康柏西普結(jié)膜下注射對兔小梁切除術(shù)后濾過通道內(nèi)瘢痕形成的影響

孫中華，劉翠娟，張艷，紀珍，劉偉，王建榮，孫嬿，劉明坤，張苗苗

1 濟南市第二人民醫(yī)院眼科，濟南 250000；2 曹縣人民醫(yī)院藥劑科；3 山東第一醫(yī)科大學(xué)臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

青光眼是一種常見的致盲性眼病，預(yù)測至2040年，全球青光眼患者將達到1.1 億人［1］。目前，小梁切除術(shù)仍是治療青光眼的最常用手術(shù)方法。但術(shù)區(qū)結(jié)膜下成纖維細胞過度增殖、膠原沉積可導(dǎo)致濾過泡瘢痕形成，堵塞濾過通道［2］，是導(dǎo)致小梁切除術(shù)治療失敗的重要原因。小梁切除術(shù)后通常給予絲裂霉素（MMC）、5-氟尿嘧啶（5-FU）來抵抗術(shù)后濾過通道的瘢痕化［3-4］。然而，這兩種藥物與低眼壓、薄壁濾泡形成、晚期濾過泡滲漏、包膜囊性濾泡、眼內(nèi)炎、黃斑水腫等發(fā)生風(fēng)險密切相關(guān)［5］。有研究報道，青光眼濾過手術(shù)失敗患者筋膜組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達顯著升高［6］。VEGF 能夠參與濾過通道中成纖維細胞增殖和新生血管化，并促進瘢痕形成［7］?？蛋匚髌帐俏覈灾餮邪l(fā)的新一代融合蛋白類抗VEGF 藥物，其抗瘢痕效果可能與MMC 類似，還能輔助穩(wěn)定濾過泡形態(tài)和降低術(shù)后眼壓［8］。2021—2023 年，本研究探討了康柏西普對兔小梁切除術(shù)后濾過通道內(nèi)瘢痕形成的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年新西蘭大白兔40 只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購自濟南西嶺角生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK（魯）20200004。所有新西蘭大白兔于濟南市第二人民醫(yī)院動物實驗中心單籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，飼養(yǎng)條件：溫度（22 ±1）℃、濕度（55 ± 5）%，光照12 h/12 h 明暗交替。本研究嚴格遵循《實驗動物管理條例》（2017 修訂版）?？蛋匚髌昭塾米⑸湟?，購自成都康弘生物科技有限公司；注射用絲裂霉素，購自瀚暉制藥有限公司；鹽酸塞拉嗪注射液，購自吉林省華牧動物保健品有限公司；鹽酸丙美卡因滴眼液，購自南京瑞年百斯特制藥有限公司。OPMI Lumera?手術(shù)顯微鏡，購自德國Zeiss公司；SL-2G裂隙燈顯微鏡，購自日本Topcon公司；Eclipse Ci-L 正置顯微鏡、DS-Ri1-U3 數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)，購自日本Nikon 公司；TA01 眼壓計，購自芬蘭iCare公司。Masson三色染色液，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；Dako REALTMEnVisionTMDetection System，購自武漢Agilent公司）。

1.2 動物分組處理 所有新西蘭大白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按隨機數(shù)字表法隨機分為4 組：小梁切除術(shù)中聯(lián)合應(yīng)用絲裂霉素組（A 組）、小梁切除術(shù)畢注射康柏西普組（B 組）、小梁切除術(shù)中聯(lián)合應(yīng)用絲裂霉素并術(shù)畢注射康柏西普組（C 組）、小梁切除術(shù)畢注射生理鹽水組（D 組），每組10 只。充分縮瞳后，鹽酸塞拉嗪0.2 mL/kg 肌內(nèi)注射麻醉。麻醉完全后，于右眼行標準小梁切除術(shù)。A 組術(shù)眼板層鞏膜瓣剝離后，分別于筋膜囊、鞏膜瓣下放置0.4 mg/mL絲裂霉素C棉片2 min，然后生理鹽水徹底沖洗；B組術(shù)畢于術(shù)區(qū)濾過泡旁開約3 mm 處結(jié)膜下注射康柏西普0.05 mL；C 組術(shù)中放置絲裂霉素C 棉片，術(shù)畢注射康柏西普，具體步驟參照A、B組；D 組術(shù)畢于術(shù)區(qū)旁開3 mm 處結(jié)膜下注射生理鹽水0.05 mL。手術(shù)均由同一位經(jīng)驗豐富的眼科醫(yī)師完成。

1.3 眼壓測量 術(shù)前及術(shù)后第1、3、7、14、28 天，鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，采用iCare眼壓計測量眼壓。

1.4 術(shù)眼濾過泡形態(tài)觀察和并發(fā)癥觀察 每天裂隙燈顯微鏡下觀察術(shù)眼濾過泡及其表面血管充血情況，并觀察術(shù)眼有無感染性眼內(nèi)炎、濾過泡滲漏、角膜上皮損傷、虹膜粘連等并發(fā)癥情況。

1.5 術(shù)眼濾過泡組織病理觀察 術(shù)后28 d，采取耳緣靜脈空氣栓塞法處死，迅速剪取濾過泡區(qū)域的結(jié)膜、結(jié)膜下組織及鞏膜、虹膜組織塊，大小約5 mm×5 mm。多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、包埋，5 μm厚連續(xù)切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，氨水返藍，伊紅染色，梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下拍照觀察。每張切片隨機選擇3 個不重疊的200 倍鏡視野，觀察濾過通道組織結(jié)構(gòu)。

1.6 濾過通道組織膠原蛋白沉積和纖維化程度觀察 將上述石蠟切片脫蠟至水，Masson A 液浸泡過夜，Masson B 液與Masson C 液等比混合染液浸染1 min，1%鹽酸乙醇分化，Masson D 液浸染6 min，Masson E液浸染1 min，Masson F液染色2～30 s。切片用1%冰醋酸漂洗分化，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。每張切片在100 倍鏡視野下選取相同視野照相，采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件計算濾過通道內(nèi)新生膠原纖維面積在整個切片中結(jié)膜和鞏膜空間總面積的占比。

1.7 濾過通道組織CD31 表達檢測 取術(shù)眼濾過泡組織，常規(guī)制備石蠟切片。切好經(jīng)60 ℃烤箱烤片3 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，微波加熱抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。山羊血清室溫封閉30 min，滴加經(jīng)稀釋的CD31 一抗，4 ℃濕盒中孵育過夜。次日，滴加HRP 標記的山羊抗兔/小鼠二抗，37 ℃孵育30min。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。采用Eclipse Ci-L 正置顯微鏡選取目標區(qū)域200 倍拍照，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析。每張切片隨機選擇3 個200 倍鏡下視野，計數(shù)CD31 陽性表達的微血管數(shù)量，以3 個視野下CD31 陽性表達微血管數(shù)的平均值作為MVD。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗符合正態(tài)分布，以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組手術(shù)前后眼壓比較 各組眼壓于術(shù)后第3 天降至最低，術(shù)后第7 天逐漸回升，術(shù)后第28 天幾乎完全恢復(fù)至術(shù)前水平，見表1。

表1 各組手術(shù)前后眼壓比較（mmHg，± s）

表1 各組手術(shù)前后眼壓比較（mmHg，± s）

注：與同組術(shù)前比較，*P＜0.05；與同組術(shù)后第1天比較，#P＜0.05；與同組術(shù)后第3天比較，▲P＜0.05；與同組術(shù)后第7天比較，▼P＜0.05；與同組術(shù)后第14天比較，△P＜0.05；與A組同時間比較，▽P＜0.05。

組別A組B組C組D組F P n 10 10 10 10眼壓術(shù)前15.01 ± 1.56 15.27 ± 2.04 14.98 ± 1.45 15.13 ± 2.15 0.052＞0.05術(shù)后第1天12.33 ± 2.21*12.01 ± 1.28*12.54 ± 2.01*11.98 ± 1.84*0.207＞0.05術(shù)后第3天7.79 ± 1.38*#9.77 ± 1.78*#8.24 ± 1.56*#8.76 ± 2.00*#2.519＞0.05術(shù)后第7天8.13 ± 2.00*#10.44 ± 2.19*▽9.21 ± 1.79*#10.17 ± 1.36*3.170＜0.05術(shù)后第14天11.50 ± 2.51*▲▼12.75 ± 1.67*▲11.97 ± 1.82*▲▼12.35 ± 1.58*▲0.765＞0.05術(shù)后第28天15.02 ± 1.86#▲▼△14.99 ± 2.13#▲▼15.19 ± 2.22#▲▼△14.87 ± 2.14#▲▼△0.040＞0.05

2.2 各組術(shù)后濾過泡形態(tài)觀察及其并發(fā)癥情況 術(shù)后第7 天，A、B、C 組術(shù)區(qū)均形成功能性濾過泡，D 組濾泡表面結(jié)膜血管密集，血管化明顯，濾過泡區(qū)域扁平。其中，A 組濾泡高度升高，表面血管稀疏；B 組濾泡彌漫性升高，濾泡表面未見明顯充血；C 組濾泡彌漫性升高，濾泡表面及結(jié)膜表面未見明顯充血。隨著時間延長，至術(shù)后第28 天，各組術(shù)區(qū)結(jié)膜均逐漸充血減輕消退，濾過泡局限、扁平。

各組觀察期間均未發(fā)生明顯角膜上皮損傷相關(guān)并發(fā)癥，A 組術(shù)后第14天發(fā)生濾泡漏致眼內(nèi)炎1例，術(shù)后第28 天發(fā)生薄壁濾泡形成1 例、術(shù)區(qū)前粘連1例，B、C、D組均未發(fā)生明顯并發(fā)癥。

2.3 各組濾過泡組織病理學(xué)和CD31陽性觀察 術(shù)后第28 天，A、B 組術(shù)眼組織病理學(xué)特征相似，均可見疏松的膠原纖維排列及局部增厚的上皮組織，伴有淋巴細胞點狀浸潤；A、C 組均可見到虹膜中較多上皮細胞變性，細胞腫脹，胞質(zhì)空泡化，而B 組未見到此類病理改變。

術(shù)后第28 天，A 組可見濾過通道周圍組織中少量CD31陽性細胞及新生血管增生；B 組可見濾過通道周圍組織中少量CD31 陽性細胞，較少的新生血管增生；C 組亦可見濾過通道周圍組織中少量CD31陽性細胞及新生血管增生，與A 組相似；D 組可見較明顯的濾過通道周圍組織中CD31 陽性細胞及新生血管增生。各組濾過泡組織膠原纖維占比和微血管計數(shù)比較見表2。

表2 各組濾過泡組織膠原纖維占比和微血管計數(shù)比較（± s）

表2 各組濾過泡組織膠原纖維占比和微血管計數(shù)比較（± s）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05。

組別A組B組C組D組F P n 10 10 10 10膠原纖維占比（%）47.26 ± 11.98 33.63 ± 3.45*48.28 ± 2.64#92.92 ± 1.92*#△64.123＜0.05微血管計數(shù)（/HP）12.17 ± 3.20 5.17 ± 1.04*13.13 ± 3.11#14.40 ± 3.42#8.317＜0.05

3 討論

小梁切除術(shù)是目前治療青光眼的主要手術(shù)方式。隨著時間推移，小梁切除術(shù)后濾過通道內(nèi)瘢痕形成和濾過通道過度愈合導(dǎo)致眼壓失控，是導(dǎo)致治療失敗的重要原因。因此，小梁切除術(shù)后通常給予MMC、5-FU 來抵抗術(shù)后濾過通道瘢痕化［3-4］，提高手術(shù)成功率。然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)這些藥物在抑制濾過通道瘢痕化的同時可增加并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險。因此，臨床亟需尋找一種青光眼小梁切除術(shù)后安全、有效的抗瘢痕治療方法。

VEGF 是新生血管形成的關(guān)鍵因素，在傷口炎癥和纖維化的過程中起重要作用。研究表明，青光眼濾過手術(shù)失敗患者筋膜組織VEGF 表達增加［6］。青光眼濾過術(shù)后第3 天術(shù)區(qū)VEGF 表達開始上升，術(shù)后至少7 天內(nèi)保持在一個較高水平，術(shù)后第13 天開始下降，術(shù)后3 周后恢復(fù)正常［9］。抗VEGF 藥物對治療新生血管性青光眼具有較好效果［10］。然而，在探索青光眼濾過手術(shù)后濾過通路內(nèi)抗瘢痕形成中，多數(shù)研究集中在貝伐單抗（BVZ）上。BVZ 是一種重組人源性單克隆抗體，可抑制腫瘤中新生血管形成，其在腫瘤中的應(yīng)用劑量較大，而在眼科中抗新生血管形成的應(yīng)用劑量較小，因而BVZ 并不適合在眼科中應(yīng)用?？蛋匚髌帐且环N抗血管內(nèi)皮生長因子的融合蛋白，具有雙重作用機制，其關(guān)鍵區(qū)域由人VEGFR1的第2個Ig結(jié)構(gòu)域、VEGFR2的第三和第四個Ig結(jié)構(gòu)域以及人IgG1的恒定Fc區(qū)域組成，VEGFR1與VEGF-A、VEGF-B和PIGF結(jié)合，VEGFR2與VEGF-A結(jié)合，從而阻斷VEGF-A、VEGF-B 和PIGF 的所有亞型，能夠有效抑制新生血管形成并促進新生血管消退?？蛋匚髌赵谥委熌挲g相關(guān)性黃斑變性、病理性近視繼發(fā)的脈絡(luò)膜新生血管和糖尿病性黃斑水腫等的有效性和安全性已得到臨床證實。在少數(shù)關(guān)于康柏西普對抗青光眼術(shù)后抗瘢痕形成作用的研究中，僅觀察了其在青光眼患者術(shù)后抗瘢痕治療的有效性［11］。因此，本研究試圖通過建立兔小梁切除手術(shù)模型，從組織病理學(xué)和免疫組化方面探討康柏西普對小梁切除術(shù)中抗瘢痕及抗新生血管形成的有效性和安全性。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組眼壓于術(shù)后第3 天降至最低，術(shù)后第7天逐漸回升，術(shù)后第28天幾乎完全恢復(fù)至術(shù)前水平。但除B 組術(shù)后第7 天外，各組間眼壓比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這是因為本研究為正常眼壓模型，行小梁切除手術(shù)造成的瘢痕化對眼壓波動的影響較小。因此，兔眼眼壓波動不能作為判斷濾過通道瘢痕形成和有效濾過的指標。

在術(shù)眼濾過泡形態(tài)和組織病理方面發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第7 天，除D 組外，其他三組術(shù)區(qū)均形成良好的彌漫性隆起濾泡組織且表面血管稀疏。隨著時間延長，至術(shù)后第28 天，各組術(shù)區(qū)結(jié)膜均逐漸充血減輕消退，濾過泡局限、扁平，表明瘢痕逐漸形成。術(shù)后第28 天，A、B 組術(shù)眼組織病理學(xué)特征相似，均出現(xiàn)局部上皮增厚，輕度基質(zhì)水腫，膠原纖維排列松散，少量淋巴細胞點狀浸潤；A、C 組均可見到虹膜中較多上皮細胞變性，細胞腫脹，胞質(zhì)空泡化，而B 組未見到此類病理改變。提示絲裂霉素、康柏西普聯(lián)合抑制濾過通道瘢痕形成和新生血管形成。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第28 天，A、B、C 組濾過通道膠原纖維占比均低于D組，并且B組濾過通道膠原纖維占比低于A、C組；B組濾過通道組織中微血管數(shù)目明顯低于A、C、D 組。進一步證實，康柏西普能夠抑制濾過通道纖維化、阻止新生血管和瘢痕形成，與以往研究［11-12］報道一致。雖然康柏西普顯示出類似抗代謝藥物的抗纖維化和抗血管化作用，但與絲裂霉素聯(lián)合并沒有觀察到抗瘢痕形成效果優(yōu)于單獨用藥。既往研究同樣發(fā)現(xiàn)，青光眼術(shù)后給予BVZ+5-FU或單獨使用5-FU 治療，在視力、術(shù)后眼壓和抗青光眼藥物的使用方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義［13］。LIANG 等［14］同樣觀察到青光眼術(shù)后第14 天BVZ 注射后濾過通道中膠原纖維沉積和血管化水平低于絲裂霉素治療。因此，抗VEGF 藥物和抗代謝藥物聯(lián)合使用是否能達到“1+1＞2”的抗瘢痕作用仍存在爭議?？勾x藥物的使用是否因增加VEGF 的表達水平將抵消部分抗VEGF 藥物對血管和膠原纖維生產(chǎn)的抑制作用，以及抗VEGF 藥物單獨應(yīng)用是否優(yōu)于抗代謝藥物單獨應(yīng)用或藥物組合應(yīng)用仍需進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，A 組術(shù)后發(fā)生薄壁濾泡形成1 例、術(shù)區(qū)前粘連1 例、濾泡漏致眼內(nèi)炎1 例，B、C、D 組均未發(fā)生明顯并發(fā)癥。病理結(jié)果顯示，B、C 組兔眼虹膜組織均出現(xiàn)上皮細胞變性、細胞腫脹和胞質(zhì)空泡化。結(jié)果提示，抗VEGF 藥物可能具有更高的安全性。與靜脈注射相比，結(jié)膜下給藥途徑引起藥物全身吸收較少，故選擇結(jié)膜下注射作為康柏西普的給藥途徑具有更高的安全性。

綜上所述，康柏西普結(jié)膜下注射能抑制兔小梁切除術(shù)后濾過通道新生血管形成和瘢痕化，輔助維持濾過泡形態(tài)，從而有效提高青光眼小梁切除術(shù)成功率。