青蒿素及其衍生物對(duì)細(xì)胞自噬調(diào)控的研究進(jìn)展

鄧海蓮，吳月瑩，沙文月，羅金花，楊宇，馮德輝

1 廣東醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 湛江 524000；2 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科

青蒿素（ART）及其衍生物除具有抗瘧疾作用外，還能抑制腫瘤細(xì)胞生長、分裂、遷移［1］。另外，它們還具有抗纖維化、抗病毒、消除炎癥等作用［2-3］。ART 及其衍生物具有共同的基團(tuán)：含有過氧化橋的倍半萜內(nèi)酯，因此具有相似的藥理特性，包括下調(diào)氧化應(yīng)激［4］、免疫抑制［5］、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］、調(diào)控細(xì)胞自噬［7］等。現(xiàn)就ART及其衍生物調(diào)控自噬治療疾病的研究進(jìn)展及相關(guān)信號(hào)通路綜述如下。

1 青蒿素及其衍生物與自噬的關(guān)系

我國古代醫(yī)者在古籍中曾提及“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之”治療瘧疾。“青蒿”是蒿科草本植物，具有涼血解毒、消除骨熱、避暑、防止瘧疾復(fù)發(fā)和消除黃疸的功效［8］。蒿科草本植物是我國民間俗稱的“甜艾草”，亦是傳統(tǒng)中藥常用的一味藥材，而ART 便是從蒿科草本植物中分離得到。因ART 溶解性差、生物利用度低，雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚等衍生物相繼問世。目前ART 及其衍生物是應(yīng)用最廣泛、認(rèn)可度最高的抗瘧疾藥物，它們具有共同的基團(tuán)：含有過氧化橋的倍半萜內(nèi)酯，決定了它們具有相似的作用機(jī)制。過氧化橋在ART 及其衍生物發(fā)揮抗瘧疾作用過程中至關(guān)重要［9］。近年來，ART及其衍生物被發(fā)現(xiàn)除了具有抗瘧疾作用外，還能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和分化［1］，并且與細(xì)胞周期阻滯、氧化應(yīng)激［4］、細(xì)胞凋亡和自噬［7］等機(jī)制相關(guān)。

20世紀(jì)50年代，首次在酵母中發(fā)現(xiàn)了自噬體和自噬現(xiàn)象［10］，電鏡下觀察到胞質(zhì)內(nèi)自噬體的形成是一個(gè)連續(xù)性過程。自噬被激活后，首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)隔離膜；隨后延伸雙層膜結(jié)構(gòu)包裹受損的蛋白質(zhì)或者細(xì)胞器，形成成熟自噬體，在一系列自噬蛋白協(xié)助下轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體；接著雙層膜結(jié)構(gòu)與溶酶體膜相融合，包裹的蛋白質(zhì)或者細(xì)胞器釋放入溶酶體，被溶酶體酶降解，完成自噬過程。根據(jù)降解的底物不同，自噬可分為非選擇性自噬和選擇性自噬，非選擇性自噬主要在饑餓環(huán)境下被激活，降解受損物質(zhì)，形成代謝循環(huán)利用環(huán)，為細(xì)胞提供營養(yǎng)和能量；而非選擇性自噬主要與保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)，根據(jù)作用的對(duì)象不同，可分為線粒體自噬、過氧化物酶自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體自噬等。同時(shí)，自噬也被認(rèn)為是一種Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，過度的自噬不僅不能保護(hù)細(xì)胞，反而會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自噬對(duì)機(jī)體的雙刃劍作用讓其在人類腫瘤及代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，ART 及其衍生物除了抑制腫瘤細(xì)胞生長繁殖外［7］，還能通過調(diào)控自噬增加耐放化療腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性［11］。此外，ART 及其衍生物通過調(diào)控自噬降解肝硬化的細(xì)胞外基質(zhì)沉積、改善肝細(xì)胞損傷、抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程［3］。相關(guān)研究表明，ART 及其衍生物還能調(diào)控自噬，抑制滑膜的異常細(xì)胞增殖，修復(fù)軟骨細(xì)胞異常表達(dá)，具有改善骨關(guān)節(jié)炎的潛質(zhì)［12］。血管細(xì)胞發(fā)生自噬是血管內(nèi)各類細(xì)胞在缺氧、血流剪切力增強(qiáng)等應(yīng)激環(huán)境下降解受損蛋白質(zhì)、為細(xì)胞提供能量以及修復(fù)受損細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，ART 及其衍生物被發(fā)現(xiàn)能調(diào)控自噬、修復(fù)受損的血管細(xì)胞［13］。同時(shí)，研究表明ART及其衍生物對(duì)腎臟疾病尤其是足細(xì)胞相關(guān)性腎臟疾病，具有一定的治療潛力［14］。總的來說，ART 及其衍生物已批準(zhǔn)用于臨床，其安全性、有效性已經(jīng)在一定程度上得到保證，根據(jù)藥物特性和疾病特點(diǎn)，開發(fā)舊藥新功能一直是有吸引力的命題，因此ART 及其衍生物的臨床應(yīng)用會(huì)受到越來越多的關(guān)注。

2 青蒿素及其衍生物對(duì)自噬調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路

2.1 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路mTOR 是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，ART及其衍生物被發(fā)現(xiàn)能通過調(diào)節(jié)mTOR 表達(dá)調(diào)控自噬，影響生長因子、氧化應(yīng)激因子等分泌，從而調(diào)控能量代謝、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和分解。mTOR 是信號(hào)通路中間站，與自噬調(diào)節(jié)相關(guān)的上游通路包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路和腺苷單磷酸激活的蛋白激酶信號(hào)通路（AMPK）。上游信號(hào)通路激活后促進(jìn)mTOR 磷酸化使其活化，活化的mTOR 誘導(dǎo)下游信號(hào)因子Unc-51 樣自噬激活激酶（Ulk）磷酸化而失活，從而抑制自噬的發(fā)生［15］。

2.1.1 PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路 PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路是一條經(jīng)典的自噬信號(hào)通路，與細(xì)胞的生長代謝、周期調(diào)節(jié)有密切關(guān)系。在營養(yǎng)充足情況下，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活，mTOR活化促使Ulk 637 號(hào)位和757 號(hào)位的絲氨酸（Ser308 和Ser757）磷酸化而失活，進(jìn)而抑制Ulk復(fù)合物的活性，抑制自噬啟動(dòng)。在饑餓或者細(xì)胞應(yīng)激期間，mTOR活性受到抑制，Ulk 特定位點(diǎn)的磷酸化被解除，活化的Ulk 復(fù)合物隨后轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的隔離膜上，啟動(dòng)自噬。研究表明，ART 及其衍生物能影響這條通路的上中下游其中一兩個(gè)環(huán)節(jié)從而調(diào)控自噬。LIU等［13］在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，雙氫青蒿素組微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3-Ⅱ）表達(dá)水平更高，Akt、mTOR、核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）磷酸化水平更低。通過siRNA 干擾沉默自噬相關(guān)蛋白ATG5 能減弱雙氫青蒿素組LC3-Ⅱ水平的高值，而使用mTOR 抑制劑雷帕霉素預(yù)處理后，雙氫青蒿素組未出現(xiàn)LC3-Ⅱ表達(dá)進(jìn)一步升高，上述結(jié)果表明Akt/mTOR 通路活性下調(diào)是雙氫青蒿素誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬的機(jī)制。姜廣利等［16］將宮頸癌HeLa 細(xì)胞作為研究對(duì)象，隨機(jī)設(shè)置對(duì)照組、雙氫青蒿素組、順鉑組及雙氫青蒿素加順鉑組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素加順鉑組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)低，而p-mTOR/mTOR 和 p-Ulk /Ulk 表達(dá)升高，提示雙氫青蒿素可能通過激活mTOR/Ulk 信號(hào)途徑抑制自噬，從而提高宮頸癌的化療敏感性。在順鉑耐藥胃癌細(xì)胞SGC7901/DDP 體外模型中，ZHANG 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素干預(yù)后，使用mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染和透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)自噬增強(qiáng)，蛋白質(zhì)印跡檢測發(fā)現(xiàn)PI3K、Akt 和mTOR 磷酸化水平降低，表明雙氫青蒿素通過PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬，克服了癌細(xì)胞耐藥特性引發(fā)細(xì)胞死亡，可作為治療耐藥性胃癌的潛在藥物。

2.1.2 AMPK/mTOR 信號(hào)通路 AMPK 是一種能量感應(yīng)蛋白，維持能量代謝平衡，當(dāng)機(jī)體AMP/ATP值上調(diào)或者下調(diào)時(shí)，AMPK 啟動(dòng)相關(guān)信號(hào)通路干預(yù)能量流動(dòng)，同時(shí)調(diào)節(jié)能量產(chǎn)生和能量消耗途徑來儲(chǔ)存機(jī)體內(nèi)能量。在能量充足情況下，活化的mTOR除了直接磷酸化Ulk 使其失活外，還能通過破壞AMPK 與Ulk 之間相互作用來阻止Ulk 活化，抑制自噬啟動(dòng)。而能量缺乏時(shí)，AMPK 被激活，活化的AMPK 抑制mTOR 的磷酸化，其對(duì)Ulk 的抑制被解除，啟動(dòng)自噬。DU等［17］探究雙氫青蒿素干預(yù)白血病細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)中觀察到，雙氫青蒿素能上調(diào)LC3-Ⅱ、ATG5、ATG7、Beclin1等自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，同時(shí)p-AMPK/AMPK 表達(dá)水平升高，而mTOR 磷酸化被抑制，下游蛋白p70S6K 表達(dá)增加，表明雙氫青蒿素通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR 信號(hào)通路激活自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在此基礎(chǔ)上，敲除ATG7 基因或者使用自噬抑制劑（3-MA 或BafA1）后，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)明顯下降，自噬被抑制，雙氫青蒿素對(duì)白血病細(xì)胞株的毒性變小，而使用雷帕霉素對(duì)mTOR 活性抑制后加劇了雙氫青蒿素激發(fā)的細(xì)胞死亡。此外，研究還發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素誘導(dǎo)的自噬能增加細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白及過氧化物表達(dá)，誘導(dǎo)缺鐵性貧血，導(dǎo)致白血病細(xì)胞株死亡，表明雙氫青蒿素可能是治療白血病的有效藥物。

2.2 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路MAPK 是一組真核保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過調(diào)節(jié)自噬參與細(xì)胞分化、增殖等生理活動(dòng)，與自噬相關(guān)的亞基主要包括c-jun N 端激酶（JNK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）及p38 三種亞基。MAPK 亞基調(diào)節(jié)自噬的機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，有時(shí)甚至截然相反，尤其是在ATR 及其衍生物等藥物特定的處理?xiàng)l件下如何精細(xì)調(diào)控細(xì)胞自噬仍未被闡明。研究表明，MAPK/JNK激活后可以促使Bcl-2家族蛋白磷酸化，從而將Beclin1 從復(fù)合體中游離出來，與自噬相關(guān)蛋白Vps34結(jié)合，促進(jìn)自噬體成核，同時(shí)JNK 還可以直接激活相關(guān)自噬基因ATG 促進(jìn)自噬。JIA等［18］在研究雙氫青蒿素對(duì)胰腺癌細(xì)胞株作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，雙氫青蒿素組LC3-Ⅱ、JNK、Beclin1表達(dá)增強(qiáng)，mTOR 表達(dá)減弱，使用JNK 抑制劑或者siRNA 干擾沉默JNK 后，雙氫青蒿素組Beclin1 水平下調(diào)，自噬表達(dá)減弱，細(xì)胞死亡率升高，表明雙氫青蒿素通過MAPK/JNK 信號(hào)通路誘導(dǎo)了胰腺癌細(xì)胞株發(fā)生保護(hù)性自噬，抑制JNK 表達(dá)有可能增強(qiáng)雙氫青蒿素的治療功效，JNK 基因沉默有可能成為治療胰腺癌的手段。然而，YAO 等［19］發(fā)現(xiàn)MAPK/JNK 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)雙氫青蒿素衍生物L(fēng)-A03誘導(dǎo)人乳腺癌癥細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)起著相反的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，處理乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 時(shí)，L-A03 組自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達(dá)增強(qiáng)，但JNK磷酸化水平降低，而使用JNK 特異性抑制劑SP600125 后，L-A03 組自噬表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，乳腺癌細(xì)胞株死亡率更高，類似的結(jié)果在另外一種乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中得到印證，表明雙氫青蒿素衍生物L(fēng)-A03 誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬可能與MAPK/JNK 信號(hào)通路受抑制相關(guān)，JNK 基因失活有可能成為治療乳腺癌的靶點(diǎn)。MAPK/JNK 信號(hào)通路在自噬調(diào)節(jié)中極其復(fù)雜，有時(shí)甚至互相矛盾，這一現(xiàn)象在其他研究中亦有體現(xiàn)［20］，考慮與藥物激活其他的細(xì)胞活動(dòng)如凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激等間接影響了自噬調(diào)節(jié)的方向有關(guān)，仍需設(shè)計(jì)更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確其中機(jī)制。LIU 等［21］采用雙氫青蒿素另外一種衍生物DHA-37 處理非小細(xì)胞肺癌體外模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，DHA-37 組自噬表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)ERK1/2、p38 以及高遷移率族蛋白B1（HMGB1）表達(dá)明顯升高，而JNK1表達(dá)和對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用ERK1/2 抑制劑PD98059 逆轉(zhuǎn)了LC3-Ⅱ/LC3-I 上調(diào)，并阻止了DHA-37 誘導(dǎo)的HMGB1 增加，阻止了DHA-37誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而使用p38抑制劑SB203580 也出現(xiàn)了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明DHA-37誘導(dǎo)的自噬增強(qiáng)導(dǎo)致肺癌細(xì)胞株死亡可能與MAPK/ERK和p38信號(hào)通路相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)還設(shè)計(jì)了肺癌異種移植裸鼠體內(nèi)模型，發(fā)現(xiàn)p-ERK、p-p38、HMGB1、LC3-Ⅱ水平升高，進(jìn)一步印證了上述結(jié)論。上述研究表明，MAPK 信號(hào)通路在ART 及其衍生物調(diào)控自噬治療相關(guān)疾病的發(fā)展過程中起著舉足輕重的作用。

2.3 活性氧（ROS）信號(hào)通路 ROS 是一組化學(xué)性質(zhì)活潑、氧化性強(qiáng)的物質(zhì)，包括羥自由基、雙氧水、超氧陰離子、一氧化氮等。體內(nèi)的ROS 水平往往維持在極低狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥、凋亡、自噬等。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在ART及其衍生物實(shí)驗(yàn)中，ROS能通過多種細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控自噬，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡或自噬性保護(hù)，同時(shí)自噬亦能逆反饋調(diào)節(jié)ROS 水平。DU 等［22］在食管癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。MA 等［23］在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了其中機(jī)制，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平明顯上調(diào)，而使用抗氧化劑NAC 阻斷ROS 后，觀察到雙氫青蒿素組自噬水平較前明顯下降，細(xì)胞活性抑制明顯減弱。HU 等［24］通過對(duì)骨髓瘤、白血病、直腸癌、宮頸癌等多種細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素通過抑制各細(xì)胞株鐵蛋白重鏈（FHC）和錳超氧化物歧化酶（MnSOD）表達(dá)，引起ROS 累積，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑阻斷ROS 可抑制雙氫青蒿素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。上述研究表明，雙氫青蒿素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬可能與ROS水平相關(guān)。SHEN等［25］研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，對(duì)骨肉瘤有潛在治療價(jià)值，其作用機(jī)制主要與鐵依賴的ROS水平上調(diào)、激活上游自噬過程、阻斷后期自噬降解相關(guān)。

2.4 核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路 NF-κB 是一組調(diào)控細(xì)胞分化、增殖的轉(zhuǎn)錄因子家族，主要有Rel-A（p65）、Rel-B、c-Rel（Rel）、NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）等5 種亞型。一般情況下，NF-κB 的轉(zhuǎn)錄并不活躍，其與IκB 家族抑制蛋白結(jié)合形成無活性復(fù)合體，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，IκB發(fā)生磷酸化，NF-κB被激活，向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，NF-κB活化，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游因子。NF-κB 參與了細(xì)胞凋亡、壞死、炎癥、自噬等過程。研究發(fā)現(xiàn)自噬與NF-κB 信號(hào)通路有相互交叉作用，NF-κB信號(hào)通路受抑制，自噬激活，機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)或者損傷作用，反之亦然。HU 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素通過抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位來調(diào)控各種癌細(xì)胞株發(fā)生自噬。許浩等［26］在宮頸癌細(xì)胞株體外模型中觀察發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，雙氫青蒿素組自噬表達(dá)增強(qiáng)、NF-κB表達(dá)被抑制，并且細(xì)胞增殖抑制明顯，雙氫青蒿素誘導(dǎo)自噬抑制宮頸癌細(xì)胞株活性的機(jī)制有可能與阻斷NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)，但該實(shí)驗(yàn)并未設(shè)計(jì)NF-κB 通路激活劑或抑制劑進(jìn)一步印證。JIANG等［12］將軟骨細(xì)胞作為研究對(duì)象，隨機(jī)設(shè)置對(duì)照組、腫瘤壞死因子（TNF-α）組、雙氫青蒿素組和TNF-α+雙氫青蒿素組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α+雙氫青蒿素組自噬水平較雙氫青蒿素組明顯升高，此外TNF-α 組p65 表達(dá)增強(qiáng)并且出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位、IκB 表達(dá)降低，但用雙氫青蒿素預(yù)處理后降低了p65 表達(dá)，并且誘導(dǎo)了軟骨細(xì)胞中IκB 的積累，說明雙氫青蒿素抑制了TNF-α 刺激的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)。該實(shí)驗(yàn)還使用了NF-κB抑制劑SM7368，觀察到IκB的表達(dá)增強(qiáng)，NF-κB途徑受到抑制，但軟骨細(xì)胞中LC3-Ⅱ水平升高，驗(yàn)證了NF-κB通路在雙氫青蒿素誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生自噬的作用。LI 等［27］研究卵巢癌細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯和雙氫青蒿素誘導(dǎo)的自噬可能抑制了卵巢癌細(xì)胞系的NF-κB信號(hào)通路。相關(guān)研究表明，NF-κB 信號(hào)通路影響mTOR 蛋白的磷酸化從而調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬［28］，但并未有研究直接表明ART 及其衍生物處理時(shí)，NF-κB 信號(hào)通路能調(diào)節(jié)mTOR蛋白的磷酸化。

綜上所述，青蒿素及其衍生物可通過mTOR、MAPK、ROS、NF-κB等信號(hào)通路調(diào)控自噬，對(duì)多種疾病起到緩解作用。