藥性。miR-21［8］、miR-32-5p［9］、miR-451a［10］等miRNA被相繼報(bào)道可能通過調(diào)控MM細(xì)胞的增殖及凋亡參與MM 的發(fā)生進(jìn)展。但到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)在MM 耐藥及無限擴(kuò)增、生長(zhǎng)過程中起關(guān)鍵作用的miRNA。

miR-214 是近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNAs 家族中的一員，其基因定位于人類染色體1q24.3區(qū)域，DNM3的14 號(hào)內(nèi)含子上，研究發(fā)現(xiàn)，其與惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)［11］。HULI 等［12］研究認(rèn)為，miR-214 是一種腫瘤抑制因子，肝內(nèi)膽管癌中miR-214 表達(dá)下調(diào)，其通過直接靶向Twist基因來抑制EMT 發(fā)生。SHIH等［13］發(fā)現(xiàn)人類肝細(xì)胞癌中miR-214 水平降低與預(yù)后惡化有關(guān)。然而，近期有研究發(fā)現(xiàn)miR-214 在某些惡性腫瘤中發(fā)揮致癌基因作用。如乳腺癌癥組織中miR-214表達(dá)上調(diào)，其通過抑制p53表達(dá)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲［14］。miR-214 在胃癌細(xì)胞中表達(dá)升高，敲低胃癌細(xì)胞miR-214 可通過靶向PTEN 顯著抑制癌癥細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［15］。miR-214 在不同惡性腫瘤中發(fā)揮不同作用，提示miR-214 在不同惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能通過激活不同的優(yōu)勢(shì)通路、調(diào)節(jié)不同的基因發(fā)揮作用。至今，miR-214在MM發(fā)生進(jìn)展中的作用機(jī)制尚不明確。本研究我們通過RT-qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-214 在IM-9、U266、Lp-1、H929 細(xì)胞中的表達(dá)低于正常漿細(xì)胞，提示miR-214在MM 發(fā)生進(jìn)展中可能起抑癌基因作用。抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡是目前分子靶向治療惡性腫瘤的重要研究方向。為了觀察miR-214 基因表達(dá)變化對(duì)MM 細(xì)胞腫瘤學(xué)生物特性的影響，本研究選擇miR-214 表達(dá)最低的U266 細(xì)胞株作為研究對(duì)象，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-214 模擬物進(jìn)入U(xiǎn)266 細(xì)胞的方法，提高了U266 細(xì)胞中miR-214 的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后，通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的集落形成能力、細(xì)胞增殖活性和凋亡率，結(jié)果顯示提高miR-214 表達(dá)后的U266 細(xì)胞，集落形成能力明顯下降，增殖活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，并且細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期，提示上調(diào)miR-214能抑制MM細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)其凋亡。

FOXM1 是Forkhead 蛋白家族中的重要成員之一，屬于致癌轉(zhuǎn)錄因子，目前研究已證實(shí)FOXM1 在多種腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，參與PI3K/AKT、AKT/SNAIL 等多個(gè)重要分子信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［16］。研究證實(shí)，上調(diào)FOXM1基因表達(dá)能促進(jìn)MM細(xì)胞生長(zhǎng)、存活及克隆形成能力，下調(diào)FOXM1基因表達(dá)則能起到相反作用［17-18］。近期在miR-214 下游分子通路的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-214 通過FOXM1 調(diào)控多種惡性腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)表型［19-20］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，提高miR-214 表達(dá)后的U266 細(xì)胞FOXM1 蛋白表達(dá)明顯升高，提示上調(diào)miR-214 可能通過抑制MM 細(xì)胞FOXM1表達(dá)從而抑制瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并促進(jìn)其凋亡。

綜述所述，MM 細(xì)胞中miR-214 呈低表達(dá)，上調(diào)miR-214可抑制MM細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，其機(jī)制可能是通過抑制FOXM1基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。