安羅替尼對人胃癌細胞遷移、侵襲的影響及機制

鄧雙年，李娟，李輝

1 臨汾市人民醫(yī)院腫瘤科，山西 臨汾 041000；2 臨汾市人民醫(yī)院消化科；3 臨汾市人民醫(yī)院胸外科

胃癌發(fā)病隱匿，早期臨床癥狀不明顯，確診時多進展為晚期。該病通常以手術治療為主，但術后腫瘤仍有較高復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，預后極差，對患者的生活質(zhì)量影響較大［1］。安羅替尼是一種口服多靶點酪氨酸激酶抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)，其可通過多種與腫瘤細胞生長相關的信號通路實現(xiàn)對腫瘤細胞的直接抑制，同時安羅替尼還具有抗腫瘤血管生成的作用［2-4］。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）/Smads 信號通路與腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等生理過程密切相關［5］。研究表明Smad7 可抑制TGF-β1對Smad3 的磷酸化，對TGF-β1/Smad 信號通路起負反饋調(diào)節(jié)作用［6］。目前安羅替尼通過TGF-β1/Smads信號通路作用胃癌的機制尚不完全明確。2020 年5月—2022 年5 月，我們探討了安羅替尼對胃癌細胞AGS遷移和侵襲的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌AGS 細胞，購自上海中科院細胞庫。安羅替尼（貨號：S8726，美國Selleckchem 公司），TGF-β1/Smads 通路抑制劑LY2109761（貨號：S49933，上海源葉生物科技有限公司），胎牛血清（貨號：110.11-8611，上海四季青生物科技有限公司），RPMI 1640 培養(yǎng)基（貨號：C11875500BT，美國Gibco公司），RIPA 裂解液（貨號：P0013B，上海碧云天生物科技有限公司），活細胞計數(shù)（CCK-8）試劑盒（貨號：A311-01，南京諾唯贊生物科技有限公司），鼠抗人［TGF-β1（貨號：MAB1835，美國RD 公司）、p-Smad3（貨號：HK3086，美國CST 公司），Smad3、Smad7、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纖維黏連蛋白（FN）及β-actin 一抗（貨號分別為66516、66478、60335-1、66219-1、60330-1、66042-1，武漢三鷹生物科技有限公司）］、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG（二抗）（貨號：SA00001-1，武漢三鷹生物科技有限公司）。二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO18AIC，日本三洋電機公司），倒置熒光顯微鏡（MF52-N，廣州市明美光電技術有限公司），酶標儀（IMARK，美國BIO-RAD 公司），凝膠成像系統(tǒng)（FluorChem HD2，美國Proteinsimple公司）等。

1.2 人胃癌AGS 細胞培養(yǎng)與傳代 于液氮中取胃癌AGS凍存細胞進行復蘇后，37 ℃、5% CO2條件下在RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞貼壁至80%～90%時進行細胞傳代，取第3代對數(shù)生長期AGS細胞。

1.3 細胞分組及干預 將細胞分為對照組、實驗組和抑制劑組，對照組細胞不干預，實驗組（2 μmol/L安羅替尼組、4 μmol/L 安羅替尼組、8 μmol/L 安羅替尼組）分別給予2、4、8 μmol/L 安羅替尼。本研究中從4 μmol/L 安羅替尼組開始細胞活力與對照組相比降低，為避免細胞死亡太多干擾實驗，抑制劑組選擇在4 μmol/L 安羅替尼基礎上加入10 μmol/L TGF-β1/Smads 通路抑制劑LY2109761 進行干預，每組設3個復孔，后置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.4 人胃癌AGS 細胞活力的測定 采用CCK-8法。細胞分組與給藥方法同1.3，收集對數(shù)期生長細胞，調(diào)整密度至2×105/mL，將其接種到96孔板中，每孔加細胞懸液100 μL，實驗重復3 次。各組干預24 h 后，加入CCK-8 溶液10 μL 孵育2 h 后，使用酶標儀測定各組OD 值（450 nm），每組檢測3次。細胞活力（%）=OD（實驗組或抑制劑組-空白組）/OD（對照組-空白組）×100%。

1.5 人胃癌AGS 細胞形態(tài)觀察 細胞分組與給藥方法同1.3，取各組干預24 h 的AGS 細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照記錄。

1.6 人胃癌AGS 細胞的遷移和侵襲能力測定 采用Transwell 小室法。細胞分組與給藥方法同1.3，取Transwell 小室，在上室中加入無血清細胞懸液0.25 mL，調(diào)整密度為1×105/mL，下室加入0.45 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。24 h后，棄上清，PBS清洗3 次，用4%甲醇固定30 min 后進行晾干處理，0.1%結晶紫染色10 min，PBS清洗3次，在細胞侵襲能力分析實驗時，小室用基質(zhì)膠預處理，其他步驟相同。將Transwell小室倒置于顯微鏡上，每孔隨機選5個不同區(qū)域，用顯微鏡觀察拍照。每孔隨機選5 個不同區(qū)域。Image J圖像分析軟件計算遷移或侵襲細胞數(shù)。

1.7 人胃癌AGS 細胞中EMT 和TGF-β1/Smads 信號通路相關蛋白表達檢測 采用Western blotting法。細胞分組與給藥方法同1.3，干預24 h 時，收集各組細胞，提取蛋白后定量，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h 后參照抗體說明書加入一定稀釋比例的一抗（TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Smad7、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、FN 及β-actin），4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗滌后加入山羊抗鼠IgG 二抗，孵育2 h，洗滌3 次，最后加入顯影液，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。蛋白灰度值用G 表示，蛋白相對表達量=G目的蛋白/G內(nèi)參蛋白（β-actin）。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Tukey 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組人胃癌AGS 細胞活力比較 干預24 h后，對照組、2 μmol/L 安羅替尼組、4 μmol/L 安羅替尼組、8 μmol/L 安羅替尼組、抑制劑組細胞活力分別為1.00 ± 0.07、0.89 ± 0.04、0.76 ± 0.06、0.60 ±0.08、0.52 ± 0.02。與對照組相比，2 μmol/L安羅替尼組AGS 細胞活力差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；4、8 μmol/L 安羅替尼組細胞活力降低，呈劑量依賴性（P均＜0.05）。本研究中4、8 μmol/L 安羅替尼組細胞活力與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），為避免細胞死亡太多干擾實驗，后續(xù)實驗中選取安羅替尼4 μmol/L作為最適濃度加入10 μmol/L TGF-β1/Smads 通路抑制劑LY2109761 作為抑制劑組進行干預。與4 μmol/L 安羅替尼組相比，抑制劑組細胞活力降低（P＜0.05）。

2.2 各組人胃癌AGS 細胞生長情況 人胃癌AGS細胞處理24 h后，對照組細胞生長狀態(tài)良好，實驗組和抑制劑組細胞生長受到抑制，貼壁能力下降，細胞數(shù)量明顯減少，形狀變?yōu)椴灰?guī)則狀態(tài)且細胞碎片增多。見圖1。

圖1 各組AGS細胞生長情況

2.3 各組人胃癌AGS 細胞遷移能力比較 干預24h 后，對照組、2 μmol/L 安羅替尼組、4 μmol/L 安羅替尼組、8 μmol/L 安羅替尼組、抑制劑組細胞遷移數(shù)分別為（220.67 ± 27.50）、（166.67 ± 15.01）、（110.33 ± 16.62）、（88.33 ± 16.04）、（28.33 ±7.02）個。與對照組相比，實驗組遷移細胞數(shù)明顯減少。與對照組相比，實驗組細胞遷移數(shù)降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與4 μmol/L 安羅替尼組相比，抑制劑組細胞遷移數(shù)進一步降低（P＜0.05）。

2.4 各組人胃癌AGS細胞侵襲能力比較 干預24 h后，對照組、2 μmol/L 安羅替尼組、4 μmol/L 安羅替尼組、8 μmol/L 安羅替尼組、抑制劑組細胞侵襲數(shù)分別為（215.00 ± 26.51）、（160.00 ± 18.52）、（107.33 ± 17.04）、（87.33 ± 9.45）、（26.33 ± 6.66）個，與對照組相比，實驗組侵襲細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。與對照組相比，實驗組侵襲數(shù)降低（P＜0.05），呈劑量依賴性；與4 μmol/L 安羅替尼組相比，抑制劑組細胞侵襲數(shù)進一步降低（P＜0.05）。

2.5 各組人胃癌AGS 細胞中EMT 相關因子蛋白表達比較 見表1。

表1 各組AGS細胞中EMT相關因子蛋白表達比較（± s）

表1 各組AGS細胞中EMT相關因子蛋白表達比較（± s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與4 μmol/L安羅替尼組相比，#P＜0.05。

組別對照組2 μmol/L安羅替尼組4 μmol/L安羅替尼組8 μmol/L安羅替尼組抑制劑組E-cadherin 0.30 ± 0.01 0.80 ± 0.02*1.20 ± 0.07*1.40 ± 0.03*1.42 ± 0.05#N-cadherin 1.50 ± 0.04 1.20 ± 0.07*1.12 ± 0.05*0.81 ± 0.03*0.70 ± 0.01#Vimentin 1.33 ± 0.05 1.20 ± 0.04*1.10 ± 0.05*0.51 ± 0.03*0.10 ± 0.01#FN 0.90 ± 0.02 0.50 ± 0.03*0.40 ± 0.02*0.20 ± 0.01*0.05 ± 0.01#

2.6 各組人胃癌AGS細胞中TGF-β1/Smads信號通路蛋白表達比較 見表2。

表2 各組AGS細胞中TGF-β1/Smads信號通路蛋白表達比較（± s）

表2 各組AGS細胞中TGF-β1/Smads信號通路蛋白表達比較（± s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與4 μmol/L安羅替尼組相比，#P＜0.05。

組別對照組2 μmol/L安羅替尼組4 μmol/L安羅替尼組8 μmol/L安羅替尼組抑制劑組TGF-β1 1.30 ± 0.08 1.10 ± 0.06*0.90 ± 0.07*0.20 ± 0.04*0.10 ± 0.02#Smad3 1.00 ± 0.09 1.01 ± 0.08 1.02 ± 0.05 1.04 ± 0.06 1.03 ± 0.05 p-Smad3 1.20 ± 0.02 1.02 ± 0.07*0.90 ± 0.05*0.35 ± 0.04*0.21 ± 0.04#Smad7 0.91 ± 0.03 1.04 ± 0.07*1.10 ± 0.07*1.31 ± 0.05*1.51 ± 0.06#

3 討論

胃病發(fā)病原因主要有不良飲食習慣與飲食結構、慢性幽門螺旋桿菌感染等［7］。早、中期的胃癌可以通過手術治療加之以放、化療，提高患者生存率，但多半患者就診時已發(fā)展為晚期，通過手術較難根治。研發(fā)更具安全性與療效藥物來抑制癌細胞轉(zhuǎn)移是胃癌治療的熱點和難點［8］。近年來諸多學者對安羅替尼進行的研究表明，其不僅能抑制肺癌細胞生長，對其他腫瘤的生長也同樣發(fā)揮抑制作用［9］。楊斌等［10］對肝內(nèi)膽管上皮腫瘤細胞的研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼對HCCC-9810 細胞具有殺傷作用，可以抑制細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。張元元［11］研究表明安羅替尼治療胃癌的作用及抑制胃癌遷移及侵襲機制可能是由于安羅替尼通過下調(diào)淋巴管生成因子表達的水平發(fā)揮作用。以上研究提示，安羅替尼可調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與癌細胞轉(zhuǎn)移關系密切，可為本實驗的開展提供理論支撐，為治療胃癌開辟一種新的途徑。這些研究提示安羅替尼對胃癌的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用。本研究結果顯示，與對照組相比，4、8 μmol/L安羅替尼組中人胃癌AGS 細胞活力明顯降低，實驗組中經(jīng)不同濃度安羅替尼處理后細胞生長均受到抑制，表明安羅替尼可以抑制人胃癌AGS 細胞的生長。實驗組中人胃癌AGS 細胞遷移和侵襲能力下降，表明安羅替尼可以抑制胃癌細胞的遷移和侵襲。實驗組與對照組相比，E-cadherin 蛋白表達升高，N-cadherin、Vimentin 和FN 蛋白表達降低。提示安羅替尼可抑制胃癌細胞的遷移、侵襲及EMT進程。

TGF-β1/Smads 通路作為經(jīng)典的信號傳導通路，參與多種腫瘤細胞的生長、遷移及侵襲等過程［12］。EMT 的發(fā)生發(fā)展與TGF-β1/Smads 信號通路密切相關。EMT 現(xiàn)象廣泛存在于消化系統(tǒng)腫瘤中，且在癌細胞的浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。TGF-β1/Smads信號通路與胃癌關系較為密切，陳春苗等［13］研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿通過TGF-β/Smad 通路能調(diào)控胃癌細胞的遷移及EMT 進程。魏良煜［14］研究表明，安羅替尼能調(diào)控TGF-β1和EMT相關蛋白Vimentin表達。本研究中4、8 μmol/L 安羅替尼組與對照組相比，細胞活力出現(xiàn)明顯降低趨勢，為避免細胞死亡太多干擾實驗，選取安羅替尼4 μmol/L 作為最適濃度加入10 μmol/L TGF-β1/Smads 通路抑制劑LY2109761 進行TGF-β1/Smads 通路驗證。結果發(fā)現(xiàn)，與4 μmol/L安羅替尼組相比，抑制劑組細胞生長進一步受到抑制，細胞活力、遷移、侵襲能力及TGF-β1、p-Smad3、N-cadherin、Vimentin、FN 蛋白表達降低，E-cadherin和Smad7蛋白表達升高。上述結果表明安羅替尼抑制人胃癌AGS 細胞的遷移、侵襲通過介導TGF-β1/Smads通路信號轉(zhuǎn)導，干預其EMT進程發(fā)揮作用。

綜上所述，安羅替尼可抑制人胃癌AGS 細胞遷移和侵襲，其作用機制與介導TGF-β1/Smads 信號通路進而干預EMT進程有關。